薩吉達木·艾則孜，趙志強，阿孜古麗·阿不力孜，馬依努爾·米吉提，郭慶元

(新疆農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，烏魯木齊　830052)

0　引 言

【研究意義】棉花(GossypiumhirsutumL.)是世界范圍內(nèi)主要的經(jīng)濟作物。我國棉花總產(chǎn)量居世界前列。新疆又是我國最大的棉花生產(chǎn)基地，棉花產(chǎn)量一直穩(wěn)居全國首位[1]。但是，由于新疆棉花種植面積大，植棉區(qū)相對固定，棉花長期連作，棉花立枯病、黃萎病等土傳根莖部病害發(fā)生越來越重，常常造成一些棉區(qū)的嚴重減產(chǎn)，甚至絕收，嚴重影響了棉花的產(chǎn)量和品質(zhì)。根據(jù)多年調(diào)查，新疆棉區(qū)主要根莖部病害種類有立枯病、紅腐病、枯萎病、黃萎病等，是田間缺苗減產(chǎn)的主要因素[2-3]。因此，研究分析新疆棉花主要病原菌的分布，對各地有針對性地控制這類病害及確保棉花優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)有著極其重要的意義?！厩叭搜芯窟M展】1918年Atkinson[4]首次報道了在美國亞拉巴馬州發(fā)現(xiàn)棉花枯萎病，其病原為尖孢鐮刀菌萎蔫?；?病原：Fusariumoxysporumf. p. vasinfectum (AtK) Snyd et Hans)。2006年Abd-Elsalam等[5]設(shè)計了一對438 bp的檢測棉花枯萎病菌的特異性引物Fov1-Eg-f/ Fov1-Eg-r，2008年陳文霞[6]用這對尖孢鐮刀菌棉花專化型的特異性引物對棉花枯萎病菌基因 DNA 進行檢測，并表明該對引物特異性較強、檢出率較高。大麗輪枝菌(VerticilliumdahliaeKleb．)和黑白輪枝菌(VerticilliumalbatrumReinke & Berthold)均可侵染棉花根部，引起棉花黃萎病[7]。20世紀中國學者在全國范圍內(nèi)的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，主要棉區(qū)的棉花黃萎病菌以大麗輪枝菌為主[8]。1998年朱有勇等[9]根據(jù)大麗輪枝菌核糖體基因區(qū)段(rDNA ITS)的堿基編碼序列，設(shè)計324 bp特異性引物P1/P2對該菌進行擴增，能特異性地檢測棉花植株中的大麗輪枝菌；2016年龐莉等[10]，采用聚合酶鏈式反應(yīng)(Polymerase chain reaction，PCR) 檢測技術(shù)對已報道大麗輪枝菌的檢測引物進行驗證、篩選和改進，獲得1對改進的特異性PCR引物VDS-F/VDS-R。立枯病(病原：RhizoctoniasolaniKohn)，又稱爛根、黑根病，是棉花苗期的主要病害病[11]。2012年鄭培娥等[12]利用立枯絲核菌的另一對特異性引物RSF/RSR檢測出了大豆根腐病的病原中的立枯絲核菌，但靈敏度較低，僅1 ng/μL；劉萍花等[13]用立枯絲核菌的特異性引物RSF/RSR檢測出了苜蓿根腐病的病原立枯絲核菌；2012年姜騰飛[14]使用設(shè)計的立枯絲核菌特異引物RsW1/RsW2檢出了棉花植株內(nèi)的立枯絲核菌。棉花紅腐病(病原：FusariummoniliformeSheld)。2015年王曉英等[15]利用串珠鐮刀菌種特異性引物Fu5/Fu4(Ⅰ型ITS2特異性)和Fu3/Fu2(Ⅱ型ITS2特異性)，建立了串珠鐮刀菌PCR及復(fù)合PCR檢測方法?！颈狙芯壳腥朦c】目前，針對棉花枯萎病和黃萎病的分子檢測研究較多，而關(guān)于棉花立枯病和棉花紅腐病的特異性引物PCR檢測、通過特異性引物PCR檢測方法確定棉花主要病原菌分布情況的研究鮮有報道。研究利用已報道的棉花4種主要病原菌的特異性引物經(jīng)特異性驗證和靈敏度測定后，對所采集的以村(連)為單位的病株混合樣品進行特異性引物PCR檢測。【擬解決的關(guān)鍵問題】研究引物驗證及體系的優(yōu)化建立適于棉花病株樣品中目標病原菌檢測的分子檢測體系，通過對各地棉花病株樣品的分子檢測分析，了解棉花主要根莖部病害的病原種類及各自所致病害在新疆北部的分布。

