金艷丹 ， 栗 慧 ， 張巖蔚 ， 魏 東

(1.河北省農(nóng)產(chǎn)品安全檢測重點實驗室 ， 河北 張家口 075000 ； 2.河北北方學院食品安全研究中心 ， 河北 張家口 075000)

鹽酸克倫特羅又稱“瘦肉精”(CL)，是白色或類白色晶體粉狀，無嗅、味微苦，化學性質(zhì)較為穩(wěn)定，屬于苯乙醇胺類β2腎上腺類神經(jīng)興奮劑。它有較強的藥性，化學性質(zhì)穩(wěn)定，溶解代謝率低，不易排出，殘留量較高，大量用在飼料中可增強脂肪分解，肉迅速增長，大大提高了瘦肉率，增加瘦肉產(chǎn)量，雖說農(nóng)藥、飼料添加劑、動物激素等在一定劑量范圍內(nèi)使用，可以為畜牧業(yè)和經(jīng)濟的發(fā)展起一定的促進作用，但當其在生物體內(nèi)含量超過臨床用量的5～10倍時，便會導致畜禽中毒和大量藥物殘留，帶來了相應的安全隱患[1]。研究表明，過多食用含有瘦肉精的肉制品對人體某些機能損害極大，易使人出現(xiàn)肌肉震顫、心悸、嘔吐等癥狀，特別是對高血壓、心臟病、甲亢和前列腺肥大等疾病患者危害更大，嚴重的可導致死亡[2]。因此，研究一種高效、快速、簡捷的檢測鹽酸克倫特羅類興奮劑藥物殘留的方法是目前關鍵任務。

目前, 已經(jīng)有多種技術可以對鹽酸克倫特羅瘦肉精殘留進行較為靈敏的檢測。主要有高效液相色譜[3]、微生物法[4]、酶聯(lián)免疫吸附法[5]、膠體金免疫法[6]等，其中高效液相色譜法已成為多個國家主要的檢測方式，但該方法前處理比較復雜，所需儀器昂貴，難以普及。微生物法檢測線過高，靈敏度低，特異性差，適合于初級的篩選也無法廣泛適用。酶聯(lián)免疫吸附法目前雖備受關注但也存在費時、費力等缺點，無法實現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測[7]。膠體金層析法雖比其他方法更適用但對于殘留量較低的半抗原抗體物質(zhì)仍舊很難進行定量分析，且很不能用肉眼觀察，極大地限制了他的應用[8]。而近年來新興的半導體納米熒光材料量子點逐漸被人們開發(fā)作為熒光材料標記抗體，與傳統(tǒng)的有機染料相比激發(fā)光譜寬，顏色可調(diào)，穩(wěn)定性好，熒光強度高[9]。與膠體金相比量子點能檢測出含量較低的抗原抗體，靈敏度更高，更適用于藥物殘留的基層檢驗和大量樣品直接現(xiàn)場檢測[10]。在免疫層析技術中，量子點與大分子物質(zhì)偶聯(lián)是建立熒光免疫層析法的基礎，因此本試驗主要以鹽酸克倫特羅為研究對象，針對量子點的熒光性和抗體的生物功能，采用EDC/NHS偶聯(lián)劑將二者共價偶聯(lián)到一起，并經(jīng)紫外掃描法、熒光掃描、斑點法及免疫法對二者偶聯(lián)效果進行了鑒定，為新型免疫層析法和多殘留檢測試劑盒的研制打下了堅實的基礎。

1 材料

1.1 試劑 鹽酸克倫特羅、碳亞二胺(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、辣根過氧化物酶標記山羊抗鼠IgG，Sigma 公司生產(chǎn)；羊血清、鹽酸克倫特羅完全抗原、鹽酸克倫特羅多克隆抗體，河北北方學院實驗室自制；水溶性羧基量子點，北京北達聚邦量子點有限公司生產(chǎn)；TMB單組份顯色液，北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)；其他試劑均為分析純由國藥集團有限公司生產(chǎn)，本次試驗所用水均為超純水。

