陸思婷

福建省光澤縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 福建光澤 354100

豬瘟是由豬瘟病毒（CFSV）引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。以出血性高熱和免疫抑制為主要特征，發(fā)病率和病死率均很高，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)危害巨大。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為A類烈性傳染病，《中華人民共和國(guó)動(dòng)物防疫法》將其列為一類傳染病[1]。豬瘟一旦發(fā)生，將給飼養(yǎng)者造成慘重的經(jīng)濟(jì)損失。隨著人們對(duì)豬瘟病毒分子生物學(xué)的不斷研究，疫苗的廣泛應(yīng)用，豬瘟得到了有效控制，但由于自身免疫系統(tǒng)的影響，使豬瘟病毒能夠在豬體中建立持續(xù)的感染，使之逃避宿主的免疫清除，從而出現(xiàn)豬瘟免疫效果低下的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，成為豬瘟暴發(fā)的安全隱患[2]。

免疫系統(tǒng)是一個(gè)由固有免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)相疊加而形成的復(fù)雜系統(tǒng)，免疫細(xì)胞彌散分布，它們之間沒(méi)有固定的網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系。這樣的一個(gè)系統(tǒng)之所以能夠特異、有效地發(fā)揮免疫保護(hù)作用，取決于不同免疫細(xì)胞之間高度有序的分工合作與緊密協(xié)調(diào)，而細(xì)胞因子就是免疫細(xì)胞之間相互交流的 “語(yǔ)言”。細(xì)胞因子是指由機(jī)體的免疫細(xì)胞或非免疫細(xì)胞合成和分泌的蛋白質(zhì)或小分子多肽，能調(diào)節(jié)細(xì)胞生理功能、參與免疫應(yīng)答和介導(dǎo)炎癥反應(yīng)等多種生物學(xué)效應(yīng)，細(xì)胞因子對(duì)于細(xì)胞間相互作用、細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化有重要的調(diào)節(jié)作用[3]。根據(jù)細(xì)胞因子功能的不同，主要分為白細(xì)胞介素（Interleukin，IL）、干擾素（Interferon，IFN）、集落刺激因子（Colony stimulating factor，CSF）、 腫 瘤 壞 死 因 子 （Tumor necrosis factor，TNF）等。對(duì)上述細(xì)胞因子進(jìn)行研究不但可以幫助人類闡明豬病的發(fā)生機(jī)理及豬體抵抗感染的免疫機(jī)制，并且對(duì)豬病的診斷和防治也具有重要的參考作用。通過(guò)ELISA試驗(yàn)對(duì)某規(guī)?；i場(chǎng)母豬的血清進(jìn)行豬瘟抗體水平檢測(cè)，并按被檢母豬健康狀態(tài)和免疫狀況進(jìn)行分類，同時(shí)對(duì)各自血清中具有免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子干擾素-r(IFN-r)和白細(xì)胞介素-4（IL-4）進(jìn)行分析比較，進(jìn)而闡明豬瘟抗體水平低下原因，為機(jī)體免疫狀況影響豬瘟抗體水平表達(dá)提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1血清樣品 隨機(jī)抽取光澤縣某規(guī)?；N豬場(chǎng)54頭母豬血液。

1.1.2試劑 豬瘟、藍(lán)耳病、偽狂犬病ELISA抗體檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京愛(ài)德氏元亨生物科技有限公司；細(xì)胞因子IFN-r和IL-4 ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)RD公司 （上述試劑盒均是特異性針對(duì)豬而設(shè)計(jì)的）；氯仿；異丙醇；70%酒精；DEPC 水、Taq DNA聚合酶、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、Trizol RNA提取試劑購(gòu)于Invitrogen公司，dNTP購(gòu)于TaKaRa公司。

1.1.3器材 美國(guó)伯樂(lè)公司680酶標(biāo)儀；德國(guó)Eppendorf移液器（50 uL 和 100 uL）；Thermo公司高速冷凍離心機(jī)；Thermal公司梯度PCR儀；北京市六一儀器廠電泳儀；BIO-RAD公司紫外線凝膠成像儀；1.5 mL離心管、離心機(jī)、一次性膠頭等。