1　材料與方法

1.1　材 料

1.1.1采樣

調(diào)查時間為2016年5月初至7月下旬及2017年5月初至7月下旬，調(diào)查及采樣范圍為新疆北部各棉花主栽區(qū)，包括塔城地區(qū)烏蘇市、奎屯市附近團場、沙灣縣及附近團場；博州地區(qū)博樂市、精河縣及附近團場、石河子市及附近團場；昌吉州的昌吉市、瑪納斯縣、呼圖壁縣附近團場，合計5市、4縣、17團場，共有9個市縣級(含附近團場)的采樣區(qū)域。

1.1.2供試病株樣品

棉花子葉期至蕾鈴期，從北疆各地，按每個市、縣(團)3個村(連)，每村(連)3個棉田進行調(diào)查，每田選擇5個采樣點，每采樣點隨機選擇30穴采集病樣，并按每田1份病株樣品(15個病株以上)進行采樣。在室內(nèi)將病株樣品干燥后，接每村(連)3塊田，每田選取5個病株，合計15株，經(jīng)沖洗，風干后剪取根部感病部位(約50 mm長)，剪碎(約1 mm大小)，混勻，制成以村(連)為單位的病株混合病樣，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3供試菌株

立枯絲核菌(菌株號：RBHS15-112、RAKP15-211)、尖孢鐮刀菌(菌株號：FKBC15-112、FKZAKT15-212)、串珠鐮刀菌(菌株號：FBYL15-111、FKYPH15-111)、大麗輪枝菌(菌株號： VB811-41、V991-33)、各菌2菌株。均為前期研究工作中，從新疆棉花病樣中分離純化并經(jīng)致病力測定后確定的主要病原菌，由新疆農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院植物病理實驗室分離、鑒定并提供，用作分子檢測過程中陽性對照。鏈格孢霉(菌株號：An11-23、An11-45)、茄腐鐮刀菌(菌株號：FS12-93)、黑曲霉(菌株號：Aa15-8)、匍枝根霉(菌株號：RN12-95)，各菌2菌株。為病原菌分離中常出現(xiàn)的非致病菌，由新疆農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院植物病理實驗室分離、鑒定并提供，用于引物特異性檢測。

1.1.4供試培養(yǎng)基及供試引物

供試培養(yǎng)基為PSA斜面培養(yǎng)基和平板培養(yǎng)基，用于各菌株的保存和擴繁。

供試引物為通過文獻收集，并經(jīng)引物特異驗證后優(yōu)選的4種病原菌的4對特異性引物，分別為：大麗輪枝菌特異性引物VDS-F/VDS-R[10]、尖孢鐮刀菌棉花?；吞禺愋砸颋ov1-Eg-f/ Fov1-Eg-r[5]、立枯絲核菌特異性引物RSF/RSR[13]和串珠鐮刀菌特異性引物FUS1/FUS2[16]。 4種引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成、提供。表1

表1經(jīng)驗證后的4種主要病原菌的特異性檢測引物
Table1Specific primer for detection of 4 main pathogens