1.2 儀器 手持移液器(Research Plus系列)，艾本德國際貿(mào)易有限公司生產(chǎn)；電子精密天平(JJ323BC)常熟市雙杰測試儀器廠生產(chǎn)；臺式高速離心機(TGL-16A)，金壇市儀都儀器有限公司生產(chǎn)；紫外分光光度計(Lambda 365)，韓國生產(chǎn)；熒光分光光度計(F-7 000)，日本島津生產(chǎn)；微孔板恒溫孵育箱(ST70-2)，深圳市優(yōu)米儀器設備有限公司生產(chǎn)；恒溫鼓風干燥箱(FX101-3)，上海樹立儀器儀表有限公司生產(chǎn)；NC膜(0.8 μmol/L)，上海金標生物科技有限公司生產(chǎn)；酶標儀(Multiskan Mk3型)，賽默飛世爾(上海)儀器有限公司。

2 方法

2.1 量子點和鹽酸克倫特羅抗體偶聯(lián) 用注射器取600 μL水溶性羧基量子點溶液(2.5 μmol/L)加入1 mL的PBS(磷酸鹽緩沖液)(pH值=7.0) 攪拌均勻，邊攪拌邊加入300 μL EDC(6 mg/L),將量子點活化20 min后加入100 μL NHS(6 mg/L)，繼續(xù)28 ℃下攪拌20 min，最后加入750 μL鹽酸克倫特羅多克隆抗體溶液，于28 ℃反應2.5 h。反應結(jié)束后將偶聯(lián)物用超濾離心管在12 000 r/min條件下離心3 min，將樣品反復濃縮純化5次，每次濃縮比不小于10，最后置于磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中于4 ℃避光保存。

2.2 偶聯(lián)效果的檢測

2.2.1 紫外分光光度計分析 將量子點和量子點標記抗體偶聯(lián)物用PBS(pH值=7.0)稀釋到一定濃度，在波長為400～700 nm范圍內(nèi)用UV3 900紫外掃描儀分別進行掃描，觀察量子點和量子點抗體偶聯(lián)物之間吸光度以及吸收光譜的變化。

2.2.2 熒光分光光度計分析 將量子點和量子點標記抗體偶聯(lián)物用PBS(pH值=7.0)稀釋到一定濃度，激發(fā)波長為540 nm，狹縫為10 nm，發(fā)射波長在400～700 nm范圍內(nèi)分別用熒光分光光度計掃描儀分別進行掃描，測定熒光強度，觀察兩者之間的變化。

2.2.3 斑點印跡法 將6 mg/mL CL-OVA點在NC膜上，干燥后用含3% 羊血清的PBS(pH值=7.0)封閉膜上未反應的蛋白結(jié)合位點，放置37 ℃恒溫孵育箱中孵育1h，取出，用PBS或PBST反復洗滌膜。用相同方法制備2個印跡膜，干燥后依次滴加QDS-CL和QDS，于 37 ℃ 孵育器中反應25 min，用PBS(pH值=7.0)反復沖洗干凈，用365 nm紫外燈觀察圖像。

2.2.4 熒光免疫學法 根據(jù)間接熒光免疫分析法測定已標記水溶性羧基量子點的鹽酸克倫特羅多克隆抗體效價，具體步驟如下：包被、封閉、熒光抗體、二抗、顯色、終止、最后在450 nm下測OD值。

3 結(jié)果

3.1 紫外光譜圖 圖1為量子點與鹽酸克倫特羅抗體偶聯(lián)前后的吸收光譜圖。由圖可知，量子點具有較寬的紫外吸收峰，而抗體標記后的量子點的紫外吸收峰變得更寬，原因可能是由于量子點標記上了抗體后，分子結(jié)構(gòu)及數(shù)量可能發(fā)生了改變，使得吸收峰變得更寬。偶聯(lián)后吸光度也有所增加，原因可能是量子點和抗體在EDC、NHS共價偶聯(lián)作用下，形成了酰胺鍵，并且形成了核殼結(jié)構(gòu)，降低了量子點表面核電荷數(shù)的減少，消除了一部分非輻射馳豫途徑從而使吸光度增大。

