吳 蔚

福建省南平市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 福建南平 353000

豬繁殖與呼吸障礙綜合征（豬藍(lán)耳?。且阅肛i繁殖障礙和仔豬嚴(yán)重的呼吸道癥狀及高死亡率為特征的豬病毒性傳染病。是我國(guó)法定的二類動(dòng)物疫病[1]。無(wú)論是高致病性豬藍(lán)耳病還是經(jīng)典豬藍(lán)耳病，目前，我國(guó)普遍采用疫苗免疫的手段[2-3]。因此，做好免疫后的血清學(xué)抗體監(jiān)測(cè)就顯得十分必要。然而在基層獸醫(yī)試驗(yàn)中，主要是時(shí)間及條件的限制，往往會(huì)遇到血清需要反復(fù)凍融的情況。本文基于基層獸醫(yī)試驗(yàn)的需要，研究血清反復(fù)凍融對(duì)豬藍(lán)耳病抗體效價(jià)的影響。

1　材料與方法

1.1樣本與試劑 待檢測(cè)豬藍(lán)耳病抗體的血清、豬繁殖與呼吸綜合征抗體檢測(cè)試劑盒（法國(guó)LSI）。

1.2主要儀器設(shè)備 冰箱（4℃）及冰柜（-20℃）、酶標(biāo)儀、微量移液器、恒溫生化培養(yǎng)箱、純水儀。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1待檢血清的篩查 將剛采集的豬全血析出血清，使用間接ELISA法對(duì)豬血清進(jìn)行初篩，選取其中不同抗體水平的22份陽(yáng)性血清（經(jīng)病原學(xué)檢測(cè)為豬藍(lán)耳病病毒熒光RT-PCR陰性）進(jìn)行試驗(yàn)，并記錄下初篩時(shí)22份陽(yáng)性血清的IRPC值。

1.3.2試驗(yàn)血清的反復(fù)凍融 將由1.3.1初步篩查選出的22份不同抗體水平的陽(yáng)性血清樣品編號(hào)后（1至22號(hào)）進(jìn)行分裝，每一份血清分裝成6份，分別進(jìn)行1次、2次、3次、4次、5次凍融以及不凍融操作，具體方法為：（以樣本1為例）將樣本1用離心管分裝成6份，每份樣本100 μL。第1份標(biāo)記1-1，第2份標(biāo)記1-2，以此類推，標(biāo)記至1-5，未凍融處理的樣本標(biāo)記1-0，然后將這6份樣本全部放入冰柜（-20℃）保存1 d。第2 d取出樣本1-5，放至室溫，待離心管內(nèi)血清全部融解后再放入冰柜 （-20℃）保存。第3 d取出樣本1-4和1-5，放至室溫，待離心管內(nèi)血清全部融解后再放入冰柜（-20℃）保存。第4 d取出樣本1-3、1-4和1-5，放至室溫，待離心管內(nèi)血清全部融解后再放入冰柜（-20℃）保存。第5 d取出樣本1-2、1-3、1-4和1-5，放至室溫，待離心管內(nèi)血清全部融解后再放入冰柜（-20℃）保存。第6 d取出樣本 1-1、1-2、1-3、1-4 和 1-5，放至室溫，待離心管內(nèi)血清全部融解后再放入冰柜（-20℃）保存。至此，完成樣本1的反復(fù)凍融。樣本2至樣本22，參照樣本1的凍融方法進(jìn)行。所有樣本均同步進(jìn)行反復(fù)凍融。凍融次數(shù)相同的樣本合裝1小袋，每袋22個(gè)樣本，共6小袋。并在袋上用記號(hào)筆做好標(biāo)記。完成樣本的反復(fù)凍融后，所有樣本均放置冰柜（-20℃）保存3個(gè)月。由于最后所有樣本均放置冰柜（-20℃）保存3個(gè)月，也算是反復(fù)凍融，故所有樣本在之前反復(fù)凍融次數(shù)上增加1次。22份樣本的凍融次數(shù)均為凍融1次、2次、3次、4次、5次及6次。

1.3.3反復(fù)凍融后樣本的抗體檢測(cè) 采用豬繁殖與呼吸綜合征抗體檢測(cè)試劑盒進(jìn)行反復(fù)凍融6次的22份樣本進(jìn)行間接ELISA法檢測(cè)。檢測(cè)其OD450nm值。最終將其換算為IRPC值。

1.3.4方差分析 對(duì)以上樣本試驗(yàn)后的IRPC值用軟件SPSS 17.0進(jìn)行方差分析。

2　試驗(yàn)結(jié)果

2.1樣本初篩時(shí)IRPC值 試驗(yàn)所選取的22份樣本初篩時(shí)其IRPC值均＞20，為豬藍(lán)耳病抗體陽(yáng)性，并呈現(xiàn)不同抗體水平，有弱陽(yáng)性及強(qiáng)陽(yáng)性之分，見(jiàn)表1。

