全巖

（遼寧省蓋州市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，遼寧蓋州115000）

沙拉沙星是一種動(dòng)物專(zhuān)用的氟喹諾酮類(lèi)的藥物。被廣泛應(yīng)用于防治禽類(lèi)的大腸桿菌病，同時(shí)也被開(kāi)發(fā)并應(yīng)用于水產(chǎn)行業(yè)。安普霉素臨床上也主要用治療大腸桿菌等引發(fā)的感染性疾病，為了合理應(yīng)用抗菌藥，制定合理的給藥方案，本文對(duì)沙拉沙星及與安普霉素聯(lián)用的PAE進(jìn)行了研究。

1 試驗(yàn)材料

1.1 抗菌藥物

鹽酸沙拉沙星：含量98%，批號(hào)98105-99-8，鄭州艾克姆化工有限公司

安普霉素：含量99%，批號(hào)37321-09-8，天津康泰生物科技有限公司

1.2 生物/化學(xué)試劑

生理鹽水：無(wú)菌生理鹽水

牛肉膏：BR，北京弘潤(rùn)寶順生物科技有限公司，批號(hào)68990-09-0

可溶性淀粉：AR，北京康普維科技有限公司，批號(hào)9005-8-49

酪蛋白酸性水解物：河南盛之德商貿(mào)有限公司，批號(hào)9005-40-3

1.3 試驗(yàn)菌種

大腸桿菌（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供）、金黃色葡萄球菌（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供）

1.4 儀器設(shè)備

電子天平∶德國(guó)Sartorius，感應(yīng)量萬(wàn)分之一。微量加樣器∶100～1000μL，長(zhǎng)沙科怡儀器設(shè)備有限公司。超凈工作臺(tái)，恒溫培養(yǎng)箱，高壓滅菌鍋，電冰箱等。

2 試驗(yàn)方法

2.1 培養(yǎng)基的制備

MH培養(yǎng)液：稱(chēng)取牛肉粉5g，酪蛋白酸性水解物17.5g，可溶性淀粉0.15g。加熱溶解后，加蒸餾水至1000mL，調(diào)終pH至7.2～7.4，于121℃下高壓滅菌15min備用。

2.2 抗菌藥物貯存液的制備

精確稱(chēng)取一定量的沙拉沙星和安普霉素粉劑，分別置于50mL容量瓶中，用超純水充分溶解并定容，使藥液的終濃度為1280μg/mL，此為貯存液。置于冰箱中-20℃低溫保存，使用前需用無(wú)菌生理鹽水稀釋成所需濃度，高壓滅菌后置于冰箱在溫度為4℃條件下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 藥物體外抗菌活性的測(cè)定

采用試管液體二倍稀釋法[1]來(lái)分別測(cè)定兩種藥對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度(MIC)，并將其過(guò)程重復(fù)3次，取平均值。

2.3.1 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備工作：實(shí)驗(yàn)中所用到的玻璃儀器均需在高壓滅菌鍋中滅菌。在高壓滅菌鍋中取出15支試管放在試管架上，標(biāo)號(hào)1-15。

2.3.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程：用已滅菌的移液管吸取0.9mL的MH培養(yǎng)液于1號(hào)試管中，剩余的14支試管中，每支都加入0.5mL培養(yǎng)液。然后再取一支新的移液管吸取抗菌藥物原液0.1mL放于1號(hào)試管中，輕輕震蕩搖勻，注意吸取不同的液體需更換移液管，以免引起污染。另取一支移液管從已混勻的1號(hào)試管中吸取0.5mL放在2號(hào)試管中，混勻后再吸取0.5mL放于3號(hào)試管中。如此連續(xù)倍比稀釋至第13管，并從第13管中吸取0.5mL滴到營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，進(jìn)行無(wú)菌檢查。這樣，第1～13號(hào)試管的藥液濃度分別 為 128μg/mL、 64μg/mL、 32μg/mL、 16μg/mL、 8μg/mL、4μg/mL 、2μg/mL 、1μg/mL 、0.5μg/mL 、0.25μg/mL、 0.125μg/mL、0.06μg/mL、0.03μg/mL。然后，在1號(hào)到14號(hào)每支試管中均加入已準(zhǔn)備好的稀釋菌液0.5mL并蓋上棉塞。另設(shè)定最后兩支試管為對(duì)照組，14號(hào)為只接種菌液的培養(yǎng)物對(duì)照，而15號(hào)為不加菌液和抗菌藥的培養(yǎng)基對(duì)照。最后，將以上所有試管按標(biāo)號(hào)順序排好，與營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板一起放入恒溫培養(yǎng)箱，設(shè)置溫度為37℃，培養(yǎng)18～24h，取出觀察試管中的變化。

2.3.3 觀察方法：當(dāng)對(duì)照培養(yǎng)物發(fā)生渾濁時(shí)，觀察1-13號(hào)試管哪只試管還澄清，則這只試管所對(duì)應(yīng)的藥物濃度就為該藥的最小抑菌濃度（MIC）。

