(泰山醫(yī)學(xué)院，山東　泰安　271016)

泰山蟲草(Cordyceps taishanensis Liu, Yuan et Cao)是一種蟲生真菌，寄生在鱗翅目昆蟲蛹體上，并在合適的條件下從蛹體上長出子實(shí)體。由于野生資源稀缺，現(xiàn)多為人工培養(yǎng)。其中的蟲草素、腺苷具有抗病毒、抗菌、抑制腫瘤的作用；次黃嘌呤核苷可治療白細(xì)胞和血小板的減少[1]。研究表明，泰山蟲草中的核苷類及次黃嘌呤等成分及微量元素的含量均高于冬蟲夏草[2-3]，因此泰山蟲草作為優(yōu)良的藥材及冬蟲夏草的代用品，已經(jīng)引起了重視，其作為保健品也具有良好的開發(fā)前景[4]。冬蟲夏草及泰山蟲草常見的應(yīng)用形式包括子實(shí)體、口服液、超微粉、養(yǎng)生酒、養(yǎng)生茶、蟲草膠囊等。為了實(shí)現(xiàn)釋藥迅速、生物利用度高、制備簡便且攜帶運(yùn)輸方便的目標(biāo)，本研究擬將泰山蟲草提取物制備成滴丸，從而豐富泰山蟲草的下游產(chǎn)品，為泰山蟲草資源的綜合開發(fā)提供理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。

1　材料與儀器

泰山蟲草為本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)。試劑均為分析純︰乙酸乙酯(天津市中和盛泰化工有限公司)；濃硫酸(無錫嘉宏化工貿(mào)易有限公司)；蒽酮(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；液體石蠟(天津市化學(xué)試劑二廠)；無水乙醇(天津市永大化學(xué)試劑有限公司)；PEG2000，PEG4000，PEG6000(天津天泰精細(xì)化學(xué)品有限公司)；蔗糖(天津市永大化學(xué)品有限公司)；醋酸鈉(天津市永大化學(xué)品有限公司)；甲醇(天津市永大化學(xué)品有限公司)。腺苷(上海金穗生物科技有限公司，99%)。

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠 RE-52A型)；電子分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司 BT-25S型)；超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司 KQ3200E型)；數(shù)顯智能控溫磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司 SZCL-2A型)；低速離心機(jī)(上海安亭科技儀器廠 TDL-4OB型)；恒溫水浴鍋(上海亞榮生化儀器廠 HW.SY21-K型)；循環(huán)水式多用真空泵(河南省予華儀器有限公司 ZRS-8G型)；恒溫干燥箱(天津泰斯特儀器有限儀器公司 101-3AB型)；紫外-可見分光光度計(上海元析儀器有限公司 UV-8000A型)；高效液相色譜儀(大連依利特分析儀器有限公司 UV230II型)。

2　方法

2.1　泰山蟲草有效成分的提取

泰山蟲草子實(shí)體100 g置于90 ℃恒溫干燥箱內(nèi)烘干1 h，干燥子實(shí)體用研缽搗碎后置于500 ml圓底燒瓶，加入95%乙醇溶液500 ml，回流1h，殘渣再依次用60%乙醇和蒸餾水500 ml依次回流提取1h。合并提取液，保溫80℃靜置，上清液用紗布濾過，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至30 g，得到泰山蟲草浸膏。

2.2　泰山蟲草滴丸的制備及優(yōu)化

2.2.1泰山蟲草滴丸的制備典型的制備過程如下：稱取PEG 5.0 g，置100 ml燒杯中，80 ℃水浴加熱，水浴熔化后加入蟲草浸膏5.0 g，攪拌均勻，在80℃保溫條件下以 20 d/min 速度采用下行滴制法滴入5℃恒溫的液體石蠟中。

2.2.2泰山蟲草滴丸的處方優(yōu)化為了考察PEG分子量對產(chǎn)品質(zhì)量的影響，分別以PEG2000，PEG6000和PEG2000∶PEG6000=1∶1的混合物為作為基質(zhì)，浸膏與基質(zhì)的質(zhì)量比分別取2∶1，1∶1，1∶2，按照2.2.1方法制備滴丸，以泰山蟲草滴丸的滴制過程、滴丸硬度和形狀、表面性狀為考察指標(biāo)，選定最佳處方。