2.2不同凍融次數(shù)測(cè)得的22份樣本IRPC值 不同凍融次數(shù)所測(cè)得的22份樣本IRPC值見(jiàn)表2。經(jīng)不同凍融次數(shù)以及較長(zhǎng)時(shí)間冷凍 （-20℃，3個(gè)月），22份樣本的IRPC值均＞20，說(shuō)明該批樣本仍能測(cè)出抗體陽(yáng)性，并且如初測(cè)時(shí)一樣呈現(xiàn)不同抗體水平。

2.3方差分析結(jié)果 用軟件SPSS 17.0對(duì)表1-表2數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，得到方差分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果，見(jiàn)表3。 F=0.782，P（sig）=0.585＞0.05，無(wú)顯著差異。

表3　IRPC值方差分析結(jié)果

3　分析與討論

該試驗(yàn)是結(jié)合南平市春季動(dòng)物防疫集中監(jiān)測(cè)時(shí)進(jìn)行的，所選取的樣本為在不同規(guī)模場(chǎng)不同抗體水平的豬血清。在研究不同凍融次數(shù)對(duì)抗體水平的影響時(shí)，同步做了對(duì)應(yīng)豬鼻腔拭子（22個(gè)樣本）的熒光RT-PCR試驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果均為陰性。試驗(yàn)均由同一人在同一環(huán)境下操作，并且在酶標(biāo)板上分布血清樣本時(shí)，遵循同一個(gè)樣本分布在同一塊酶標(biāo)板上的原則，這樣做能盡量避免出現(xiàn)需要板間校正的情況。

試驗(yàn)時(shí)特別選取無(wú)溶血的22個(gè)血清樣本。但是在動(dòng)物疫病防控日常監(jiān)測(cè)中，樣本從養(yǎng)殖場(chǎng)（戶）到實(shí)驗(yàn)室的各個(gè)環(huán)節(jié)，出現(xiàn)溶血樣本是比較常見(jiàn)的（尤其是禽血清）。由于條件所限，該試驗(yàn)無(wú)法研究溶血等因素對(duì)血清抗體效價(jià)的影響，待試驗(yàn)條件成熟后再進(jìn)一步研究。但大量研究資料表明，溶血對(duì)檢測(cè)結(jié)果有影響[4]。如隆維東等[5]對(duì)30例標(biāo)本分別在溶血前及溶血后采用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀進(jìn)行血常規(guī)檢測(cè)，對(duì)比溶血前后血常規(guī)14項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)的差異發(fā)現(xiàn)，溶血標(biāo)本對(duì)血常規(guī)多個(gè)項(xiàng)目均有干擾。表1和表2的試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，經(jīng)過(guò)3個(gè)月的低溫（-20℃）凍存后，血清樣本在保存完好的情況下，仍能在血清中測(cè)出抗體，而且大部分抗體仍舊保持較高的效價(jià)。

試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，經(jīng)過(guò)反復(fù)凍融的血清樣本，其IPRC值并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。即經(jīng)過(guò)1次、2次、3次、4次、5次和6次反復(fù)凍融對(duì)血清樣本的抗體效價(jià)并無(wú)太大影響。這與鐘錦輝等[6]研究血清凍融次數(shù)對(duì)豬瘟抗體效價(jià)影響的結(jié)果大體一致。試驗(yàn)中只研究不超過(guò)6次反復(fù)凍融對(duì)豬藍(lán)耳病抗體效價(jià)的影響，是基于基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室在日常監(jiān)測(cè)中的實(shí)際操作，而人醫(yī)資料表明，多次反復(fù)凍融對(duì)血清中某些指標(biāo)有較大影響[7]。因此，建議在檢測(cè)抗體實(shí)際操作中，血清標(biāo)本如需保存多次使用，還是少量分裝凍存為宜。

參考文獻(xiàn)：

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表1　樣本初篩時(shí)IRPC值

表2　不同凍融次數(shù)樣本IRPC值

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[5]隆維東,劉萬(wàn)彬,李堅(jiān).標(biāo)本溶血對(duì)血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果的影響分析[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2012,33(9):1127-1129.

[6]鐘錦輝,張海明,段曉冬,等.血清凍融次數(shù)對(duì)豬瘟抗體效價(jià)的影響[J].廣東畜牧獸醫(yī)科技,2013,38(1):17-19.

[7]傅慧平,劉文俊.血清冷凍保存對(duì)生化檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性研究[J].中國(guó)臨床研究,2009(1):1.