1.1.4實(shí)驗(yàn)室環(huán)境 溫度25℃，相對(duì)濕度58%。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1血清分離 使用不含熱原和內(nèi)毒素離心小管（操作避免任何細(xì)胞刺激），收集血液后送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，3 000 r/min離心除去紅細(xì)胞。短時(shí)間可存放于4℃冰箱，如需長(zhǎng)期存放，應(yīng)放于-20℃低溫冰箱。

1.2.2ELISA檢測(cè)方法 對(duì)豬瘟抗體、偽狂犬病gE抗體、藍(lán)耳病抗體，以及細(xì)胞因子IFN-r、IL-4進(jìn)行ELISA檢測(cè)，試劑盒所有組分均恢復(fù)到室溫18～25℃，試劑輕輕旋轉(zhuǎn)混合均勻。此外，洗滌緩沖液用蒸餾水進(jìn)行1∶20稀釋，即1份20×洗滌緩沖液加19份蒸餾水。具體檢測(cè)步驟和要求參見(jiàn)操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.3PCR檢測(cè)方法 對(duì)豬瘟病毒、藍(lán)耳病病毒進(jìn)行PCR檢測(cè)。簡(jiǎn)要步驟如下：制備瓊脂糖凝膠，或者聚丙烯酰胺凝膠；取少量（約5 uL）PCR產(chǎn)物（確定加入上樣緩沖液）點(diǎn)樣到凝膠孔里；接通電源，調(diào)好電壓（120 V），開(kāi)始運(yùn)行；等跑到大概2/3處，在紫外成像儀里查看條帶。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件SPSS15.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析 （one-way ANOVA），以p＜0.05 為差異顯著。

1.4結(jié)果判定 豬瘟抗體檢測(cè)：阻斷率≤30%，表示抗體陰性；當(dāng)阻斷率≥40%，表示抗體陽(yáng)性；阻斷率在30%～40%，應(yīng)在數(shù)日后再對(duì)該動(dòng)物重新檢測(cè)。豬群豬瘟抗體阻斷率＞40%達(dá)到100%，或者＞50%達(dá)到85%，離散度＜25%，表示豬群免疫狀況很好；離散度在25%～40%表示免疫效果一般。

偽狂犬病gE抗體檢測(cè)：當(dāng)S/N值≥0.7，表示gE抗體陰性；0.6≤S/N值＜0.7，表示可疑；S/N值＜0.6表示gE抗體陽(yáng)性。

藍(lán)耳病抗體檢測(cè)：當(dāng)S/P值＜0.4，表示藍(lán)耳病抗體陰性；S/P值≥0.4表示抗體陽(yáng)性。

2　結(jié)果與分析

2.1主要病毒及豬瘟抗體水平檢測(cè) 抽檢的54頭母豬一個(gè)月前進(jìn)行過(guò)豬瘟疫苗免疫，通過(guò)對(duì)引起免疫反應(yīng)低下的常見(jiàn)因素進(jìn)行逐個(gè)分析排查，采用ELISA、PCR方法對(duì)54份血清樣品進(jìn)行偽狂犬病gE、藍(lán)耳病、豬瘟檢測(cè)，監(jiān)測(cè)出4頭豬感染了豬瘟，2頭感染藍(lán)耳病、1頭感染了偽狂犬病，其中有1頭屬混合感染。最終確定47份血清樣品無(wú)其他病毒感染，對(duì)47份血清進(jìn)行豬瘟抗體檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。

根據(jù)上述判定標(biāo)準(zhǔn)，47頭母豬中豬瘟抗體檢測(cè)陽(yáng)性率達(dá)到74.47%，平均值為52.63，離散度為39.67%，說(shuō)明該豬場(chǎng)豬瘟抗體水平較差。之后對(duì)阻斷率在30%～40%的6頭可疑豬只，重新進(jìn)行豬瘟抗體檢測(cè)，其中有5頭為陰性，1頭為陽(yáng)性。

