劉寶玲，孫巖，張飛，郝青婷，吉夏潔，李潤植，薛金愛*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801)

棉花(Gossypiumhirsutum)是我國主要的纖維經(jīng)濟作物，大量的棉籽也可用于制作食用油和生物燃油等[1]。作為日常食用的重要植物油，棉籽油僅含有限的幾種脂肪酸，即棕櫚 酸 (16∶0)、硬脂酸 (18∶0)、單不飽和油酸 (18∶1Δ9)、多不飽和亞油酸 (18∶2Δ9,12)和亞麻酸(18∶3Δ9,12,15)[2,3]。其中亞油酸含量最高，約為54%，這種脂肪酸含有兩個雙鍵，易氧化，難以長期儲存，而在防氧化加工過程會產(chǎn)生大量反式脂肪酸，對人體健康非常不利，大大降低了棉籽油的食用價值[4]。棕櫚油酸(16∶1Δ9) 是一種重要的稀有單不飽和脂肪酸(ω-7)，具有極為廣泛的應(yīng)用價值。棕櫚油酸可用來生產(chǎn)保健品，降低血液中膽固醇的含量，預(yù)防心腦血管疾病和抑制腫瘤發(fā)生等[5,6]，還可用作工業(yè)1-辛烯的原材料和生物燃油等[7,8]。

然而，這種高附加值的棕櫚油酸在棉籽中含量極低(<1%)，但在貓爪草(DoxanthaunguiscatiL.)[9,10]，澳洲堅果(Macadamiaintegrifolia)[11]和沙棘(HippophaerhamnoidesL.)[12]等野生植物種子中大量積累，含量分別為64%、30%和70%[4]。這些野生植物大多數(shù)僅能在部分地區(qū)生存，種子很小，產(chǎn)量極低,難以被用來大規(guī)模生產(chǎn)高含量棕櫚油酸[13,14]。隨著市場對棕櫚油酸含量需求日益劇增，通過基因工程手段對大田油料作物脂肪酸合成代謝通路進行遺傳修飾，以期提高種子棕櫚油酸的積累量，已成為目前植物油脂代謝領(lǐng)域的熱點話題[15]。

釀酒酵母(Saccharomyeescerevisiae)脂酰CoA-Δ9脫氫酶 (ScCoA-Δ9D)是一種定位于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的膜結(jié)合蛋白酶，其在生物體內(nèi)能夠催化棕櫚酸 (16∶0) 酯酰鏈上第9個碳原子上脫氫產(chǎn)生棕櫚油酸(16∶1Δ9)[16,17]。據(jù)前人報道，一些外源的脂酰-Δ9脫氫酶已被用來提高植物棕櫚油酸含量，盡管產(chǎn)生的棕櫚油酸含量尚低于10%[18]。例如，在亞麻薺種子過量表達ScCoA-Δ9D基因，則使其種子內(nèi)棕櫚油酸(16∶1Δ9)含量升高了約2.7%[14]，轉(zhuǎn)ScCoA-Δ9D基因的煙草中棕櫚油酸的含量也高于野生型[19]。棉花種子含有約25%的16∶0, 是大田油料作物中最高的[3]。因此，將對16∶0有較高特異性的ScCoA-Δ9D轉(zhuǎn)入陸地棉種子，不存在該酶底物不足的限制因素。

為此，本試驗以幾乎不含棕櫚油酸等ω-7脂肪酸的棉花為試驗材料，利用農(nóng)桿菌將含有釀酒酵母ScCoA-Δ9D基因的種子特異性表達載體轉(zhuǎn)入陸地棉種子中，期望將棉籽內(nèi)更多的棕櫚酸(C16∶0)轉(zhuǎn)化為棕櫚油酸(C16∶1Δ9)，減少C16∶0流向亞油酸(C18∶2)途徑，從而從源頭上改變其脂肪酸成分, 改良棉籽油的營養(yǎng)及工業(yè)用品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用材料為陸地棉WC種子，由山西省農(nóng)科院棉花研究所資源室提供。大腸桿菌DH5α，GV3101農(nóng)桿菌均為本實驗室保存。引物和測序工作由金唯智生物科技有限公司完成。pCAMBIA1303-ScCoA-Δ9D表達載體和帶紅色熒光蛋白的大豆種子特異性載體(pJC-DsRed)均由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所實驗室保存。測序和引物合成由寶生物工程(大連)有限公司完成。BamHI內(nèi)切酶和T4連接酶購于NEB公司。

