王 羽 ， 董文龍 ， 王 巍 ， 盛宇軒 ， 張喜慶 ， 馬紅霞 ， 高云航

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 ， 吉林 長(zhǎng)春 130118)

多殺性巴氏桿菌病是動(dòng)物臨床中的常見(jiàn)病, 其抗原性及宿主特異性的不同, 造成臨床動(dòng)物發(fā)病癥狀也大不相同，可以引發(fā)豬肺疫，牛出血性敗血癥，禽霍亂，給養(yǎng)殖戶帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

動(dòng)物源性巴氏桿菌的耐藥性倍受人們關(guān)注，細(xì)菌對(duì)某一類具有相同或是相似結(jié)構(gòu)抗菌藥物耐藥的產(chǎn)生，可能是抗菌藥物新作用位點(diǎn)的產(chǎn)生或是作用位點(diǎn)的改變[1]。但隨著抗菌藥物的不合理應(yīng)用，特別是將抗菌藥物以次治療劑量添加到飼料中，導(dǎo)致多殺性巴氏桿菌的耐藥率不斷提高，耐藥范圍更廣，多重耐藥的現(xiàn)象越來(lái)越多。因此對(duì)動(dòng)物治療要合理用藥、合理用量，避免耐藥性的產(chǎn)生。

整合子是細(xì)菌基因組中一種介導(dǎo)耐藥基因轉(zhuǎn)移的專座元件，其功能與細(xì)菌耐藥產(chǎn)生與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[2-4]。本試驗(yàn)通過(guò)微量稀釋法藥敏試驗(yàn)、耐藥基因及其整合子擴(kuò)增確定了該18株多殺性巴氏桿菌耐藥性及其Ⅰ型整合酶攜帶率。

1 材料與方法

1.1 菌種 18株多殺性巴氏桿菌由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究室分離保存。12株牛源多殺性巴氏桿菌分離自吉林省不同肉牛養(yǎng)殖場(chǎng)患有肺炎的肺臟組織(分別命名為Pa1，Pa2，Pa3，Pa4，Pa5，Pa6，Pa7，Pa8，Pa9，Pa10，Pa11，Pa12)，6株豬源多殺性巴氏桿菌分自吉林省不同豬場(chǎng)患有肺炎的肺臟組織(分別命名為Pm1，Pm2，Pm3，Pm4，Pm5，Pm6)。

1.2 主要試劑 胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)，購(gòu)自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；胎牛血清，購(gòu)自北京元亨圣馬生物技術(shù)研究所；ExTaq酶、dNTP、DNA Marker 2 000、6×Ex Buffer等，購(gòu)自TaKaRa公司，細(xì)菌基因組提取試劑盒、膠回收試劑盒等，購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3 MIC試驗(yàn) 將多殺性巴氏桿菌接種到TSB液體培養(yǎng)基中(含50 mL/胎牛血清)，37 ℃水平搖床170 r/min培養(yǎng)18 h。將多殺性巴氏桿菌菌液進(jìn)行倍比稀釋，選取濃度為1×106CFU/mL的菌液作為標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行抗菌藥物敏感性試驗(yàn)。

參考CLSI動(dòng)物源細(xì)菌藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，分別以敏感(S)、中介(I)和耐藥(R)3種形式對(duì)藥物敏感性進(jìn)行分析。

1.4 DNA提取及PCR鑒定 采用Primer(版本為5.0)軟件根據(jù)GenBank已登陸的四環(huán)素類耐藥基因tetB、tetG、tetK、tetO、tetQ、tetB及Ⅰ型整合酶Int I序列進(jìn)行引物的設(shè)計(jì)。引物序列送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行合成。

表1 Ⅰ型整合酶和四環(huán)素類引物序列及預(yù)計(jì)大小

挑取單個(gè)菌落接種于TSB液體培養(yǎng)基中(含50 mL/胎牛血清)，置于37 ℃水平搖床(170 r/min)增菌培養(yǎng)。取1.6 mL菌液12 000 r/min離心，棄上清，參考細(xì)菌基因組提取試劑盒說(shuō)明書提取分離菌株DNA。

Ⅰ型整合酶PCR反應(yīng)條件如下：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，退火57 ℃ 1 min，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min；四環(huán)素類耐藥基因PCR反應(yīng)條件如下：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，退火(6種耐藥基因的退火溫度參照表1)30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min；PCR反應(yīng)結(jié)束后，擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化，純化產(chǎn)物和pMD-18T連接過(guò)夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α 感受態(tài)細(xì)胞，按照試劑盒說(shuō)明書提取質(zhì)粒進(jìn)行驗(yàn)證，并送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與GenBank中已知基因序列進(jìn)行Blast比對(duì)。

2 結(jié)果

2.1 MIC試驗(yàn)結(jié)果分析 18株多殺性巴氏桿菌對(duì)8種抗生素的耐藥情況見(jiàn)表2。

表2 多殺性巴氏桿菌耐藥結(jié)果

2.2 四環(huán)素耐藥基因擴(kuò)增結(jié)果

2.2.1tetA耐藥基因擴(kuò)增結(jié)果 采用PCR技術(shù)對(duì)tetA耐藥基因進(jìn)行擴(kuò)增，18株P(guān)m均未檢測(cè)到tetA耐藥基因。

