雒誠龍，邵 偉,，任萬平，趙艷坤，王東海，余 雄

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊　830052；2.新疆肉乳用草食動物營養(yǎng)重點實驗室，烏魯木齊　830052)

0　引 言

【研究意義】生物素是動物體內(nèi)一種重要的羧化酶，由于其可通過機體內(nèi)源合成，因此生物素缺乏現(xiàn)象極為罕見，這也造成了對生物素的研究相對較少。隨著研究的推進，近來發(fā)現(xiàn)生物素有助于機體促進正常糖脂代謝，并改善機體內(nèi)環(huán)境。但就細胞層面而言，生物素在糖脂代謝過程中對相關(guān)物質(zhì)究竟有何影響仍處在摸索階段。【前人研究進展】在脂肪細胞中，細胞會將多余的葡萄糖經(jīng)葡萄糖轉(zhuǎn)運體4(glucose transporter 4，GLUT-4)加速轉(zhuǎn)運至細胞內(nèi)[1]，并在己糖激酶(hexokinase，HK)、磷酸果糖激酶(phosphofructokinase，PFK)、丙酮酸激酶(pyruvate kinase，PK)等酶催化下轉(zhuǎn)化為丙酮酸，再經(jīng)轉(zhuǎn)化生成合成甘油三酯(triacylglyceride，TG)的前體物質(zhì)乙酰CoA[2]。乙酰CoA在經(jīng)過乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACC)、脂肪合成酶(fatty acid synthase，F(xiàn)AS)等一些列酶的催化下合成TG[2]，TG再經(jīng)轉(zhuǎn)運至細胞脂滴儲存[3]。生物素是機體內(nèi)必不可少的輔酶因子[4]，可參與或間接調(diào)控機體內(nèi)多項脂合成反應(yīng)[5]。已有研究證明，在奶牛日糧中添喂生物素可提高乳脂、乳糖含量[6]，生物素還可通過調(diào)節(jié)固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白調(diào)節(jié)細胞脂合成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達[7]，生物素亦可通過改善細胞狀態(tài)[8]，促細胞糖利用并向脂質(zhì)轉(zhuǎn)化?！颈狙芯壳腥朦c】前人對生物素的研究多集中于動物整體水平，而于細胞層面研究較少。研究在體外培養(yǎng)糖脂代謝活躍的3T3-L1脂肪細胞，并添加生物素進行干預(yù)，探究生物素對脂肪細胞中脂肪合成相關(guān)基因表達間的影響?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究不同生物素濃度對脂肪細胞中脂肪合成相關(guān)基因表達的影響，為更好的利用生物素調(diào)控脂肪細胞發(fā)育提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　材 料

1.1.1主要儀器

倒置顯微鏡、二氧化碳細胞培養(yǎng)箱、酶標儀、低速離心機、實時定量PCR儀。

1.1.2主要試劑

高糖DMEM培養(yǎng)基、油紅O染料、胰島素、地塞米松(DEX)、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)，吲哚美辛，胰蛋白酶、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、qPCR試劑盒、引物由上海博谷生物科技公司合成。

1.2　方 法

1.2.1試驗設(shè)計

按單因素試驗設(shè)計，在細胞培養(yǎng)液中加入不同劑量的生物素為試驗組，使培養(yǎng)基內(nèi)生物素濃度分別達0 μmol/L、0.2 μmol/L、0.5 μmol/L、1 μmol/L，每組試驗3個平行樣，每個平行樣3次重復(fù)，分別在12 h、24 h、48 h時，檢測細胞上清液中甘油釋放量及細胞內(nèi)GLUT-4、PK、FAS及ACC1 mRNA的相對表達量。

1.2.23T3-L1前脂肪細胞株的培養(yǎng)與分化[9]

將3T3-L1前脂肪細胞株用含10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。待細胞長滿培養(yǎng)瓶底壁時，將細胞接種于6孔培養(yǎng)板中，待細胞長滿2 d后，加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基及含0.5 mmol/L IBMX、0.25 μmol/L DEX、10 mg/L胰島素的分化液，培養(yǎng)48 h，再以含10 mg/L胰島素的培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，然后用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每隔2 d換液1次，誘導(dǎo)分化8～12 d后，待90%以上的3T3-L1細胞呈脂肪細胞表型再進行下一步處理。