表1　豬瘟抗體檢測(cè)結(jié)果

2.2細(xì)胞因子檢測(cè) 對(duì)47份抗體陰性和抗體陽(yáng)性豬血清進(jìn)行細(xì)胞因子IFN-r和IL-4含量檢測(cè)，利用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件SPSS15.0對(duì)抗體陰性豬和抗體陽(yáng)性豬兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），結(jié)果由表2。CSF抗體陰性豬外周血中IL-4的濃度為（9.56±1.12）pg/mL，高于抗體陽(yáng)性豬（7.31±0.49）pg/mL，差異顯著（p＜0.05）。 而 CSF 抗體陰性豬外周血中 IFN-r濃度為（5.59±0.47）pg/mL，略高于抗體陽(yáng)性豬的（5.24±0.20）pg/mL，但無(wú)明顯差異（P＞0.05）。

表2　抗體水平高低對(duì)細(xì)胞因子IFN-r、IL-4含量的比較

3　討 論

為了維持機(jī)體的生理平衡，抵抗病原微生物的侵襲，機(jī)體的許多細(xì)胞特別是免疫細(xì)胞合成和分泌多種微量的多肽類因子，即細(xì)胞因子。它們?cè)诩?xì)胞之間傳遞信息，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理過(guò)程。細(xì)胞因子都是通過(guò)與靶細(xì)胞表面的細(xì)胞因子受體特異性結(jié)合后才能發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)，這些效應(yīng)包括促進(jìn)靶細(xì)胞的增殖和分化，增強(qiáng)抗感染和殺腫瘤細(xì)胞效應(yīng)，促進(jìn)或抑制其他細(xì)胞因子的合成，促進(jìn)炎癥過(guò)程，影響細(xì)胞代謝等。細(xì)胞因子的這些作用具有網(wǎng)絡(luò)性的特點(diǎn)，即不同的細(xì)胞因子之間組合，有的起拮抗作用，有的起協(xié)同作用，由此構(gòu)成了復(fù)雜的細(xì)胞因子免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。細(xì)胞因子表達(dá)水平是反映機(jī)體免疫功能的重要指標(biāo)，細(xì)胞因子根據(jù)其功能不同可分為T(mén)h1、Th2兩個(gè)亞群，通過(guò)表達(dá)不同的細(xì)胞因子介導(dǎo)各自的免疫功能。Th1主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫，Th2主要介導(dǎo)體液免疫。干擾素-r（IFN-r）主要由Th1細(xì)胞分泌，白細(xì)胞介素-4（IL-4）主要由Th2細(xì)胞分泌。正常豬體內(nèi)Th1、Th2細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子在體內(nèi)處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，其平衡被打破可導(dǎo)致機(jī)體免疫功能紊亂、抗體水平低下而引發(fā)疾病[4]。IL-4是重要的Th2型細(xì)胞因子，是體液免疫的重要調(diào)節(jié)因子，IL-4在抗原遞呈及淋巴細(xì)胞激活過(guò)程中起重要作用，使抗原遞呈能力顯著增強(qiáng)；另外作用于靜止的B細(xì)胞時(shí)，能促進(jìn)B細(xì)胞發(fā)生增殖，使特異性IgG和IgE分泌增多，調(diào)節(jié)Th1和Th2細(xì)胞平衡。IFN-r是一種具有廣泛高效的抗病毒和免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子，能直接增強(qiáng)NK細(xì)胞殺傷病毒的能力，但它的表達(dá)和分泌受到機(jī)體的嚴(yán)格調(diào)控，在病理或免疫狀態(tài)下，IFN-r的表達(dá)會(huì)出現(xiàn)異常。

