薛新梅， 魯夢婷， 魏 娜， 林德貴

(1.新疆巴音郭楞蒙古自治州州動物疾病控制與診斷中心 ， 新疆 巴音郭楞 841000； 2.西班牙海博萊生物大藥廠股份公司北京代表處 ， 北京 海淀 100086； 3.中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院 ， 北京 海淀 100193)

急性胰腺炎(AP)是消化科的常見危急重癥，發(fā)病初期血液中產(chǎn)生的大量抗炎細胞因子、炎癥介質(zhì)及氧自由基，炎癥介質(zhì)之間相互作用，引起“炎癥介質(zhì)瀑布樣級聯(lián)效應”[1-3]。臨床上可分為輕癥急性胰腺炎和重癥急性胰腺炎，重癥急性胰腺炎患犬的病死率較高，可達20%～30%[4]。臨床以急性腹痛、嘔吐、發(fā)熱、血與尿淀粉酶增高為特點。急性胰腺炎又分水腫型和出血壞死型兩種，而臨床上多見水腫型[5]。急性胰腺炎由于發(fā)病機制復雜、臨床表現(xiàn)多樣、病死率高，因此動物模型實驗在研究中運用廣泛。從1856年第一個急性胰腺炎動物模型制作出來后，多種動物模型相繼問世。大致可分為非侵入型(雨蛙素誘導法、L-精氨酸誘發(fā)法、無膽鹽乙硫氨酸飼喂法等)和侵入型(結(jié)扎法、胰管逆行注射法等)。每種方法都各有優(yōu)缺點，可根據(jù)實驗動物的不同有所選擇。胰管逆行注射法制胰腺炎操作復雜、易于感染、易形成不全梗阻，但存活率相對較高，模型最為穩(wěn)定，是目前最常用的、最被認可的模型。本研究證實了用5%?；悄懰徕c(0.1 mL/kg體重)和胰蛋白酶(3 500 U/kg體重)的混合溶液，通過改良后的胰管逆行注射法，能成功構(gòu)建犬急性壞死性胰腺炎，且模型相對穩(wěn)定。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 購自北京市沙河利通實驗動物養(yǎng)殖中心的雜種健康犬6只，體重9±3 kg體重，年齡1～3歲，雌雄各半，所有動物按照標準免疫與驅(qū)蟲程序進行防疫(六聯(lián)苗、狂犬苗，荷蘭英特威國際有限公司；汽巴杜蟲丸，諾華動物保健公司)。實驗犬飼養(yǎng)在相對獨立的實驗動物房中，有通風設施，室溫在18 ℃～25 ℃之間，每日飼喂1次。試驗開始前一天做生化血常規(guī)，正常者入選。

1.2 犬實驗性急性胰腺炎模型構(gòu)建 術前所有犬禁食24 h，正常飲水。肌肉注射舒泰50?(0.05 mL/kg體重)和846合劑(0.05 mL/kg體重)進行麻醉，待犬進入麻醉后，行常規(guī)剃毛手術準備，鋪創(chuàng)巾。腹中線切口開腹，暴露十二指腸向后翻轉(zhuǎn)，顯示胰腺，緊貼十二指腸腸壁，呈粉紅色、質(zhì)軟，呈扁平長帶狀(胰腺大小個體差異較大)。尋找胰腺右葉與十二指腸連接處，在其對側(cè)腸壁切開長約2.0～2.5 cm的縱行切口，即可見到粉紅色腸壁一個大小約1.0～1.5 mm略發(fā)白的臍樣凹陷，這即為小乳頭(副胰管開口于此)，在小乳頭上方大約1.5～3 cm處可見向腸腔突出的大小約3～4 mm的隆起為大乳頭(膽總管和胰管開口于此)，結(jié)扎胰管。在副胰管處向乳頭部置入直徑2.0 mm左右的塑料管材料，深度約1～1.5 cm，將微量注射泵連于管外，以8 Kpa的恒定壓力將5%牛磺膽酸鈉(0.1 mL/kg體重)和胰蛋白酶(3 500 U/kg體重)的混合液以27 mL/h的速度注入胰管內(nèi)，留置 5 min后將塑料管拔出?？p合十二指腸壁，并逐層關腹。整個過程無菌操作。手術室環(huán)境溫度控制在25 ℃±1 ℃。造模后7 d實驗犬禁食禁水。

模型構(gòu)建完成后0.5 h開始靜脈滴注，之后每天8∶00和20∶00給實驗犬輸液，直到7 d后實施安樂死。每天按照0.1 mL/kg體重的劑量，皮下注射拜有利。

