楊 敏 ， 吳 青 ， 沙 莎

(西南大學榮昌校區(qū)動物醫(yī)學系 ， 重慶 榮昌 402460)

隨著我國大鯢馴養(yǎng)繁殖研究的成功開展，人工養(yǎng)殖大鯢規(guī)模的逐漸擴大，同時面臨著各類疾病的威脅，大鯢細菌性病害更是一類常見且危害性大的疾病，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的病原菌有溫和氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、柱狀黃桿菌、維氏氣單胞菌、遲鈍愛德華菌、惡臭假單胞菌[1-6]等。惡臭假單胞菌為假單胞菌屬一種常見的條件致病菌，廣泛存在于水體和土壤中。近幾年無相關報道惡臭假單胞菌引起大鯢發(fā)病，本次研究對重慶某大鯢養(yǎng)殖基地病死大鯢經(jīng)細菌的分離鑒定，生物學特性，理化性質及BIOFOSUN-GN48微生物自動分析系統(tǒng)鑒定，結合16S rDNA PCR鑒定結果,進行測序，構建系統(tǒng)發(fā)育樹，并進行了致病性試驗和藥物敏感性試驗，以期為大鯢病原菌研究提供科學依據(jù)，對大鯢疾病防治、生產(chǎn)養(yǎng)殖提供參考，也為進一步深入研究惡臭假單胞菌致病機制奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 病死大鯢來自重慶某人工養(yǎng)殖基地；健康鯽魚30尾，長度 10～12 cm/尾，購自重慶榮昌區(qū)某魚類養(yǎng)殖場；藥敏試紙，購自杭州天和微生物試劑有限公司；中藥材，購自重慶榮昌區(qū)中藥專賣店。

1.2 主要試劑 營養(yǎng)瓊脂、克氏雙糖鐵、麥康凱瓊脂，均購自北京奧博星生物技術有限責任公司；PCR擴增測序試劑由上海生工生物工程技術服務有限公司提供

1.3 方法

1.3.1 細菌的分離培養(yǎng) 取病死大鯢的腎臟、脾臟、肝臟等組織接種在營養(yǎng)瓊脂上，在28 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h后，挑取優(yōu)勢菌落在普通營養(yǎng)培養(yǎng)基上分離培養(yǎng)，獲純培養(yǎng)物，將從腎臟分離菌編號為KN-4。接種血平板、麥康凱、KIA培養(yǎng)基，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察菌落特征，涂片、染色、鏡檢。

1.3.2 鯽魚致病性試驗 接種KN-4純培養(yǎng)物到營養(yǎng)肉湯中， 28 ℃震蕩培養(yǎng)18 h，使菌液濃度約為1.5×108CFU/mL，用于感染鯽魚。將鯽魚隨機分3組：試驗組、生理鹽水組、空白組分別10條鯽魚。分別從鯽魚腹鰭根部將試驗組注射0.5 mL菌液，生理鹽水組注射0.5 mL生理鹽水，空白組不做處理。觀察記錄發(fā)病及死亡情況，對死亡的鯽魚剖檢，分離，染色鏡檢 。

1.3.3 細菌生化鑒定 取純培養(yǎng)物進行氧化酶試驗，同時接種在肉湯培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)16～24 h后，進行BIOFOSUN-GN48微生物自動分析系統(tǒng)鑒定，參照文獻[7-9]進一步鑒定。

1.3.4 16S rDNA PCR 鑒定 采用上海生工生物工程技術服務有限公司合成的通用引物：上游引物，5′-AGAGTTTGACCTGGCTCAG-3′；下游引物，5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反應體系(12.5L)： DNA模板1L，6.25L的premix ，上游下游引物各0.5L, 超純水4.25L。 反應條件：94 ℃預變性10 min，再置于94 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min 30 s，總共循環(huán)30次，最后在72 ℃延伸5 min。將PCR產(chǎn)物置于1%瓊脂糖凝膠電泳中檢測。PCR產(chǎn)物遞送上海生工生物工程技術服務有限公司進行序列測定。將所得序列在NCBI上經(jīng)由BLAST對比后，運用MEGA 5.0軟件進行同源性分析，并構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.5 藥敏試驗 采用紙片擴散法對KN-4菌株進行哌拉西林、丁胺卡那霉素、頭孢他啶、米諾環(huán)素等32種抗生素的藥敏試驗。28 ℃下培養(yǎng)24 h后，測定并記錄抑菌圈的直徑，敏感性判定參照CLSI 2014抗微生物藥物敏感性試驗的執(zhí)行標準。