2.3　泰山蟲草滴丸的質(zhì)量評價

2.3.1重量差異根據(jù)《中國藥典》2015 版四部通則 0108 丸劑項(xiàng)下重量差異項(xiàng)下測定法操作，取泰山蟲草滴丸 20 丸，精密稱量滴丸的總質(zhì)量，再分別精密稱量每粒滴丸的質(zhì)量，計算丸重差異。

2.3.2多糖濃度的測定方法硫酸—蒽酮法顯色液的配制：取潔凈100 ml燒杯，加入16 g蒸餾水，攪拌條件下緩慢滴加64 g濃硫酸，加入80 mg蒽酮，5 ml乙酸乙酯，攪拌均勻，得到硫酸—蒽酮顯色液[7]。精密量取樣品1.0 ml，與顯色液5.5 ml混合搖勻，置85 ℃水浴中加熱10 min，取出放至室溫，以蒸餾水1.0 ml同法處理后作為空白，在波長625 nm測定吸光度。

配置濃度分別為12.5 μg/ml，25 μg/ml，50 μg/ml，100 μg/ml，200 μg/ml和250 μg/ml的一系列蔗糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照上述方法測定，以吸光度(x)為橫坐標(biāo)，濃度(y，μg/ml)為縱坐標(biāo)，回歸得到標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=161.91x-3.70622。R2= 0.9999，故在濃度為12.5 μg/ml～250 μg/ml之間吸光度與濃度成良好的線性關(guān)系。

2.3.3腺苷濃度測定方法腺苷的測定采用高效液相色譜(HPLC)法。色譜柱：依利特SinoChrom ODS-BP(250×4.6 mm)，填料直徑5 μm；流動相為20 mM醋酸鈉∶甲醇=8∶2；流速1.0 ml/min；溫度為室溫；進(jìn)樣量20 μl；檢測波長260 nm。首先配置溶液濃度為0.245 μg/ml，0.49 μg/ml，0.98 μg/ml，9.8 μg/ml，98 μg/ml的一系列腺苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，用HPLC法測定峰面積，以峰面積(x)為橫坐標(biāo)，濃度(y，mg/ml)為縱坐標(biāo)，回歸得到得腺苷溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.0215x-0.0615，R2= 1。樣品測得峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線求得濃度。

2.3.4滴丸中有效成分的溶出速度測定取1.80 g滴丸，依據(jù) 2015 版《中國藥典》四部 0931 溶出度與釋放度測定法第一法，溶劑：800 ml蒸餾水，轉(zhuǎn)速：100 r/min，按照藥典的方法操作，在5 min，15 min，30 min，1 h，2 h，3 h，5 h 分別取樣 5 ml，立刻用 0.45 μm的微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液0.5 ml進(jìn)樣20 μl，測定腺苷含量；繼續(xù)取續(xù)濾液1.0 ml，加入2.0 ml乙醇，搖勻后在4攝氏度冰箱中保存4 h，4000 rpm離心2 min，棄去上清液，沉淀以1.0 ml水復(fù)溶后按照2.3.2方法測定多糖含量。干燥的泰山蟲草子實(shí)體粉末過四號篩，稱取3.00 g，按上述同法測定腺苷及多糖的濃度。溶出度計算：分別以最后一個取樣點(diǎn)測得腺苷及多糖含量為100%，計算其他各時間點(diǎn)溶出度。

3　結(jié)果與討論

3.1　滴丸的制備及條件優(yōu)化

泰山蟲草的有效成分較為復(fù)雜，因此采用不同濃度的乙醇和水分別提取，有利于提取出各種極性的有效成分。為保證重現(xiàn)性，泰山蟲草提取液合并后需減壓濃縮至一定濃度。將提取液分別濃縮至20 g，30 g和40 g，與PEG基質(zhì)(由PEG2000和PEG6000等量混合而成)按照1∶1的質(zhì)量比在80℃水浴加熱條件下進(jìn)行混合試驗(yàn)。結(jié)果顯示，當(dāng)提取液濃縮至20 g時便不能分散于PEG基質(zhì)中，這是因?yàn)榛|(zhì)PEG具有吸水性，而濃縮液中除了水分之外主要為多糖和蛋白質(zhì)，當(dāng)PEG奪取濃縮液中的水分后便會使多糖及蛋白質(zhì)析出。但若僅將提取液濃縮至40 g，則過多的水分會使PEG基質(zhì)無法凝固。因此最終確定三次提取液合并后濃縮至30 g為宜。