1.3 樣品的采集及處理 實驗犬在麻醉前，造模后0.5 h，造模后12 h，24 h，分別在每天第1次輸液前采集靜脈血，做血常規(guī)檢驗及生化指標檢測；在造模前以及在實驗后48 h及第7天應用B超檢測胰腺在形態(tài)結(jié)構(gòu)上的變化。

1.4 統(tǒng)計學分析 所用數(shù)據(jù)均采用GraphPad Prism 4 Project統(tǒng)計分析軟件進行分析處理，實驗結(jié)果用均數(shù)±標準差(x±SD)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性胰腺炎模型構(gòu)建情況 向主胰管內(nèi)注入?；悄懰徕c和胰蛋白酶復合液15 min后可以看到胰腺充血、出血明顯(見中插彩版圖1)；造模后1 d，患犬體溫升高，嘔吐，拉血紅色稀便，腹痛，呈“祈禱”式(見中插彩版圖2、3)；在模型構(gòu)建完成第1天，各模型組與造模前相比，血漿淀粉酶含量差異極顯著(P<0.01)，達到術前5倍以上(表1)，血清脂肪酶含量也達到術前8倍左右，差異極顯著(P<0.01)(表1)；在模型構(gòu)建完成48 h，各模型組與造模前相比，B超影像顯示胰腺邊緣不規(guī)則增大，回聲增強且不均質(zhì)，包膜不可見；圍繞胰腺的腸系膜回聲增強，水腫導致低回聲的均一的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中有產(chǎn)回聲的小葉組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)；有些犬出現(xiàn)少量腹水(圖4～6)。

圖4 胰腺縱切面

圖5 胰腺縱切面

圖6 腎臟部位超查出少量腹水

光鏡下觀察可見造模的實驗犬胰腺，腺泡細胞細胞崩解、壞死，細胞界限不分明(見中插彩版圖7)。以上結(jié)果表明，采用胰管逆行注射法構(gòu)建急性胰腺炎模型成功，各模型組均構(gòu)建成功說明了胰管逆行注射法構(gòu)建的急性胰腺炎模型穩(wěn)定。

表1 實驗犬術前與術后12 h血清淀粉酶和脂肪酶水平對比 (U/L)

**:術前與術后12 h差異極顯著(P<0.01)

2.2 實驗犬血液學檢測 白細胞總數(shù)、血清淀粉酶、血清脂肪酶變化(見表2)。

表2 實驗犬白細胞總數(shù)、淀粉酶和脂肪酶變化情況

**：術前與術后差異極顯著(P<0.01)

血清淀粉酶和血清脂肪酶的含量是檢測急性胰腺炎的一個重要生化指標：(1)從表2可以看出，實驗犬在術后的第1天到第3天的淀粉酶、脂肪酶含量變化差異顯著(P<0.05)，表明所有模型組的胰腺炎病理模型構(gòu)建成功；(2)從淀粉酶變化圖(圖9)可以看出，急性胰腺炎發(fā)生之后，其血清淀粉酶含量是一個先升高后下降的變化過程，在第1天就可以達到峰值，其數(shù)值變化升高8倍左右，在第3天到第4天之間緩慢下降，于第7天下降到接近正常值水平；(3)從表2可以看出，術后的第1天到第3天的脂肪酶含量變化差異顯著(P<0.05)，表明所有模型組的胰腺炎病理模型構(gòu)建成功；(4)從脂肪酶變化圖(圖9)可以看出，急性胰腺炎發(fā)生之后，其血清脂肪酶含量是一個先升高后下降的變化過程，在第一天就可以達到峰值，其數(shù)值變化升高10倍左右，在第2天到第4天之間緩慢下降，于第7天下降到接近正常值水平。

2.3 B超影像學觀察 造模前，使用高頻探頭進行十二指腸段縱向定位掃查，可見正常胰腺右葉質(zhì)地均勻，邊緣清晰的胰腺，胰腺呈細粒狀低回聲，回聲均勻(圖8)。造模后2 d， 胰腺右葉包膜不可見，邊緣不規(guī)則增大，實質(zhì)回聲顯著不均(如圖9)。造模后7 d，胰腺邊緣分界不清、水腫，實質(zhì)回聲不均勻，有低回聲甚至無回聲區(qū)，也有強回聲區(qū)并伴有后方聲影，提示有局部壞死灶(如圖10)。

圖8 胰腺縱切面

圖9 胰腺縱切面

圖10 胰腺縱切面

3 討論

利用動物模型來研究急性胰腺炎的發(fā)展最早可以追溯到1859年，Bernad用膽汁和橄欖油注入雜種犬的胰管內(nèi)造成了急性胰腺炎。在此之后，通過不斷的探索，成功地復制出了多種不同類型的急性胰腺炎動物模型，如雨蛙素誘發(fā)法、L—精氨酸誘發(fā)法、膽胰管逆行注射法和膽胰管結(jié)扎法等。由于實驗動物不一樣，選擇合適的造模方式也是不一樣的。