3.2 熒光光譜圖 圖2為圖2量子點與鹽酸克倫特羅抗體偶聯(lián)前后的熒光光譜圖。由圖可知，用抗體標記后的量子點，熒光吸收峰仍然很窄，最大吸收峰從560 nm到560.1 nm，熒光強度由652.3 nm增加到726.4 nm,略有增強。原因可能是由于量子點均勻的標記上了鹽酸克倫特羅多克隆抗體，偶聯(lián)物粒徑變大，導致了熒光紅移現(xiàn)象。并且抗體包覆量子點后，其表面產(chǎn)生了一定的鈍化作用，降低了無輻射躍遷的幾率量子點偶聯(lián)物熒光強度增強。

圖1 量子點與鹽酸克倫特羅抗體偶聯(lián)前后的吸收光譜

圖2 鹽酸克倫特羅沙丁胺醇抗體偶聯(lián)前后的熒光光譜

3.3 斑點法 將制備好的NC膜放在三用紫外分析儀中觀察，結(jié)果見圖3所示，左膜在滴加CL-BSA 處有明顯的橙黃色亮斑，右膜在 CL-BSA 滴加處沒有出現(xiàn)橙黃色亮斑，結(jié)果表明，所制得的量子點與鹽酸克倫特羅多克隆抗體偶聯(lián)后，抗體并沒有喪失識別抗原的特異性能力，呈現(xiàn)橙黃色亮斑。而膜2由于NC膜上由于沒有抗體不能和抗原結(jié)合而被洗滌液洗掉，不顯示亮斑，有點殘留印跡。

圖3 量子點和鹽酸克倫特羅抗體偶聯(lián)前后的斑點

3.4 免疫學方法 用水溶性羧基量子點和鹽酸克倫特羅多克隆抗體偶聯(lián)物進行間接熒光免疫法所得抗血清效價略有降低但仍可達32 000以上(P/N>2.1且P-N>0.2)，同時OD450值也呈良好的線性關系。因此說明量子點已經(jīng)成功標在了鹽酸克倫特羅多克隆抗體上且多克隆抗體的生物活性沒有受到很大的影響，可為下一步試驗提供參考依據(jù)。

4 討論

4.1 熒光材料的選擇 目前常用的熒光染料有熒光素類、羅丹明類染料、量子點。熒光素的雖然穩(wěn)定性好，量子產(chǎn)率高，但熒光素的斯托克斯位移較小，對樣品的發(fā)射光比較敏感。羅丹明類染料樣品背景干擾小但熒光產(chǎn)率小，而近年來新興的半導體熒光納米材料量子點不僅具有激發(fā)光譜寬、發(fā)射光譜窄、穩(wěn)定性強、熒光產(chǎn)率高、肉眼易觀察等特性，還容易與蛋白質(zhì)共價偶聯(lián)，偶聯(lián)物穩(wěn)定性較強更適合長時間對半抗原樣品進行定量分析。因此本試驗選擇量子點代替?zhèn)鹘y(tǒng)的有機染料作為熒光染料標記抗體。