1.2 ScCoA-Δ9D基因的亞克隆及其種子特異性表達載體的構(gòu)建

本試驗在ScCoA-Δ9D基因的起始密碼子和終止密碼子兩端設(shè)計一對特異擴增引物F：5'-CGggatccACCACGCCTCAGGTTCTC-3'和R：5'-CGggatccAAGCACAACCGAAGATAG-3'，斜體部分為BamHI酶切位點，加粗字母為保護堿基，擴增的表達盒總長度為1 533 bp。以pCAMBIA1303-ScCoA-Δ9D為模板進行高保真PCR擴增，程序為94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60℃40 s，72℃40 s，30 個循環(huán)；72℃10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后割膠回收，然后利用BamHI同時酶切ScCoA-Δ9D基因和pJC-DsRed質(zhì)粒，酶切體系(NEB公司)為：Cutsmart Buffer 5 μL，BamHI 1 μL，pJC-DsRed質(zhì)粒 4 μL，ScCoA-Δ9D擴增產(chǎn)物6 μL，然后加ddH2O補足至50 μL，酶切3 h后得到酶切產(chǎn)物。酶連接體系為：Buffer 2 μL，ScCoA-Δ9D產(chǎn)物為15 μL，pJC-DsRed質(zhì)粒為 2 μL，T4連接酶為1 μL，總體積為20 μL，然后經(jīng)過16 ℃過夜連接，得到酶連接產(chǎn)物，經(jīng)轉(zhuǎn)化和PCR分子鑒定，得到陽性DH5α菌并提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101。

1.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的棉花遺傳轉(zhuǎn)化

1.3.1 棉花無菌苗的培養(yǎng)

選取籽粒飽滿的WC種子，70%酒精清洗10 s，經(jīng)過10% 的H2O2浸泡2 h后，用無菌水清洗3～5遍，并浸泡于無菌水中24 h直至種子露白。然后剝離種皮后，種植于1/2 MS培養(yǎng)基，置于25 ℃中，黑暗培養(yǎng)3 d，然后3 000 lx光照培養(yǎng)4 d[20]。

1.3.2 侵染及共培養(yǎng)

將成功轉(zhuǎn)入二元表達載體的農(nóng)桿菌GV3101，在含50 mg·L-1利福平和50 mg·L-1卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中28 ℃，200 r·min-1，振蕩培養(yǎng)至OD600=0.5左右，然后8 000 r·min-1離心5 min，棄上清，用等體積的1/2 MS液體培養(yǎng)基重懸。取培養(yǎng)一周的棉花幼苗下胚軸，切成1 cm長的莖段，用農(nóng)桿菌液浸泡10 min后用濾紙吸干菌液，放入新的共培養(yǎng)基上共培養(yǎng)2d[20,21]。

1.3.3 植株誘導(dǎo)再生

將上述共培養(yǎng)2 d后的莖段重新放置于含抗生素(500 mg·L-1頭孢霉素、50 mg·L-1草氟安膦)和激素(0.05 mg·L-12,4-D和0.1 mg·L-1KT)的篩選培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織，并每隔15 d左右繼代一次。經(jīng)過3～4繼代篩選后，取形態(tài)較好的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到不含任何激素和抗生素的改良MS培養(yǎng)基上分化形成胚性愈傷組織并再生出小植株。然后將再生小苗單獨轉(zhuǎn)移到試管苗培養(yǎng)基中，待其長出3～4片真葉時(圖2G)，在超凈臺中取1～2片提取DNA進行PCR擴增，等陽性植株繼續(xù)長至5～6 cm用于嫁接(圖2H)[20]。本文用

未浸染的無菌苗葉片做陰性對照。

1.4 轉(zhuǎn)基因棉花DNA的提取及ScCoA-Δ9D基因的表達情況

采用改良的CTAB法[16]提取上述轉(zhuǎn)基因棉花幼葉和陰性對照的DNA，進行PCR檢測分析。ScCoA-Δ9D基因擴增PCR引物為1F：5'-TGTATCTTGTTTCATAGTTTGTCCC-3'，1R：5'-CATAAAAACCCATCTCATAAATAAC-3'，擴增片段大約為 501 bp，PCR 程序參考上述參數(shù)。利用艾德萊RNA試劑盒對各轉(zhuǎn)基因事件中的棉花幼葉提取總RNA，經(jīng)過凝膠電泳和核酸檢測合格后，利用TAKARA公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒將1μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以管家基因GhHistone3為內(nèi)參，草銨膦基因(Bar)為轉(zhuǎn)基因?qū)φ?，對ScCoA-Δ9D基因進行qRT-PCR反應(yīng)，其中非轉(zhuǎn)基因棉花葉片作為外對照。反應(yīng)體系為ABM公司(鎮(zhèn)江愛必夢生物科技)Master EvaGreen Mix 為10 μL,正反引物各0.6 μL，cDNA各1 μL，ddH2O為7.8 μL，反應(yīng)程序為95℃10 min；95℃15 s；58℃1 min，72 ℃30 s，40 個循環(huán)。利用2-ΔΔcq法計算相對表達量。各基因引物如下表1。