引物名稱Primer引物序列(5′-3′)DNAsequenceofprimer檢測對象Detectionobject片段大小Fragmentsize(BP)退火溫度Tm(℃)來源SourceRSFGCACACTCTTCTCTTTCATCCA立枯絲核菌RSRTTAGAAGCGGTTCGTCTGCAR．solaniFov1-Eg-fCCACTGTGAGTACTCTCCTCG尖孢鐮刀菌Fov1-Eg-rCCCAGGCGTACTTGAAGGAACF．oxysporumFUS1CTTGGTCATGGGCCAGTCAAGAC串珠鐮刀菌FUS2CACAGTCACATAGCATTGCTAGCCF．moniliformeVDS-FCACATTCAGTTCAGGAGACG大麗輪枝菌VDS-RCCGAAATACTCCAGTAGAAGGV．dahliae541594386216006052056生工生物工程(上海)有限公司

1.1.5設(shè)備與試劑

供試設(shè)備主要有：PCR擴增儀(VERITI 2.0)、高速冷凍離心機(AIIegra 25R)、電泳儀(HE99)、凝膠成像系統(tǒng)(G: BOXEF)、紫外透射儀(WD-9403C)等。

供試試劑主要有：瓊脂糖、1%的TAE溶液、2000D ladder marker、 2XtapPCR Master mix、ddH20，以及植物總 DNA 提取試劑盒(DP320，由生工生物工程(上海)有限公司提供)

1.2　方 法

1.2.1檢測體系建立

1.2.1.1DNA提取

將各供試菌株分別接種于PSA平板培養(yǎng)基上，27℃恒溫培養(yǎng)5～12 d后，刮取菌絲約0.3 g放入1.5 mL離心管中，40℃，12 h烘干后，-20℃保存?zhèn)溆茫粎⒄盏闹参锟?DNA 提取試劑盒上的操作說明進行菌株DNA提取。

1.2.1.2特異性引物驗證

分別使用4種病原菌的引物RSF/RSR、FUS1/FUS2、VDS-F/VDS-R和Fov1-Eg-f/ Fov1-Eg-r對8個供試菌株立枯絲核菌、串珠鐮刀菌、大麗輪枝菌、尖孢鐮刀菌、鏈格孢霉(AlternariaAlternata)、茄腐鐮刀菌(Fusariumsolani(Mart.) Sacc.)、黑曲霉(Aspergillusniger)、匍枝根霉(Rhizopusstolonifer) 的單一DNA樣品、病株總DNA樣品、健康植株(CK)的DNA樣品進行PCR擴增和電泳分析。根據(jù)電泳條帶的清晰度及唯一性對上述引物的特異性和適用性進行驗證。病株總DNA樣品是用預(yù)備實驗中經(jīng)單一病原菌接種后獲得的病株所制備的DNA樣品，用作特異性驗證中的陽性對照和田間病株檢測效果分析。

1.2.1.3PCR反應(yīng)體系優(yōu)化及靈敏度測定

Abd-Elsalam等[5]及趙宗峰等[17]報道的PCR反應(yīng)體系，利用梯度PCR優(yōu)化退火溫度。

以ddH20稀釋菌株DNA至質(zhì)量終濃度分別為：10、5、2、1、0.5、0.2和0.1 ng/μL，并以無菌水為陰性對照，利用各病原菌對應(yīng)的引物在不同DNA模板濃度及同上的PCR反應(yīng)體系中進行PCR擴增和電泳分析，然后根據(jù)不同DNA模板濃度下，清晰條帶的出現(xiàn)情況進行檢測靈敏度分析。

1.2.1.4田間樣品檢測

從制備的病株混合樣品中各取適量(0.3 g)病株碎塊分別裝入1.5 mL離心管中，提取總DNA (DNA提取方法和步驟同1.7.1)?；旌蠘悠返目侱AN分別用不同的特異性引物進行PCR擴增及電泳分析，根據(jù)電泳中陽性條帶出現(xiàn)情況分析各病原菌在各地病樣及所有病樣中的檢出率。