2.4 兩種藥物聯(lián)用體外抗菌活性的測(cè)定

聯(lián)合藥敏試驗(yàn)是以?xún)煞N藥物的MIC為基礎(chǔ)，在細(xì)胞培養(yǎng)板上以微量棋盤(pán)稀釋法進(jìn)行測(cè)定[2]。用MH培養(yǎng)液將安普霉素和沙拉沙星分別稀釋到各藥的 1/4MIC、1/2MIC、1MIC和 2MIC，用微量加樣器吸取稀釋好的安普霉素藥液50μL按濃度由低到高的順序按行加入到細(xì)胞培養(yǎng)板上，要注意同行的藥物濃度需一致，每行加5孔；更換槍頭以同樣吸取方法吸取等量稀釋好的沙拉沙星藥液按列加入細(xì)胞培養(yǎng)板，同列的藥物濃度也應(yīng)該一致。另第1行作為不加安普霉素的沙拉沙星對(duì)照組而第1列作為不加沙拉沙星的安普霉素對(duì)照組；第1列和第1行各孔中分別加入濁度為 2×105CFU·mL-1的菌液 50μL，其余各孔中分別加入濁度為 2×105CFU·mL-1的菌液 100μL，使每孔菌液的終濁度為 1×105CFU·mL-1；將組合好的細(xì)胞培養(yǎng)板在37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育18h，采用比濁法進(jìn)行觀測(cè)，記錄兩藥聯(lián)用時(shí)的MIC試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

2.5 體外PAE的測(cè)定

2.5.1 對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)菌液的制備

挑取待測(cè)菌1～2個(gè)單個(gè)菌落接種于2mL MH肉湯中，37℃孵育16～18h，以麥?zhǔn)媳葷峁苄Ｕ錆岫葹?08cfu/mL，用37℃預(yù)溫的新鮮MH營(yíng)養(yǎng)肉湯稀釋100倍，使其濁度為106cfu/mL。

2.5.2 PAE誘導(dǎo)

用已滅菌的移液管分別吸取10MIC、20MIC、40MIC的沙拉沙星各0.2mL與1.8mL濁度為106cfu/mL的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌懸液置于3支15mL試管中，作為實(shí)驗(yàn)管。另取一支試管作為空白對(duì)照，只加入1.8mL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液，以及0.2mL無(wú)菌生理鹽水。輕輕振蕩混勻上述四支試管，立即放于37℃恒溫箱中培養(yǎng)1.5h，最終使各管藥物濃度分別為1MIC、2MIC、4MIC、0MIC（空白對(duì)照組）。

2.5.3 藥物的去除與重建

采用1000倍稀釋法清除藥物。取上述1MIC、2MIC、4MIC以及空白對(duì)照管中的菌液各0.1mL分別加入4支99.9mL在37℃的溫度下預(yù)熱的新鮮MH營(yíng)養(yǎng)肉湯中進(jìn)行重建，并存放于37℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，并將此時(shí)記為重建后的零時(shí)。

2.5.4 PAE測(cè)定

在上述培養(yǎng)條件下于不同時(shí)間：0.5、1、2、4、6、8、12、16、24h進(jìn)行采樣，用MH培養(yǎng)液對(duì)樣品進(jìn)行10倍系列稀釋。在超凈工作臺(tái)上用微量加樣器吸取0.1mL菌液放在MH瓊脂平皿上，用接種環(huán)在平皿上輕輕劃線(xiàn)（不要接觸平皿邊緣）于35℃～37℃培養(yǎng)18～20h，選擇生長(zhǎng)30～100個(gè)菌落的平皿，用菌落計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，根據(jù)稀釋度算出每mL菌液的活菌數(shù)。將細(xì)菌計(jì)數(shù)所得的各時(shí)間點(diǎn)的cfu/mL值取常用對(duì)數(shù)（lg）為縱坐標(biāo)，以培養(yǎng)時(shí)間(h)為橫坐標(biāo)作圖，建立實(shí)驗(yàn)菌與對(duì)照菌重建后恢復(fù)生長(zhǎng)的動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)[3]。

2.5.5 PAE計(jì)算

依據(jù)細(xì)菌重建后恢復(fù)生長(zhǎng)的動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)，計(jì)算出T、C，按照公式PAE=T-C來(lái)計(jì)算，其中T為實(shí)驗(yàn)組細(xì)菌的值高于重建后零時(shí)的10倍(1lgcfu/mL)所需要的時(shí)間(h)，C為對(duì)照組細(xì)菌的值高于重建后零時(shí)的10倍(1lgcfu/mL)所需要時(shí)間(h)[4]。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 體外抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)表3-1可知，沙拉沙星和安普霉素對(duì)兩種菌都有較強(qiáng)的抗菌活性，其中沙拉沙星對(duì)大腸桿菌單用的MIC值為0.25，小于對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC，這說(shuō)明大腸桿菌對(duì)沙拉沙星的敏感性要優(yōu)于金黃色葡萄球菌。而單用安普霉素對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為0.63，要小于對(duì)大腸桿菌的MIC，所以，金黃色葡萄球菌對(duì)安普霉素的敏感性?xún)?yōu)于大腸桿菌。根據(jù)表3-1還可以看出安普霉素與沙拉沙星聯(lián)用MIC相對(duì)與單用的MIC都有所降低。