表1 qRT-PCR相對表達引物Table 1 Primers of relative expression of qRT-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 ScCoA-Δ9D基因的亞克隆與表達載體構(gòu)建

經(jīng)過PCR克隆方法得到1 533 bp的ScCoA-Δ9D為圖3 A所示，利用通過割膠回收、BamHI酶切和T4酶連接反應(yīng)，獲得種子特異性超表達載體pJC-ScCoA-Δ9D-DsRed(圖1C)，圖1 A為ScCoA-Δ9D超表達載體pCAMBIA1303載體的T-DNA區(qū)。圖1B為含種子特異性表達盒的質(zhì)粒pJC-DsRed T-DNA區(qū)。經(jīng)過測序和PCR驗證后，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入GV3101農(nóng)桿菌用于后續(xù)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的棉花遺傳轉(zhuǎn)化實驗。

2.2 轉(zhuǎn)基因再生植株的誘導(dǎo)過程

棉花種子經(jīng)無菌培養(yǎng)、農(nóng)桿菌浸染、共培養(yǎng)(圖2 A)、誘導(dǎo)培養(yǎng)(圖2B，2C)、分化培養(yǎng)(圖2D～2F)等一系列處理后，在誘導(dǎo)培養(yǎng)繼代2～3次(約1個月)后，在切斷兩端各生成一團透明的薄壁愈傷組織，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)取下得愈傷，大約20 d時，愈傷逐漸彭大，并能產(chǎn)生部分葉綠素，使得部分愈傷為淺綠色(圖2D)。然后，更換培養(yǎng)基為分化培養(yǎng)基，開始誘導(dǎo)薄壁組織分化為胚，在繼代2～3次后，部分愈傷(圖2D箭頭所示)形成淡黃色米粒狀致密的球形胚(圖2E箭頭所示)，進而又分化為有明顯生長點且能正常發(fā)育的轉(zhuǎn)基因小苗(圖2F)，待小苗長到4～5片葉，約4～5 cm高時(圖2G),取出瓶中的小苗，在溫室中嫁接到生長健壯的海島棉母體上，經(jīng)過一段時間愈合培養(yǎng)，形成真正的轉(zhuǎn)基因棉花(圖2H)，經(jīng)過這樣嫁接的小苗存活率一般能達到90%。

圖1 種子特異性ScCoA-Δ9D超表達載體構(gòu)建圖Fig.1 Recombination of overexpression vector of ScCoA-Δ9D gene

圖2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的棉花遺傳轉(zhuǎn)化流程Fig.2 Cotton genetic transformation process with Agrobacterium-mediated method

2.3 陽性幼苗ScCoA-Δ9D基因的PCR檢測和表達分析

本試驗隨機挑選18株經(jīng)過抗生素篩選的陽性T0代轉(zhuǎn)基因幼苗(圖3B：1～18號)分別進行目的基因檢測。結(jié)果表明：將近99%的再生苗能夠擴增出501 bp大小的目的基因片段，只是擴增條帶的強弱不同，表明擴增效率各不相同，這些片段大小與含上述表達載體的陽性質(zhì)粒擴增片段(圖3B“+”)大小一致，而在非轉(zhuǎn)基因棉花的下胚軸中均未擴增出目的片段(圖3B，“CK”)，表明已經(jīng)成功獲得不同轉(zhuǎn)化事件的轉(zhuǎn)基因棉花株系。

對上述陽性幼苗作表達分析(圖4)，發(fā)現(xiàn)棉花葉片中該基因與草銨膦基因(Bar)相比，表達量很低，這可能是啟動子類型不同造成的，驅(qū)動Bar基因表達的啟動子為CaMV35S，而驅(qū)動ScCoA-Δ9D基因表達的是大豆種子特異性啟動子。另外，該基因在非轉(zhuǎn)基因棉花無任何表達，這表明，該基因不僅成功轉(zhuǎn)入棉花中而且也能在葉片中有所表達。研究表明，這類型組織特異性啟動子驅(qū)動下的基因僅在相應(yīng)組織中是高量表達的[22]，Cahoon等在亞麻薺中使用該類型啟動子特異性分別同時驅(qū)動突變型Δ9-16∶0-ACP和Δ9-16∶0-CoA基因，結(jié)果使種子內(nèi)包括棕櫚油酸在內(nèi)的ω-7脂肪酸含量從1.4%提高到約23%[14]；王丕武等從大豆中分別克隆了種子、種皮和根特異性啟動子，通過表達和GUS染色分析，表明這些組織特異性啟動子均驅(qū)動基因在這些組織中高表達，且均比CaMV35S啟動子驅(qū)動下的表達量低，而在葉，花等其他組織中表達均很弱[23]。