2.2.2tetB耐藥基因擴(kuò)增結(jié)果 菌株P(guān)m1、Pm3、Pm4與Pa11擴(kuò)增出200 bp左右的片段，該基因片段測(cè)序后使用Blast對(duì)其堿基序列進(jìn)行分析，其結(jié)果顯示，所擴(kuò)增的tetB相應(yīng)序列與GenBank上已登錄的耐藥基因tetB(登錄號(hào)NG-048170.1)序列同源性為100%。結(jié)果如圖1。

2.2.3tetG耐藥基因擴(kuò)增結(jié)果 18株P(guān).multocida均擴(kuò)增出約400 bp大小的片段，根據(jù)Blast對(duì)比結(jié)果可知，與GenBank上已登錄的耐藥基因tetG(登錄號(hào)NG-051907.1)同源性為93%，結(jié)果如圖2。

圖1 P.multocida的tetB 基因擴(kuò)增結(jié)果

圖2 P.multocida的tetG基因擴(kuò)增結(jié)果

2.2.4tetK耐藥基因擴(kuò)增結(jié)果 菌株P(guān)a1、Pa2、Pm1、Pm2、Pm3擴(kuò)增出200 bp左右的片段，該基因片段測(cè)序后使用Blast對(duì)其堿基序列進(jìn)行分析，其結(jié)果顯示，所擴(kuò)增的tetK相應(yīng)序列與GenBank上已登錄的耐藥基因tetK(登錄號(hào)KR362248.1)序列同源性為100%。結(jié)果如圖3。

圖3 P.multocida的tetK 基因擴(kuò)增結(jié)果

2.2.5tetO耐藥基因擴(kuò)增結(jié)果 僅Pm10擴(kuò)增出約200 bp大小片段，與預(yù)期片段大小相符，根據(jù)Blast對(duì)比結(jié)果可知，菌株P(guān)m10擴(kuò)增序列與GenBank上已登錄的耐藥基因tetO(登錄號(hào)KR362248.1)同源性為100%。結(jié)果如圖4。

2.2.6 tetQ耐藥基因擴(kuò)增結(jié)果 菌株P(guān)a2、Pa4、Pa5、Pm1、Pm2約200 bp的片段，將測(cè)序結(jié)果與GenBank中已知基因序列進(jìn)行Blast比對(duì)，5株菌株擴(kuò)增序列已登錄的耐藥基因tetQ(GQ343142.1)序列同源性達(dá)到98%。結(jié)果如圖5。

圖4 P.multocida的tetO基因擴(kuò)增結(jié)果

圖5 P.multocida的tetQ 基因擴(kuò)增結(jié)果

2.3 Ⅰ型整合酶擴(kuò)增結(jié)果 菌株均擴(kuò)增出280 bp左右的片段，測(cè)序結(jié)果為Pa1、Pa2、Pa12與GenBank登錄的Ⅰ型整合酶(MF168945.1)同源性均為100%。Pa6為99%。結(jié)果如圖6。

圖6 Ⅰ型整合酶基因擴(kuò)增結(jié)果

3 討論

研究表明，豬源多殺性巴氏桿菌在氯霉素、痢特靈、羧芐青霉素、鏈霉素、丁胺卡那霉素等抗生素中對(duì)氯霉素、羧芐青霉素、鏈霉素、卡那霉素均耐藥[5]。孔令聰分離得到12株牛源多殺性巴氏桿菌，耐藥檢測(cè)分析顯示，此12株菌對(duì)新諾明、鏈霉素高度耐藥[6]。在本研究中，試驗(yàn)結(jié)果顯示，18株不同源的多殺性巴氏桿菌對(duì)氯霉素的耐藥率為83.33%，對(duì)四環(huán)素、強(qiáng)力霉素與慶大霉素的耐藥率為50%～61.11%，對(duì)氧氟沙星、卡那霉素、恩諾沙星與氟苯尼考的耐藥率為27.78%～38. 89%。18株不同來(lái)源的多殺性巴氏桿菌表現(xiàn)出不同藥物的敏感性從而為指導(dǎo)臨床科學(xué)用藥提供依據(jù)。

四環(huán)素類藥物為廣譜抗生素, 廣泛用于臨床治療, 并常被用做動(dòng)物促生長(zhǎng)劑，四環(huán)素類藥物產(chǎn)生耐藥性的機(jī)制主要有核糖體保護(hù)作用、外輸泵作用及產(chǎn)生鈍化酶等[7]。在本研究中未檢測(cè)到tetA耐藥基因；22.22%多殺性巴氏桿菌攜帶tetB耐藥基因，5.56%多殺性巴氏桿菌攜帶tetO耐藥基因；tetK與tetQ兩種耐藥基因的攜帶率均為27.28%，而對(duì)于tetG的攜帶率為100%。

根據(jù)整合酶序列不同，整合子可分為6型，以Ⅰ型整合酶最為常見(jiàn)[8-9]。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)多殺性巴氏桿菌Pa1、Pa2、Pa6與Pa12攜帶Ⅰ型整合酶且Pa1、Pa2、Pa6與Pa12有著相似耐藥譜，有可能在此4株菌株中發(fā)生了耐藥傳播。所以持續(xù)監(jiān)測(cè)細(xì)菌耐藥性對(duì)選擇有效抗菌藥物治療疾病是非常重要的。隨著細(xì)菌耐藥性逐漸增加，應(yīng)該減少抗菌藥物的應(yīng)用，避免細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。

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