表3-1 沙拉沙星和安普霉素聯(lián)用的MIC（μg/mL）（平均值）

3.2 細(xì)菌生長(zhǎng)的動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)

根據(jù)圖3-1、3-2可以看出同一時(shí)間不同濃度的藥物對(duì)于細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖都具有抑制作用，隨著藥物濃度的增大對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖的抑制力越強(qiáng)，在前四小時(shí)藥物對(duì)于細(xì)菌的生長(zhǎng)抑制較明顯，細(xì)菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)較平緩，而四小時(shí)之后細(xì)菌的生長(zhǎng)緩慢恢復(fù)。對(duì)比3-1與3-2可以發(fā)現(xiàn)在兩種藥聯(lián)用時(shí)，金葡萄球菌的恢復(fù)再生長(zhǎng)的時(shí)間要早于大腸桿菌，這說(shuō)明，沙拉沙星與安普霉素聯(lián)合應(yīng)用對(duì)大腸桿菌的抑菌效果要強(qiáng)于金葡萄球菌。

圖3-1 金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)曲線(xiàn)

圖3-2 大腸桿菌的生長(zhǎng)曲線(xiàn)

表3-2 沙拉沙星單用對(duì)兩種菌體外PAE結(jié)果

表3-3 沙拉沙星與安普霉素聯(lián)合用藥的PAE結(jié)果

3.3 PAE測(cè)定結(jié)果

根據(jù)表3-2可知，沙拉沙星在1MIC～4MIC濃度范圍內(nèi)對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均存在體外PAE且時(shí)間有所差異。對(duì)比不同濃度藥物對(duì)同一種菌的體外PAE可發(fā)現(xiàn)隨著藥物濃度的增加，體外PAE時(shí)間均有所延長(zhǎng)，呈正相關(guān)。由表3-3對(duì)比可知，同一濃度沙拉沙星與安普霉素聯(lián)用可有效延長(zhǎng)PAE，不同濃度不同種菌類(lèi)PAE程度有所不同。

4 討論

4.1 在1MIC時(shí)，單用沙拉沙星對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的PAE分別為0.92±0.28h、1.15±0.31h，即沙拉沙星對(duì)上述細(xì)菌都有不同程度的PAE。而沙拉沙星與安普霉素聯(lián)合應(yīng)用在1MIC對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的PAE分別為1.68±0.26h，1.45±0.25h，相比較而言PAE延長(zhǎng)。再者，兩種藥聯(lián)用對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌在藥物濃度為2MIC和4MIC的PAE分別為 2.05±0.35h、2.13±0.27h 和 3.47±0.32h、2.47±0.34h。 從數(shù)據(jù)看出，PAE成明顯的劑量依賴(lài)性，且大腸桿菌的PAE值最大。

4.2 本試驗(yàn)的結(jié)果顯示，兩種藥物聯(lián)用對(duì)G-（大腸桿菌）的體外PAE的時(shí)間比對(duì)G+（金黃色葡萄球菌）的體外PAE要長(zhǎng)，這可能與沙拉沙星與安普霉素聯(lián)用對(duì)G-的殺菌效果更好，給細(xì)菌造成了嚴(yán)重?fù)p傷，所以在清除藥物后，細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖能力恢復(fù)的比較緩慢。

5 結(jié)論

以試管二倍稀釋法測(cè)MIC操作簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確可靠。本實(shí)驗(yàn)中樣品處理方法采用的是1000倍稀釋法，簡(jiǎn)便可靠，藥物去除完全。沙拉沙星對(duì)大腸桿菌的MIC為0.25μg/mL，屬于高度敏感；對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為1.0μg/mL，屬于中度敏感；而安普霉素對(duì)與大腸桿菌的MIC為 2.5μg/mL屬于中度敏感，對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為0.63μg/mL，屬于高度敏感，所以這兩種抗生素對(duì)這兩種細(xì)菌均有較強(qiáng)的抗菌活性。沙拉沙星與安普霉素聯(lián)合用藥的體外PAE較單用沙拉沙星的體外PAE效果較明顯，且PAE大小與藥物濃度呈正相關(guān)，并推測(cè)其最佳接觸時(shí)間為4h左右。

[1]劉明春.司帕沙星體外抗菌活性的試驗(yàn)[J].中國(guó)獸醫(yī)科技,2003(5)：52-54.

[2]黃寶明.安普霉素及其聯(lián)合用藥對(duì)三種細(xì)菌PAE的研究[D].黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué),2010.

[3]黃寶明,王新,崔一喆.安普霉素及其聯(lián)合用藥對(duì)大腸桿菌的PAE研究[J].黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào).2009(06).

[4]徐叔云,卞如濂,陳修等.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)（第二版）[M].北京：人民衛(wèi)生出版社.2003,2003,37(10)：30-32.