目前，誘發(fā)犬急性胰腺炎模型較常用的方法是膽胰管結(jié)扎法、膽胰管逆行注射法等。相對而言膽胰管結(jié)扎法成本低，但模型穩(wěn)定性不高，不能控制急性胰腺炎造模的程度；膽胰管逆行注射法操作較復雜，但模型最穩(wěn)定，也是目前最常用的而且最認可的造模方式。

本試驗在預試驗中，對多種造模方式進行摸索發(fā)現(xiàn)，膽胰管結(jié)扎法易造成膽汁淤積，在造成胰腺的損傷的同時，還能造成肝臟的嚴重損傷。這樣不僅影響了生化指標的變化，還影響觀察胰腺炎的發(fā)生發(fā)展，不能體現(xiàn)出胰腺炎繼發(fā)肝臟的損傷。若改良使用胰管結(jié)扎法，由于胰管和總膽管共同開于十二指腸壺腹部，在十二指腸壁有一個公共通道，不易于胰管的單獨結(jié)扎。而且，在單純胰管結(jié)扎造成的胰腺炎模型中，由于犬個體差異，造出的急性胰腺炎模型也不穩(wěn)定，經(jīng)病理組織學觀察，有的間質(zhì)充血、水腫顯著，出血不顯著，表現(xiàn)出的是輕度水腫型胰腺炎；有的可見局灶性壞死，伴發(fā)出血，表現(xiàn)出的是重度壞死型胰腺炎。

有試驗表明[6]，胰酶釋放入間質(zhì)內(nèi)有3種機制：(1)機械性或功能性的胰管系統(tǒng)閉塞使胰酶排出受阻；(2)細胞毒性因子(或物質(zhì))導致腺泡細胞和導管細胞的質(zhì)膜完整性遭到破壞；(3)血管因素或溶酶體的影響而導致腺泡細胞胞質(zhì)內(nèi)的酶原活性早熟。采用胰管逆行注射法造急性胰腺炎模型，常采用牛磺膽酸鈉和胰蛋白酶混合液通過胰管注入胰腺。由于異常的胰酶激活能導致胰腺自身消化，而?；悄懰徕c則是一種細胞毒性物質(zhì)，注入后能激活胰蛋白酶原，最終導致胰腺組織的損傷，啟動胰腺自身的消化鏈鎖。?；悄懰徕c誘導胰腺損傷的程度與濃度有關。試驗證明，逆行膽胰管注射誘發(fā)的急性胰腺炎模型中，5%?；悄懰徕c造成的胰腺病變明顯比3%?；悄懰徕c誘發(fā)的嚴重[7]。

本試驗通過臨床癥狀、生化指標、B超影像學觀察和病理學變化表明，在傳統(tǒng)胰管逆行注射法的基礎上，通過改良結(jié)扎主胰管后，再用5%?；悄懰徕c(0.1 mL/kg體重)和胰蛋白酶(3 500 U/kg體重)的混合液以27 mL/h的速度注入副胰管內(nèi)，保證混合物以恒定壓強注入胰腺中。造出的實驗犬急性胰腺炎模型穩(wěn)定，均是急性壞死性胰腺炎；模型死亡率低。結(jié)果表明，本試驗制備急性壞死性胰腺炎模型的方法是成功的，為進一步研究和探討ASP的臨床治療和基礎損傷機制提供了一種較為理想的實驗手段。

參考文獻:

[1] Lankisch P G，Apte M，Banks P A．Acute pancreatitis[J]． Lancet，2015，386(9988) ：85-96．

[2] Mews P，Philips P，F(xiàn)ahmy R，etal．Pancreatic stellate cells respond to inflammatory cytokines：potential role in chronic pancreatitis[J]．Gut，2002，50(4) ：535-541．

[3] 劉大晟，吳先林，李接興，等．三種不同造模方法建立大鼠記性胰腺炎模型的對比[J]．中國老年學，2016，36(10)：2 315-2 318.

[4] 下瀨川澈．急性胰腺炎重癥化的機序[J]．日消志，2001，98：1 029-1 036．

[5] 王建華．家畜內(nèi)科學[M]．3版.中國農(nóng)業(yè)出版社，2006：369-372．

[6] Evander A，Lundgulist I．Influence of hormonal stimulation by cerulein on acute experiment pancreatitis in the rat[J]．Eur Surg Res，1981，13：857．

[7] Robert J，Greenstein M D，Lawrence R，etal．Activation of the renin systern in acute pancreatitis[J]．Am J Med，1997，82(3)：401-404．