1.2.3添加不同濃度生物素干預(yù)

將誘導(dǎo)分化好的脂肪細胞以1×105/mL接種于24孔板，用完全培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h，待細胞完全貼壁后，換不同濃度生物素培養(yǎng)基孵化。各組培養(yǎng)基中生物素濃度為0(對照組)、0.2、0.5、1 μmol/L，每組設(shè)3個平行復(fù)孔，每孔設(shè)3個平行。

1.2.4實時熒光定量方法[10]

參照試劑盒說明書提取各組細胞總RNA，全自動酶聯(lián)免疫分析儀測出RNA濃度以及OD260nm/OD280nm，以提取的總RNA為模板，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書(10 μL，37℃ 15 min，85℃ 5 s)合成cDNA。RCR按20 μL反應(yīng)體系進行，反應(yīng)條件：95℃ 30 s變性，95℃ 5 s，60℃ 31 s，50個循環(huán)，上機自動分析熒光信號，并將其轉(zhuǎn)換Ct值，采用ΔΔCt法分析，以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參基因計算GLUT-4、PK、FAS、ACC1 mRNA相對定量值(2-ΔΔCt)?；蛐蛄芯鶑腉enbank中獲取，引物用Primer 5.0軟件進行設(shè)計，由上海博谷生物科技有限公司合成。表1

1.2.5熒光定量PCR引物(表1)

1.3　數(shù)據(jù)處理

所有原始數(shù)據(jù)先用Excel 2016進行整理，用SPSS 22軟件進行單因素方差分析，并用Duncan法進行多重比較。以P<0.05作為差異顯著性判斷標準，P<0.01作為差異極顯著判斷標準。數(shù)據(jù)統(tǒng)計的最終結(jié)果用平均值±標準差表示。

表1定量PCR 引物信息
Table1Primer sequences of Real-time fluorescent quantitative PCR

基因名稱Genename引物序列Primersequences(5’-3’)擴增長度Amplificationlength(bp)退火溫度Annealingtemperature(℃)GLUT-4F：CACCGGCAGCCTCTGATCR：TAAGAGCACCGAGACCAACG18059PKF：TGGATGGGGCTGACTGTATCR：CGTAGCTCCTCAAACAACTGG13958ACC1F：CATCGATAACCCTTCAGCAGAGR：GCCTCGGTTTTGTCGTCC15959FASF：GGGCTACAGAGATGGACTTCGR：AGGCAGCCACTCCAACAAG19059GAPDHF：GAGAAACCTGCCAAGTATGATGR：AGAGTGGGAGTTGCTGTTGAAG12959

2　結(jié)果與分析

2.1　生物素濃度對細胞GLUT-4 mRNA表達量的影響

研究表明，在試驗12 h時，各試驗組GLUT-4 mRNA相對表達量均顯著(P<0.05)高于對照組；在試驗24 h時，1 μmol/L組GLUT-4 mRNA相對表達量顯著(P<0.05)高于0.2 μmol/L與對照組；在試驗48 h時，1 μmol/L組GLUT-4 mRNA相對表達量顯著(P<0.05)高于對照組。圖1

注：同列數(shù)據(jù)肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；肩標不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)；肩標相同字母或無字母標注表示差異不顯著(P>0.05)[10]，下同

Note: data in the same column of the shoulder mark different lowercase letters indicate a significant difference (P< 0.05); shoulder standard different capital letters show very significant difference (P< 0.01); shoulder standard the same letter or letter annotation denotes the difference was not significant (P> 0.05).The same as below

圖1不同生物素濃度下細胞GLUT-4 mRNA表達量變化
Fig.1The Impact of Various Biotin Concentrations on GLUT-4 mRNA Expression Quantity of Cells

2.2　生物素濃度對細胞PK mRNA表達量的影響

研究表明，在試驗12 h時，各試驗組PK mRNA相對表達量均顯著高(P<0.05)于對照組，其中1 μmol/L組PK mRNA相對表達量極顯著(P<0.01)高于對照組、0.2 μmol/L組及0.5 μmol/L組，與之相比分別提升了58.9%、39.1%與29.9%；在試驗24 h時，1 μmol/L組PK mRNA相對表達量顯著(P<0.05)高于對照組；在試驗48 h時，1 μmol/L 組PK mRNA相對表達量極顯著(P<0.01)高于對照組。圖2