將濃縮至30 g的提取物與基質(zhì)按1∶1質(zhì)量比混合，制備的泰山蟲草滴丸?？疾斓沃七^程發(fā)現(xiàn)以PEG2000作基質(zhì)，滴丸冷凝較慢，降落至底部后仍未完全冷凝，因此產(chǎn)品均粘連；而以PEG6000 作基質(zhì)，加如提取物后整個體系黏度極大，滴制時不能形成液滴，而是呈條狀流出滴制口；故最終選擇PEG2000與PEG6000等量混合作為滴丸基質(zhì)。

3.2　泰山蟲草滴丸的質(zhì)量評價

3.2.1外觀及重量差異蟲草提取物與PEG2000和PEG6000按照2∶1∶1的比例混合制備滴丸，成品表面光潔，顏色均勻，無拖尾或氣泡。20粒滴丸的平均丸重為0.0402 g；超出差異限度(12%)的有兩丸，分別超出15%和16%，符合藥典要求。

3.2.2泰山蟲草滴丸中多糖及腺苷溶出度的測定多糖和腺苷是泰山蟲草中有效成分的典型代表，故以這兩種成分為指標(biāo)，評價泰山蟲草滴丸中小分子和大分子有效成分的溶出度。腺苷的溶出曲線如圖1所示。滴丸在30 min時腺苷溶出度達(dá)到99.69%，而相同條件下子實(shí)體粉末中腺苷只溶出了41.1%，直到3 h后，子實(shí)體粉末才基本溶出完全。滴丸中多糖的溶出速度也明顯快于子實(shí)體粉末，由圖2可見，滴丸中的多糖在15 min時便溶出了98.51%，而子實(shí)體粉末中的多糖在4h后才溶出完全。因此，制備成滴丸后，泰山蟲草中的有效成分溶出速度顯著快于子實(shí)體粉末，其原因是所用載體為親水性的聚乙二醇，有效成分高度分散在基質(zhì)中，伴隨著基質(zhì)的溶出而實(shí)現(xiàn)速釋。

圖1　泰山蟲草滴丸與子實(shí)體粉末中腺苷的溶出曲線

圖2　泰山蟲草滴丸與子實(shí)體粉末中多糖的溶出曲線

本研究對泰山蟲草滴九的制備工藝進(jìn)行了優(yōu)化，成功制備了泰山蟲草滴丸，制備工藝為泰山蟲草浸膏2份，與1份PEG2000和1份PEG6000在80℃條件下充分混合，滴入5℃的液體石蠟中。制成的滴丸具有較好的外觀，重量差異符合藥典標(biāo)準(zhǔn)，其有效成分腺苷和多糖的體外溶出速度較子實(shí)體粉末顯著提高。制備的泰山蟲草滴丸為實(shí)現(xiàn)泰山蟲草的綜合利用以及豐富泰山蟲草的下游產(chǎn)品提供了有益借鑒，具有一定的開發(fā)前景。

參考文獻(xiàn)：

[1]張秀波，劉玉升．泰山蟲草的研究進(jìn)展[J]．環(huán)境昆蟲學(xué)報，2009，31(3)：280-284．

[2]趙雪梅，畢研平，蘇延友，等．泰山蟲草菌絲體與冬蟲夏草有效成分的TLCS分析[J]．食品與發(fā)酵工業(yè)．2008，34(03)：126-129．

[3]趙雪梅，張輝，蘇延友，等．泰山蟲草菌絲體與天然冬蟲夏草化學(xué)成分初步分析[J]．中藥材．2008，32(12)：1828-1830．

[4]黃秀華，方書亮，溫魯．用高蟲草素菌粉開發(fā)藥品和保健[J]．中國醫(yī)藥科學(xué)．2012，2(13)：157-158．