圖3 ScScCoA-Δ9D基因亞克隆片段及陽性幼苗PCR檢測圖Fig.3 Subcloning fragment of ScScCoA-Δ9D gene and PCR detection for positive seedlings 注：A：1%瓊脂糖凝膠電泳中的ScCoA-Δ9D亞克隆，“M”代表分子量為2 000 bp的Marker，“1”代表目的擴增片段；B：陽性轉(zhuǎn)基因幼苗的PCR鑒定，“1～18”代表轉(zhuǎn)基因棉花幼苗葉片，“CK”代表非轉(zhuǎn)基因棉花下胚軸，“+”代表陽性pJC-ScCoA-Δ9D-DsRed質(zhì)粒。Note：A: Subcloning of ScCoA-Δ9Dgene in 1% agarose gel electrophoresis,"M"represents marker with a molecular weight of 2 000 bp and "1" represents the target amplified fragment；B:PCR amplification of positive transgenic seedlings. "1-18" represents transgenic cotton seedlings, "CK" represents the hypocotyl of non-transgenic cotton, and "+" represents positive plasmid of GlyP-ScCoA-Δ9D-DsRed.

圖4 轉(zhuǎn)基因棉花ScCoA-Δ9D基因的表達情況Fig.4 The expression pattern of ScCoA-Δ9D in transgenic cotton 注：1～5種為轉(zhuǎn)基因棉花。Note:"1～5"represent transgenic cotton.

3 討論

棕櫚油酸(C16∶1Δ9)是一類珍稀ω-7單不飽和脂肪酸，具有重要的營養(yǎng)和工業(yè)價值。比如，棕櫚油酸能夠修飾細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運系統(tǒng)、提高人體免疫力，還可對老年人中風(fēng)等疾病具有特殊功效[24,25]。而較多的亞油酸則可升高血液中膽固醇的含量, 增加心臟疾病和結(jié)腸癌等各類疾病的發(fā)生率。為提高成品油抗氧化性，在加工過程中經(jīng)常要進行氫化處理，而氫化處理則導(dǎo)致一些反式脂肪酸形成。反式脂肪酸對人體有害，可誘發(fā)各類疾病的發(fā)生率[26]。試驗證明，ScCoA-Δ9脫氫酶是是一種膜結(jié)合蛋白，能特異性識別16∶0-CoA，選擇細(xì)胞質(zhì)膜上的16∶0-CoA為底物，將其催化脫氫形成16∶1-CoA，棉籽內(nèi)含有約25%的棕櫚酸，居于油料作物之首，可為ScCoA-Δ9脫氫酶提供充足的底物[3]。本研究從pCAMBIA1303單基因載體上亞克隆出ScCoA-Δ9D基因，并將其通過連接酶連入大豆種子特異性啟動子驅(qū)動的表達載體中，旨在過量表達外源ScCoA-Δ9D基因，期望將棉籽內(nèi)更多的C16∶0脫氫形成C16∶1Δ9，從而增加棉籽中棕櫚油酸的含量。

目前，通過農(nóng)桿菌浸染棉花下胚軸從而獲得轉(zhuǎn)基因棉花還是最為有效的方法。盡管組培過程較為漫長，但還是能夠在含激素和抗生素培養(yǎng)基上成功誘導(dǎo)受浸染的棉花下胚軸切斷長出抗性愈傷組織，隨后愈傷分化為淡黃色致密的分化胚，最后形成轉(zhuǎn)基因幼苗，經(jīng)PCR基因鑒定，均能確定該基因已經(jīng)整合進入棉花基因組中。通過棉花葉片表達分析表明，該基因在大豆種子特異性啟動子驅(qū)動下的表達量非常低，明顯低于CaMV35S啟動子驅(qū)動下的Bar基因的表達量，這也驗證了組織特異性啟動子驅(qū)動下，基因在相應(yīng)組織中高量表達的情況。這將為后續(xù)轉(zhuǎn)基因棉籽中該基因的表達和脂肪酸成分檢測打下良好的試驗基礎(chǔ)。

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