圖2不同生物素濃度下細胞PK mRNA表達量變化
Fig.2The Impact of Various Biotin Concentrations on PK mRNA Expression Quantity of Cells

2.3　生物素濃度對細胞FAS mRNA表達量的影響

研究表明，在試驗12 h時，1 μmol/L組與0.5 μmol/L組FAS mRNA相對表達量極顯著(P<0.01)高于于對照組與0.2 μmol/L組；在試驗24 h時，各試驗組FAS mRNA相對表達量與對照組間差異不顯著；在試驗48 h時，0.5 μmol/L組FAS mRNA相對表達量極顯著(P<0.01)高于對照組，并顯著(P<0.05)高于1 μmol/L組。圖3

圖3不同生物素濃度下細胞FAS mRNA表達量變化
Fig.3The Impact of Various Biotin Concentrations on FAS mRNA Expression Quantity of Cells

2.4　生物素濃度對細胞ACC1 mRNA表達量的影響

研究表明，在試驗12 h時，1 μmol/L組、0.5 μmol/L組與0.2 μmol/L組ACC1 mRNA相對表達量極顯著(P<0.01)高于對照組；在試驗24 h時，1 μmol/L組ACC1 mRNA相對表達量極顯著(P<0.01)高于對照組，0.2 μmol/L組與0.5 μmol/L組ACC1 mRNA相對表達量顯著(P<0.05)高于對照組；在試驗48 h時，1 μmol/L組ACC1 mRNA相對表達量極顯著高于對照組與0.2 μmol/L組，0.5 μmol/L組ACC1 mRNA相對表達量顯著(P<0.05)高于對照組與0.2 μmol/L組。圖4

圖4不同生物素濃度下細胞ACC1 mRNA表達量變化
Fig.4The Impact of Various Biotin Concentrations on ACC1 mRNA Expression Quantity of Cells

3　討 論

葡萄糖跨膜轉(zhuǎn)運是脂肪細胞吸收利用葡萄糖的主要限速步驟之一[11]。研究表明，這一步驟是依靠細胞膜上的特殊轉(zhuǎn)運蛋白來完成的[12]，這種特殊的轉(zhuǎn)運蛋白便是葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白。而脂肪細胞中的轉(zhuǎn)運蛋白主要以GLUT-4為主[13]。該試驗結(jié)果中：添加生物素的試驗組在12、24、48 h時GLUT-4 mRNA 相對表達量均高于對照組，這表明生物素的添加可以提高GLUT-4 mRNA的表達。而三個生物素試驗組中，1 μmol/L組在24 h及48 h時的GLUT-4 mRNA相對表達量高于0.2 μmol/L組及0.5 μmol/L組，其中24 h時極顯著(P<0.05)高于0.5 μmol/L組，雖然在12 h時GLUT-4 mRNA相對表達量低于0.5 μmol/L，但差異并不顯著。這就表明在48 h內(nèi)以1 μmol/L濃度作用脂肪細胞對提升細胞中GLUT-4的相對表達效果最佳。GLUT-4作為葡萄糖轉(zhuǎn)運的主要蛋白，其表達量地提升可以細胞對葡萄糖地吸收[14]并可改善脂肪細胞的胰島素抵抗現(xiàn)象[15]。推測當進入胞內(nèi)的葡萄糖越多，用于合成TG的前體物質(zhì)可能會隨之增加，使TG沉積量提升。而當細胞胰島素抵抗得到緩解時，細胞對相應(yīng)細胞因子的感受可能會得到提升，加速細胞內(nèi)TG沉積。以1 μmol/L濃度生物素作用脂肪細胞時，可通過提升GLUT-4的表達進而達到促TG沉積的目的。