1.3.6 中藥試驗 購買苦參、連翹、甘草等14種中藥材分別取20 g,進行粉碎、浸泡煎煮、過濾,合并3次煎煮液，取濾液濃縮至1 g/mL。取純培養(yǎng)菌，用生理鹽水稀釋至1.5麥氏比濁標準，均勻涂布在平板上，4點法放入牛津杯，同一種藥液做3個平行，每個加200L藥液，一個空白對照，加200L蒸餾水，28 ℃培養(yǎng)24 h后觀察結果。測定并記錄抑菌圈的直徑大小。

2結果

2.1 細菌的分離培養(yǎng)結果 從病死大鯢腎臟分離1株優(yōu)勢菌，編號為KN-4，在營養(yǎng)瓊脂上生長，菌落露滴狀圓形，淡黃色，邊緣整齊，濕潤光滑。在麥康凱培養(yǎng)基上生長良好，菌落呈圓形，灰黃色。KIA斜面上下顏色均無變化。血平板上出現(xiàn)α溶血現(xiàn)象。革蘭染色鏡檢，為陰性桿菌。

2.2 鯽魚致病性試驗結果 試驗組鯽魚1周內全部死亡，空白組和生理鹽水組未見死亡(表1)。剖檢死亡鯽魚，無明顯病理變化，取腹水、肝胰、腎臟病料進行細菌分離純化鑒定，在各臟器中分離得到優(yōu)勢菌與KN-4菌株的生物學特性呈現(xiàn)高度的一致。

表1 KN-4菌株對健康鯽魚的感染試驗

-:不做任何處理

2.3 細菌的生化鑒定結果 KN-4菌為革蘭陰性非腸桿菌，氧化酶陽性，不發(fā)酵D-果糖、D-半乳糖、麥芽糖等，D-甘露醇、D-山梨醇、D-阿糖醇為陰性，可利用肌苷、L-亮氨酸、L-焦谷氨酸、L-丙氨酸、L-谷氨酸等。BIOFOSUN-GN48微生物自動分析系統(tǒng)定鑒定結果顯示與惡臭假單菌相符合的概率為100%，相似指數(shù)0.825，位距指數(shù)2.585。即KN-4菌株表型特征與惡臭假單胞菌的相似程度和匹配程度均較高[10]。結果見表2。

2.4 16S rDNA PCR 鑒定結果 將 KN-4菌株基因組進行PCR擴增，產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳中顯示出目的條帶大小約為1 500 bp(見圖1第4條帶)，遞交上海生工生物工程技術服務有限公司測序，得到大小為1 443 bp的序列。在NCBI上選取與KN-4菌株同源性達到99%以上的18種假單胞菌屬不同種細菌，經(jīng)MEGA 5.0軟件制作16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹和同源性比對圖(圖2、3)，KN-4菌株與惡臭假單胞菌(登陸號為FJ262368)和假單胞菌不定種(登陸號為FJ976654)在一個分支上，置信度為98.9%，親緣性最為相近[11]。

表2 KN-4株的生理生化特性

注 +：陽性；-：陰性

2.5 藥敏試驗結果 KN-4菌株對頭孢他啶(CAZ)、丁胺卡那霉素(AMK)、新霉素(FRM)、多黏菌素B(PLB)、頭孢曲松(CRO)表現(xiàn)為高度敏感；而對氨芐西林(SAM)、多西環(huán)素(DOX)、慶大霉素(GEN)等27種抗生素耐藥(表3) 。

圖1 PCR擴增結果

圖2 KN-4分離株系統(tǒng)發(fā)育樹

圖3 16S rDNA 的同源性比較

表3 分離株K N-4藥敏試驗結果

S：敏感；R：耐藥

2.6 中藥試驗結果 中藥抑菌試驗中連翹、苦參、甘草、魚腥草、黃連、黃芩、老鶴草對KN-4具有較強抑菌活性，板藍根、蒲公英、當歸、夏枯草、金銀花、五倍子、大黃對其無抑菌作用[12]。