4.2 偶聯(lián)方法的選擇 常見的偶聯(lián)方法有靜電吸引法、生物素-親和素法、雙功能連接試劑法。靜電吸引法是通過正負電荷的吸引作用將兩個物質(zhì)連接起來，該方法需要試劑種類少、操作方法簡單，而且偶聯(lián)效果也良好，多用于分子生物學，但需要用到重組技術儀器設備比較昂貴，且對外部環(huán)境較敏感不利于大范圍內(nèi)推廣使用。生物素-親和素法放大了生物素和親和素的共同效應，可用于抗原抗體的定量分析，方便快速但其內(nèi)源性生物素的活性不易消除，容易影響結(jié)果。雙功能連接試劑法是采用一種具有2個或2個以上特殊基團的反應末端的雙功能偶聯(lián)劑將蛋白和小分子或者熒光材料連接到一起的方法。常用的交聯(lián)劑有N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸硫磺基琥珀酰亞胺脂鈉(sulfo-SMCC)。由于EDC具有很好的活化功能，NHS會增加基團活化，但會輕微導致熒光淬滅。因此，本試驗采用EDC先將量子點上的羧基活化再加入少量NHS，這樣不僅是量子點和抗體更好的結(jié)合，也不會因為NHS過量導致熒光淬滅，形成較為穩(wěn)定的量子點和抗體偶聯(lián)物

4.3 偶聯(lián)物鑒定方法的選擇 量子點和多克隆抗體偶聯(lián)物鑒定的方法有紫外掃描法、熒光掃描法、斑點印跡法、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法、瓊脂糖凝膠電泳法、免疫學方法等等，紫外掃描法是指通過根據(jù)在一定波長范圍內(nèi)掃描的紫外吸收光譜來分析量子點及其量子點多克隆抗體的偶聯(lián)物的情況，一般來說量子點抗體偶聯(lián)物由于連上了抗體分子量一定會有所增加，其吸收光譜也會發(fā)生一定的變化，因此，來初步判斷量子點是否成功標記在了量子點上；熒光掃描法是量子點及其偶聯(lián)物在同一激發(fā)波長下使量子點及其偶聯(lián)物在一定范圍內(nèi)發(fā)射一定的波長后波峰會發(fā)生一定的改變，熒光強度可能增加或降低來鑒定偶聯(lián)效果；斑點印跡法實施根據(jù)抗原抗體反應原理，使熒光抗體和包被的抗原發(fā)生反應，在通過洗滌除去未反應的分子，最后通過觀察顏色變化來進一步判斷量子點抗體偶聯(lián)物是否偶聯(lián)成功；SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法是依靠表面活性劑十二烷基硫酸鈉(C12H25-OSO3Na)，將蛋白質(zhì)的某些氫鍵、疏水鍵打開，并結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上，去掉電荷效應最后根據(jù)遷移率得出分子量，鑒定抗體上是否偶聯(lián)了量子點；瓊脂糖凝膠電泳依據(jù)它自身產(chǎn)生的電荷效應和分子篩效應以瓊脂糖作為電泳介質(zhì)。根據(jù)不同電荷在電場中受力不同而產(chǎn)生不同的泳道把物質(zhì)分開來鑒別是什么物質(zhì)；免疫學方法是通過間接法來測定偶聯(lián)抗體的效價，來分析量子點抗體偶聯(lián)是否成功。因為電泳法操作時間長且過程繁瑣到導致操作起來不方便且毒性大，所以本試驗綜合各方面考慮選擇了紫外熒光掃描法、熒光掃描法、斑點印跡法、免疫學這4種方法來鑒定量子點是否成功標記在了鹽酸克倫特羅多克隆抗體上。

5 結(jié)論

本試驗通過EDC(碳亞二胺)和NHS(N-羥基琥珀酰亞胺)偶聯(lián)劑的活化作用將純化后的CdTe/ZnS量子點和鹽酸克倫特羅多克隆抗體共價偶聯(lián)成熒光復合物，并經(jīng)過紫外分光光度計分別掃描其最大吸收峰、熒光分光光度計掃描其發(fā)射峰和熒光強度、斑點法觀察抗原抗體特異性結(jié)合現(xiàn)象鑒定了水溶性羧基量子點穩(wěn)定的熒光特性，抗體的生物活性，證明了量子點成功標記了抗體，總之，本次研究結(jié)果可進行下一步試驗，為多殘留檢測試劑盒和試紙條應用研究提供了重要的依據(jù)。

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