2　結(jié)果與分析

2.1　PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化及檢測體系的建立

參考Abd-Elsalam等[5]及趙宗峰等[17]報道的PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序，結(jié)合引物合成報告單上提供的相關(guān)參數(shù)，經(jīng)改進后建立了研究的PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序。表2，表3

研究表明，RSF/RSR、FUS1/FUS2、VDS-F/VDS-R和Fov1-Eg-f/Fov1-Eg-r 4對引物僅在4種病原菌 [立枯絲核菌(R.solani)、串珠鐮刀菌(F.moniliforme)、大麗輪枝菌(V.dahliae)和尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)] 的DNA樣品中分別擴增出約540、1 600、520和438 bp特異性片段，在感病植株陽性DNA樣品中也能擴增出與感染菌相應(yīng)的特異性片段，陰性對照及其它非病原菌菌株和健康植株樣品均無任何擴增產(chǎn)物，由此說明，這4對引物具有較強的特異性，且不受寄主DNA的干擾。圖1

研究表明，當串珠鐮刀菌的DNA模板濃度為0.1 ng/μL以上，其他3種病原菌的DNA模板濃度為0.5 ng/μL以上時，均可以擴增出各自穩(wěn)定的特異性條帶，說明該反應(yīng)體系下檢測靈敏度等于或高于0.5 ng/μL。其靈敏度較高，可用于棉花根莖部病害病原菌的分子檢測。圖2

表2PCR反應(yīng)體系
Table2PCR reaction system

25μL反應(yīng)體系25μLreactionsystem(μL)2xtapPCRMastermix13ddH2O910μmol/L正向引物Forwardprimer10μmol/L110μmol/L反向引物Reverseprimer10μmol/L1植株總DNATotalplantDNA1

表3四種特異性引物的PCR反應(yīng)程序
Table3PCR reaction program of 4 kinds of specific primer

步驟Step溫度Tm(℃)時間Time循環(huán)數(shù)CycleNumber預(yù)變性AninitialDNAmelting953min變性DNAmelting9445s退火AnnealingFOV1-EG-F/FOV1-EG-R621minVDS-F/VDS-R5650sRSF/RSR5945sFUS1/FUS26045s延伸Extension721min32再延伸Finalextension7210min保存Keep4

注：A引物FUS1/FUS2的特異性檢測；B引物Fov1-Eg-f / Fov1-Eg-r的特異性檢測；C引物VDS-F/VDS-R的特異性檢測；D引物RSF/RSR的特異性檢測；M：2000D Ladder Maker；1～9：串珠鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、大麗輪枝菌、立枯絲核菌、鏈格孢霉、茄腐鐮刀菌、黑曲霉、匍枝根霉、發(fā)病植株混合樣品；CK：健康植株DNA(陰性對照)

Note: A: Detect the specificity of primers FUS1/FUS2; B: Detect the specificity of primers FSF/FSR; C: Detect the specificity of primers VDS-F/VDS-R; D: Detect the specificity of primers Fov1-Eg-f/Fov1-Eg-r; M: 2000D Ladder Maker; 1-9:R.solani、F.moniliforme、V.dahliae、F.oxysporum、A.Alternata、F.solani、A.niger、R.stolonifer、Mixed sample; CK: Healthy plant DNA (negative control)

圖1四種引物特異性檢測結(jié)果
Fig.1Detectionresultof4primersspecificity

注：A 立枯絲核菌特異性引物的靈敏度檢測；B 串珠鐮刀菌特異性引物的靈敏度檢測；C 大麗輪枝菌特異性引物的靈敏度檢測；D 尖孢鐮刀菌特異性引物的靈敏度檢測；M：2000D ladder maker；CK：陰性對照；1～7：10、5、2、1、0.5、0.2、0.1 ng/μL

A: Test result ofRhizoctoniasolani; B: Test result ofFusariummoniliforme; C: Test result ofVerticilliumdahliae; D: Test result ofFusariumoxysporum; M: 2000D Ladder Marker; CK: Negative Contro; 1-7: 10、5、2、1、0.5、0.2、0.1 ng/μL