當葡萄糖進入細胞后經(jīng)糖酵解產(chǎn)生丙酮酸，再經(jīng)各類酶催化逐步轉(zhuǎn)變?yōu)楦视腿ゴ鎯τ诩毎斨衃2]。PK作為糖酵解過程中關(guān)鍵酶，也是整個過程的關(guān)鍵限速酶之一[2]。在試驗結(jié)果中：添加了生物素的試驗組在12、24及48 h時PK mRNA相對表達量均高于對照組，這說明生物素的添加會提高細胞中PK mRNA相對表達量。而在添加了生物素的三個試驗組中，1 μmol/L組在12、24及48 h時PK mRNA相對表達量均高于0.2 μmol/L組及0.5 μmol/L組，尤其是在12 h時差異極顯著(P<0.01)，這就說明在48 h內(nèi)以1 μmol/L濃度生物素作用脂肪細胞對提升細胞內(nèi)PK的相對表達，且以12 h時提升效果最為顯著。王彥等[16]發(fā)現(xiàn)當PK蛋白濃度上升時，細胞對葡萄糖的攝取與轉(zhuǎn)化能力都得到了提升，滕翠琴[17]發(fā)現(xiàn)當PK含量呈上升趨勢時，葡萄糖利用亦趨于穩(wěn)定。當葡萄糖吸收量上升時，TG的沉積亦會增長[18]。推斷PK相對表達的提升可能加速了糖酵解進程，使脂合成原料丙酮酸的快速合成，進而使TG含量有所提升。以1 μmol/L濃度生物素作用脂肪細胞時，可通過提升PK的表達進而達到促TG沉積的目的。

ACC1在脂肪酸的代謝過程中起了重要作用，其可以催化乙酰輔酶A生成丙二酸單酰輔酶A[2]，并被證實可以通過多種機制調(diào)控脂肪代謝過程[18]。在試驗結(jié)果中，添加生物素的試驗組在12、24及48 h時ACC1 mRNA相對表達量均高于對照組，這表明生物素的添加能促進ACC1的表達。而三個試驗組中，1 μmol/L組在12 h、24 h及48 h時ACC1 mRNA相對表達量均高于0.2 μmol/L組與0.5 μmol/L組。這表明在48 h內(nèi)以1 μmol/L濃度生物素作用脂肪細胞對提升細胞內(nèi)ACC1的相對表達效果最佳。生物素的缺乏將大幅降低羧化全酶合成酶的mRNA表達量[19]，而ACC作為生物素依賴性羧化酶其表達亦會受到影響。以1 μmol/L濃度生物素作用脂肪細胞可能會有效提升羧化全酶mRNA表達量進而促進ACC mRNA的表達。周紅宇等[20]試驗利用瘦素抑制ACC mRNA表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當ACC mRNA表達下降時，脂肪酸合成亦受到了影響。劉莉莉等[21]試驗證實，當ACC表達量提升時，乳腺上皮細胞的乳脂合成增加。這說明生物素可以通過提升ACC1 mRNA的相對表達來促進脂肪酸合成，以達到促脂合成的目的。

動物的體脂沉積所需要的脂肪酸大多是來自脂肪酸的從頭合成[2]，即由FAS催化下乙酰輔酶A和丙二酸單酰輔酶A合成甘油三酯的過程。在試驗結(jié)果中，添加生物素的試驗組在12、24及48 h時FAS mRNA相對表達量均高于對照組，這表明生物素的添加能促進FAS的表達。而在三個試驗組中，0.5 μmol/L組在12、24及48 h時FAS mRNA相對表達量均高于0.2 μmol/L組與1 μmol/L組。這表明在48 h內(nèi)以0.5 μmol/L濃度生物素作用脂肪細胞對提升細胞內(nèi)FAS的相對表達效果最佳。FAS的表達受到轉(zhuǎn)錄因子固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBP1c)調(diào)控[22-23]，而Ortega-Cuellar試驗[24]指出生物素可以激活SREBP1c。以0.5 μmol/L濃度生物素作用脂肪細胞可能會有效提升SREBP1c活化程度，進而促進FAS mRNA的表達。舒常平等[25]等研究表明，F(xiàn)AS mRNA的表達可使脂肪快速沉積。這說明生物素可以通過提升FAS mRNA的相對表達來促進脂肪酸合成，以達到促脂合成的目的。

4　結(jié) 論

生物素可提升脂肪細胞GLUT-4、PK、FAS與ACC1 mRNA相對表達量；當以1 μmol/L生物素作用時，細胞GLUT-4、PK與ACC1 mRNA相對表達量均高于其它試驗組并顯著(P<0.05)高于對照組；當以0.5 μmol/L生物素作用時，細胞FAS mRNA相對表達量均高于其它組。通過不同組間的比較，以1 μmol/L生物素作用脂肪細胞時對GLUT-4、PK與ACC1 mRNA提升效果最佳，以0.5 μmol/L生物素作用時對FAS mRNA提升效果最佳。

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