據(jù)夏燕華等的研究，CSF抗體水平過(guò)高能夠抑制IFN啟動(dòng)子的活化，直接影響機(jī)體抗病毒的功能，為病毒感染掃除了障礙，是病毒建立持續(xù)感染的重要原因[5]。據(jù)胡永明等研究，CSF抗體水平高會(huì)引起機(jī)體IFN-r的產(chǎn)生量降低[6]。據(jù)王惟研究，CSF抗體陰性豬外周血中IFN-r的表達(dá)量與抗體陽(yáng)性豬相比無(wú)顯著差異[7]。有研究表明，在疫苗中加入不同濃度的IFN-r作為復(fù)合佐劑免疫小鼠，能夠促進(jìn)抗體分泌量，提高特異性細(xì)胞免疫效果[8]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，CSF抗體陰性豬血清中IFN-r的表達(dá)量略高于抗體陽(yáng)性豬，但無(wú)顯著差異（P＞0.05），與王惟等的報(bào)道相一致。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，CSF抗體陰性豬中IL-4的表達(dá)量顯著高于抗體陽(yáng)性豬（p＜0.05），與一些研究報(bào)道不盡一致，他們認(rèn)為，CSF抗體陰性豬PBL的IL-4表達(dá)量顯著低于抗體陽(yáng)性豬，其原因可能是血清樣本存在差異，在進(jìn)行細(xì)胞因子IL-4、IFN-r檢測(cè)前，對(duì)豬瘟病毒、偽狂犬病病毒和藍(lán)耳病病毒等主要病毒進(jìn)行排除，確認(rèn)無(wú)這些主要病毒感染，且已篩選掉抗體異常高的母豬。同時(shí)有研究表明，IL-4對(duì)B細(xì)胞的作用受IFN-r的影響，當(dāng)IFN-r與IL-4同時(shí)存在時(shí)，IL-4促進(jìn)IgG1、IgG3、IgE產(chǎn)生的作用則被抑制[9]。本試驗(yàn)抗體陰性豬中IL-4與IFN-r的表達(dá)量均高于抗體陽(yáng)性豬，因此豬瘟抗體陰性豬中IL-4促進(jìn)抗體產(chǎn)生能力較陽(yáng)性豬更弱，這也許是引起豬瘟抗體水平較低的原因之一。

IL-4、IFN-r都是具有免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子，因此，對(duì)于抗體水平低、免疫功能異常的豬，其血液中的IL-4、IFN-r表達(dá)水平值得關(guān)注。本試驗(yàn)結(jié)果表明，CSF抗體陰性豬中IL-4的表達(dá)量顯著高于抗體陽(yáng)性豬（p＜0.05），而 IFN-r無(wú)顯著差異（P＞0.05）。檢測(cè)IFN-r、IL-4等細(xì)胞因子在外周血中的表達(dá)能夠?yàn)榻沂矩i瘟抗體水平低下的原因提供參考，并為最終改善豬瘟疫苗免疫效果奠定基礎(chǔ)。

4　結(jié) 論

應(yīng)用PCR對(duì)送檢54頭母豬血清樣品進(jìn)行藍(lán)耳病病毒、豬瘟病毒檢測(cè)，同時(shí)應(yīng)用ELISA方法進(jìn)行豬瘟、藍(lán)耳病、偽狂犬?。↖gE）抗體檢測(cè)，排除主要病毒感染和抗體水平異常高的母豬，最終確定47頭無(wú)主要病毒感染的豬只，其中11頭豬瘟抗體陰性豬和36頭抗體陽(yáng)性豬。應(yīng)用ELISA方法分析血清中IL-4和IFN-r兩種細(xì)胞因子的表達(dá)水平，結(jié)果表明，CSF抗體陰性豬中IL-4的表達(dá)量顯著高于抗體陽(yáng)性豬（p＜0.05），IFN-r的表達(dá)量與抗體陽(yáng)性豬相比無(wú)顯著差異（P＞0.05），為揭示豬瘟抗體水平低下的原因提供參考，并為最終改善豬瘟疫苗免疫效果奠定基礎(chǔ)。

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