圖2四種特異性引物靈敏度檢測結(jié)果
Fig.2Sensitivity test result of 4 specific primers

2.2　病原菌種類及分布

使用4對特異性引物(RSF/RSR、Fov1-Eg-f/Fov1-Eg-r、VDS-F/VDS-R、FUS1/FUS2)對采自新疆北部棉區(qū)的棉花根莖部病害的病樣進行的特異性引物PCR分子檢測結(jié)果顯示：在72份以村(連)為單位的棉花根部混合病樣中各種病原菌的檢出率分別為：尖孢鐮刀菌84.72%、立枯絲核菌56.94%、大麗輪枝菌45.83%、串珠鐮刀菌37.50%。說明在新疆北部棉花4種根莖部病害病原菌(尖孢鐮刀菌、大麗輪枝菌、立枯絲核菌和串珠鐮刀菌)皆有其存在和分布，并能侵入棉株引起一定程度的擴展，其中，尖孢鐮刀菌和立枯絲核菌為分布較廣的優(yōu)勢種。這一結(jié)果與前期病害田間調(diào)查情況及相關(guān)的研究和報道基本吻合[18]。

各病原菌的發(fā)生分布情況有較大的差別。其中，尖孢鐮刀菌在所有市縣級(含附近團場)采樣區(qū)域的樣品中都有較高的檢出率，檢出率在66.7%～100%，在72個混合病樣中有61個被檢測到，說明尖孢鐮刀菌及所引起的枯萎病在新疆北部的發(fā)生分布廣泛；立枯絲核菌在所有市縣級(含附近團場)采樣區(qū)域的樣品中也都有一定的檢出率，但檢出率差別較大，在25%～100%，在72個混合病樣中有41個被檢測到，其中，瑪納斯縣(含附近團場)檢出率達到100%、博樂市(含附近團場)以及石河子市(含附近團場)檢出率都達到80%，而烏蘇市的檢出率僅為25%，說明立枯絲核菌及所引起的立枯病也有廣泛的發(fā)生分布，但分布不均，有一定的地域差異；大麗輪枝菌在9個市縣級(含附近團場)采樣區(qū)域中也都有一定的檢出率，檢出率為8.33%～100%，在72個混合病樣中有33個被檢測到，其中在博樂市(含附近團場)檢出率最高，達到100%，檢測出率高于50%的有在精河縣(含附近團場)、石河子市(含附近團場)、呼圖壁縣(含近團場)、瑪納斯縣(含附近團場)，而在烏蘇市和奎屯市(含附近團場)檢出率較低，分別為16.67%和8.33%，說明大麗輪枝菌及所引起的黃萎病在多數(shù)市縣(含附近團場)分布普遍，而在個別縣市(含附近團場)只有少量分布，在其發(fā)生分布上也有較強的區(qū)域性；串珠鐮刀菌在9個采樣區(qū)域中的7個采樣區(qū)域能檢出，檢出率在0～75%，但在沙灣縣(含附近團場)檢出率最高，到達75%， 石河子市附近團場的檢出率次之(53.33%)，而精河縣(含附近團場)和博樂市(含附近團場)的檢出率為0%，說明串珠鐮刀菌及所引起的紅腐病分布不廣，其分布有更強的地域性，在沙灣縣(含附近團場)發(fā)生最為集中，石河子市(含附近團場)也有較高頻的分布，其他采樣區(qū)域只有較低頻率分布或暫未檢測到該菌的分布。

從各市縣(含附近團場)的病原菌檢出情況來看，在石河子市(含附近團場)、呼圖壁縣、沙灣縣(含附近團場)、昌吉市和瑪納斯縣(含附近團場)4種病原菌及所致病害皆有較廣的分布；博樂市(含附近團場)和精河縣(含附近團場)均未檢測到紅腐病病原，但其他3種根莖部病害有較廣的分布；烏蘇市和奎屯市附近團場，雖然4病皆有，但除尖孢鐮刀菌及所引起的枯萎病有較廣的分布外，其他3種病原菌及所致病害的分布均較窄。表4，圖3