表4 分離株KN-4的中藥試驗結果

-：無抑制作用

3 討論

惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)為假單胞科(Pseudomonadaceae)假單胞屬(Pseudomonas)，革蘭陰性需氧桿菌，無芽孢，觸酶陽性，氧化酶陽性，不發(fā)酵糖，在麥康凱培養(yǎng)基上生長，廣泛存在于土壤、水、植物以及腐物中，同時也是海淡水魚類腸道菌群的重要成員之一[13]。分離菌株KN-4的16S-rDNA PCR鑒定結果顯示，KN-4菌株與惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)(登陸號為FJ262368)和假單胞菌不定種(Pseudomonassp.)(登陸號為FJ976654)親緣性最為相近[11]。其表型鑒定用BIOFOSUN-GN48微生物自動分析系統(tǒng)測定結果與惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)相符?？纱_定KN-4 菌株是惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)(登陸號為FJ262368)。

在國內的研究報道中惡臭假單胞菌可引發(fā)歐洲鰻鱺[14]、羅氏沼蝦[15]、黑鯛[16]、大黃魚[15-16]、大鯢[6]等患病。引起患病的原因可能是大鯢食用了不新鮮的餌料魚，餌料污染了惡臭假單胞菌隨食物進入腸道，細菌異常增生，侵襲腎臟，引起大鯢死亡或發(fā)病[6]。在本次研究中KN-4菌株對鯽魚的攻毒試驗中表現(xiàn)較強的毒力，試驗鯽魚死亡率達100%。在大鯢腎臟分離到致病菌KN-4，說明惡臭假單胞菌易在腎臟富集并侵害腎臟，另一方面鯽魚致病性試驗說明鯽魚也是惡臭假單胞菌易感的對象，并可造成較嚴重的損害。同時也驗證了其他研究者認為多種魚為惡臭假單胞菌的易感對象的結果[15]。鑒于KN-4對鯽魚的高致病性，可以推斷養(yǎng)殖場在養(yǎng)殖中給大鯢飼喂凍魚餌料和活餌料過程中污染了惡臭假單胞菌，這種高致病性惡臭假單胞菌有機會進入大鯢機體，可與其他因素結合從而造成大鯢發(fā)病的可能性提高。

惡臭假單胞菌對抗生素敏感性研究作為大鯢治療有重要意義。趙虎等在2008年測得大鯢惡臭假單胞菌對舒普深(頭孢哌呱酮舒巴坦)、呋喃妥因敏感，同年沈錦玉等[17]測得網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚惡臭假單胞菌對卡那霉素、慶大霉素、吡哌酸、四環(huán)霉素等敏感；2012年任燕等[18]研究報道大黃魚惡臭假單胞菌病原對卡那霉素、慶大霉素等敏感；許斌福[19]等在2015年研究報道中，顯示大黃魚惡臭假單胞菌對卡那霉素敏感。許多的研究結果[6，17-19]顯示，不同地域不同菌株及試驗魚種類的差異，都可能導致耐藥性的產(chǎn)生。在我們的研究中KN-4菌株對頭孢他啶、丁胺卡那霉素、新霉素、多黏菌素B、頭孢曲松較為敏感；對慶大霉素、舒普深(頭孢哌呱酮舒巴坦)、呋喃妥因、卡那霉素、吡哌酸、四環(huán)素表現(xiàn)為耐藥。我們及相關研究者們的結果反映了近8年惡臭假單胞菌對頭孢哌呱酮舒巴坦、呋喃妥因、卡那霉素等抗生素從敏感已經(jīng)變成耐藥的現(xiàn)象。因此惡臭假單胞菌耐藥機制及合理應用抗生素類藥物用于大鯢治療具有重要意義。

另外，我們對惡臭假單胞菌的中藥抑菌試驗研究結果顯示，連翹、苦參、甘草、魚腥草、黃連、黃芩、老鶴草分別對KN-4菌株具有較強抑菌活性。使用中藥防治大鯢或魚類惡臭假單胞菌引起的疾病較使用抗生素有一定的優(yōu)勢，一定程度上可避免多重耐藥性的不斷產(chǎn)生?？梢詾檠芯刻崛⌒滤幏乐未篥F細菌性病害提供參考，為中藥在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的疾病防治方面提供實驗依據(jù)。

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