表4各采集地棉花4種主要病原菌檢測結(jié)果
Table4Detection rate of 4 main pathogens of Cotton of each collection

采樣地點Collectionplace4種主要病原菌的檢出情Detectedsituationof4mainpathogens尖孢鐮刀菌F．oxysporum立枯絲核菌R．solani大麗輪枝菌V．dahliae串珠鐮刀菌F．moniliforme大西溝鎮(zhèn)大西溝村DaxigouVillage，DaxigouTown+---大西溝鎮(zhèn)扎哈山村ZahashanVillage，DaxigouTown+---大西溝鎮(zhèn)大西溝DaxigouVillage，DaxigouTown-+--四棵樹鎮(zhèn)索呼仁呼都格SuohurenhudouVillage，SikeshuTown-++-四棵樹鎮(zhèn)哈勒干布拉格村Haligan-bulageVillage，Sikeshutown+---四棵樹鎮(zhèn)哈爾莫墩布拉格Haermo-dunbulaVillage，Sikeshutown+---百泉鎮(zhèn)浩特浩爾村HaotehaoerVillage，Baiquantown+---百泉鎮(zhèn)哈圖布呼村HatubuhuVillage，Baiquantown+--+百泉鎮(zhèn)喇嘛布愣村LamabulenggeVillage，Baiquantown+++-石橋鎮(zhèn)榆樹村YushuVillage，Shiqiaotown，+--+石橋鎮(zhèn)東梁村DongliangVillage，Shiqiaotown+---石橋鎮(zhèn)葫梁村HuliangVillage，ShiqiaoTown---+烏蘇市合計檢出率ThetotaldetectionrateofWusucity(%)752516．6725茫丁鄉(xiāng)小莊子村XiaozhuangziVillag，MangdingTownship+++-茫丁鄉(xiāng)夾巴溝村BajiagouVillage，Mangdingtownship+---茫丁鄉(xiāng)蘑菇灘村MogutanVillage，MangdingTownship++--八家戶農(nóng)場82團3連No．3company，82Regiment，BajiahuFarm+-+-八家戶農(nóng)場82團6連No．6company，82Regiment，BajiahuFarm+++-八家戶農(nóng)場82團9連No．9company，82Regiment，Bajiahufarm+---精河縣及附近團場合計檢出率ThetotaldetectionrateofJinghecountyandneartheregiment(%)10050500青得里鄉(xiāng)浩特呼爾村HaotehuerVillage，QingdeliTownship+++-90團11連No．11company，90Regiment+++-90團12連No．12company，90Regiment--+-86團5連No．5company，86Regiment+++-89團1連No．1company，89Regiment+++-博樂市及附近團場合計檢出率ThetotaldetectionrateofBolecityandandneartheregiment(%)80801000123團7連No．7company，123Regiment++--123團2連No．2company，123Regiment+---123團3連No．3company，123Regiment+---124團6連No．6company，124Regiment+---124團7連No．7company，124Regiment+--+124團3連No．3company，124Regiment-+--

續(xù)表

表4各采集地棉花4種主要病原菌檢測結(jié)果
Table4Detection rate of 4 main pathogens of Cotton of each collection

采樣地點Collectionplace4種主要病原菌的檢出情Detectedsituationof4mainpathogens尖孢鐮刀菌F．oxysporum立枯絲核菌R．solani大麗輪枝菌V．dahliae串珠鐮刀菌F．moniliforme126團4連No．4company，126Regiment+---126團2連No．2company，126Regiment++--126團9連No．9company，126Regiment++-+131團6連No．6company，131Regiment---+131團4連No．4company，131Regiment+---131團5連No．5company，131Regiment++++奎屯市附近團場合計檢出率ThetotaldetectionrateofneartheregimentofKuituncity(%)83．3341．678．3333．33安集海鎮(zhèn)AnjihaiTown++-+四道河子鎮(zhèn)SidaoheziTown+--+西戈壁鎮(zhèn)XigebiTown+--+大泉鄉(xiāng)大泉村DaquanVillage，DaquanTownship+-++大泉鄉(xiāng)東泉村DongquanVillage，DaquanTownship++--大泉鄉(xiāng)中泉村Zhongquanvillage，DaquanTownship-+++143團19連No．19company，143Regiment++--143團6連No．6company，143Regiment++-+143團21連No．21company，143Regiment+--+144團農(nóng)6連No．6company，144Regiment+++-144團15連No．15company，144Regiment++++144團3連No．3company，144Regiment+-++沙灣縣及附近團場合計檢出率ThetotaldetectionrateofShawancountyandneartheregiment(%)91．1658．3341．6775北泉溝村BeiquangouVillage++++石河子鄉(xiāng)東橋村DongqiaoVillage，shiheziTownship-+--石河子鄉(xiāng)馬家坪村MajiapingVillage，ShiheziTownship++++148團6連No．6company，148Regiment+--+148團9連No．9company，148Regiment++++148團3連No．3company，148Regiment++--145團18連No．18company，145Regiment+++-145團11連No．11company，145Regiment++++145團25連No．25company，145Regiment-++-122團2連No．2company，122Regiment++++122團25連No．25company，122Regiment+--+122團15連No．15company，122Regiment+++-133團1連No．1company，133Regiment+++-133團3連No．3company，133Regiment---+133團10連No．10company，133Regiment+++-石河子市及附近團場合計檢出率ThetotaldetectionrateofShihezicityandneartheregiment(%)808066．6753．33芳草湖總場TotalField，F(xiàn)angcaohuTown+++-芳草湖農(nóng)場7連7Campany，F(xiàn)angcaohuTownFarm++++新湖總場1連TotalFieldof1，XinhuTown+-+-新湖四場6連FourFieldof6，XinhuTown+---

續(xù)表

表4各采集地棉花4種主要病原菌檢測結(jié)果
Table4Detection rate of 4 main pathogens of Cotton of each collection

采樣地點Collectionplace4種主要病原菌的檢出情Detectedsituationof4mainpathogens尖孢鐮刀菌F．oxysporum立枯絲核菌R．solani大麗輪枝菌V．dahliae串珠鐮刀菌F．moniliforme呼圖壁縣附近團場合計檢出率ThetotaldetectionrateofneartheregimentofHutubicounty(%)100507525六地戶鎮(zhèn)LiudihuTown-+++北五鎮(zhèn)BeiwuTown，+++-150團111連No．111company，150Regiment++--瑪納斯縣及及附近團場合計檢出率ThetotaldetectionrateofManasicountyandneartheregiment(%)66．6710066．6733．33榆樹溝鎮(zhèn)前進村QianjinVillage，YushugouTown++--榆樹溝鎮(zhèn)榆樹溝村YushugouVillage，YushugouTown+-+-二六工鎮(zhèn)SangonghuVilage，HuyuancunTown++++昌吉市合計檢出率ThetotaldetectionrateofChangjicity(%)10066．6766．6733．33總檢出率TotalDetectionrate(%)84．7256．9445．8337．5

注：“+”表示檢測出該菌；“-”表示未檢出該菌

Note: “+” shows that the Pathogen is detected, “-” shows that the Pathogen is not detected

注：A：串珠鐮刀菌(F.moniliforme)；B：尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)；C：立枯絲核菌(R.solani)；D：大麗輪枝菌(V.dahliae)；M：2000D Ladder marker；CK：陽性對照；1～16：混合病樣

A:F.moniliforme; B:R.solani; C:F.oxysporum; D:V.dahliae; M: 2000D Ladder marker; CK: positive control; 1-16: Mixed sample

圖3部分混合樣品中4種病原菌檢測情況
Fig.3Detection of 4 pathogens in some mixed samples

3　討 論

利用4種棉花根莖部病害主要病原菌特異性引物對來自新疆北部的72份棉花根莖部病害混合病樣進行特異性引物PCR檢測的結(jié)果表明：尖孢鐮刀菌、大麗輪枝菌、立枯絲核、串珠鐮刀菌4種棉花主要根莖部病害病原菌在新疆北部棉花根莖部病害病樣均可檢出，說明4種病原菌及各自所致病害在新疆北部均有分布；但各病原菌的分布情況有較大的差別，其中尖孢鐮刀菌及引起的枯萎病分布最廣，立枯絲核菌次之，2種病原菌在新疆北部各采樣區(qū)域的大多數(shù)村(連)都有分布；大麗輪枝菌在各采樣區(qū)域以及近半數(shù)的村(連)都有分布，串珠鐮刀菌分布不廣，有明顯的區(qū)域性，僅個別采樣區(qū)域有較高頻的分布。

在病原菌監(jiān)測及病害分布調(diào)查中，傳統(tǒng)上采用癥狀觀察及病原菌分離鑒定方法，但這些方法人為因素影響較大，特別是有多種病原菌侵染的根莖部害的調(diào)查，容易產(chǎn)生癥狀上的誤判或分離過程中的人為誤差。研究采用分子檢測方法，能較準確的檢測出侵入植物體內(nèi)的病原菌的存在情況，避免了諸多干擾因素。在一定的靈敏度條件下，只對侵入并有一定的擴展形成較多菌體的病株產(chǎn)生陽性結(jié)果，能較好的排除干擾，反應(yīng)植株體內(nèi)的實際侵染情況。但在靈敏度不高時易出現(xiàn)漏檢的情況，如病原菌侵入不久，只有少數(shù)菌絲的時候，可能因檢測靈敏度不高而漏檢。該文中串珠鐮刀菌的檢測靈敏度為0.1 ng/μL。而其他3個病原菌的檢測靈敏度為0.5 ng/μL。靈敏度較高，其特異性引物檢測結(jié)果與田間病情調(diào)查時觀察到的情況較為接近。

4　結(jié) 論

通過特異性引物的PCR擴增可以準確地檢測出引起棉花根莖部病害的4種致病菌。在新疆北部地區(qū)4種病原菌都存在，尖孢鐮刀菌、立枯絲核菌和大麗輪枝菌在新疆北部檢出率較高，各市縣(含附近團場)都有一定的檢出率。其中尖孢鐮刀菌、立枯絲核菌的檢出率高于50%，分布廣。而大麗輪枝菌在博樂市和精河縣(含附近團場)、呼圖壁縣和瑪納斯縣(含附近團場)有較高的檢出率，另在沙灣縣(含附近團場)和烏蘇市有少數(shù)樣品被檢出，這種檢出率的差異可能與地域有關(guān)，也可能與采樣時間不同有一定的關(guān)系(因氣候條件和播期不同，采樣時苗齡不一致，而4種病原菌的侵染高峰期有一定的差異)。檢測結(jié)果中串珠鐮刀菌在部分地區(qū)檢出率高，而在另一些地區(qū)未檢測到，可能與不同地區(qū)的的氣候條件有密切的關(guān)系，因為串珠鐮刀菌的孢子萌發(fā)要求的濕度86%以上[19]，地下水位高，雨水較多，地表濕度大的地區(qū)(如沙灣及附近團場)，有利于串珠鐮刀菌的孢子萌發(fā)和對棉株的侵染，而地下水位低，雨水較少，地表的濕度小的地區(qū)(如精河縣及附近團場)，則不利于串珠鐮刀菌的孢子萌發(fā)和對棉株體內(nèi)的侵染，從而造成該菌及所致病害在分布上有極為顯著的區(qū)域性。

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