趙勝，劉永飛，廉政，劉燕霏，通信作者，張大偉，通信作者

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L-苯丙氨酸調(diào)控啟動(dòng)子強(qiáng)度的研究

趙勝1，劉永飛2，廉政2，劉燕霏1，通信作者，張大偉2，通信作者

（1. 天津農(nóng)學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津 300384；2. 中國科學(xué)院 天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300380）

TyrR是大腸埃希氏菌（簡稱）芳香族氨基酸生物合成和運(yùn)輸途徑中的一種全局性調(diào)控蛋白，控制著包括在內(nèi)的8個(gè)轉(zhuǎn)錄單元的轉(zhuǎn)錄。將基因啟動(dòng)子的兩個(gè)RNAP（RNA聚合酶）結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變來影響TyrR對的介導(dǎo)活化，并且TyrR與L-苯丙氨酸（L-Phe）結(jié)合極大地增強(qiáng)了RNAP對下游結(jié)合位點(diǎn)（啟動(dòng)子）的結(jié)合親和力，因此可用L-Phe來調(diào)控啟動(dòng)子強(qiáng)度進(jìn)而調(diào)控轉(zhuǎn)錄水平。本文以構(gòu)建L-Phe高產(chǎn)菌株為最終目的，對啟動(dòng)子進(jìn)行突變并用以構(gòu)建L-Phe生物傳感器，使啟動(dòng)子強(qiáng)度轉(zhuǎn)變?yōu)榭蓽y量的熒光值，再使用L-Phe調(diào)控該傳感器，影響啟動(dòng)子強(qiáng)度。最終發(fā)現(xiàn)突變后的啟動(dòng)子強(qiáng)度發(fā)生不同程度的改變，并且用L-Phe調(diào)控后，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著L-Phe濃度的升高啟動(dòng)子強(qiáng)度也在一定范圍內(nèi)增強(qiáng)。這將有利于篩選出受調(diào)控的優(yōu)質(zhì)啟動(dòng)子，并為改造代謝路徑及高產(chǎn)L-Phe菌株構(gòu)建有重要意義。

TyrR；；L-Phe；生物傳感器；啟動(dòng)子強(qiáng)度

L-Phe屬于芳香族氨基酸，是人體內(nèi)必需的八大氨基酸之一，在日常生活中用途廣泛[1]。其生產(chǎn)方法主要有酶法和微生物發(fā)酵法，后者因其具有原料廉價(jià)易得、環(huán)境污染小、產(chǎn)物純度高等特點(diǎn)在工業(yè)生產(chǎn)中廣泛運(yùn)用[2]?，F(xiàn)今，微生物發(fā)酵法主要是大腸桿菌高產(chǎn)菌株的工業(yè)發(fā)酵，高產(chǎn)菌株可以通過分子操作獲得。在大腸桿菌的代謝途徑中，TyrR是一種芳香族氨基酸合成代謝中的全局性調(diào)控蛋白質(zhì)，控制著8個(gè)轉(zhuǎn)錄單元的轉(zhuǎn)錄[3]。的轉(zhuǎn)錄也受到TyrR的介導(dǎo)。前期研究中已經(jīng)證明，TyrR在苯丙氨酸存在下通過刺激開放復(fù)合物的形成開始激活轉(zhuǎn)錄，并且對＋3啟動(dòng)子進(jìn)行一系列單一突變后，發(fā)現(xiàn)這種激活機(jī)制依然存在[4]。這一切都足以說明苯丙氨酸可以調(diào)控啟動(dòng)子的強(qiáng)度。而啟動(dòng)子強(qiáng)度可以用生物傳感器的技術(shù)來測試。

生物傳感器是一項(xiàng)涵蓋著生物、化學(xué)、物理、醫(yī)學(xué)等眾多領(lǐng)域的高新技術(shù)[5]。它由分子識別部分和信號轉(zhuǎn)換部分構(gòu)成[6]，前者能特異性識別信號并傳遞給后者，后者將信號定量轉(zhuǎn)變?yōu)榉奖阕R別的信號，以達(dá)到對目標(biāo)物的定性、定量檢測。而代謝物生物傳感器更是在高產(chǎn)目標(biāo)化合物菌株的高通量篩選和微生物胞內(nèi)代謝動(dòng)態(tài)調(diào)控研究中應(yīng)用廣泛[7]。pSenly是Lothar Eggeling（Germany）贈(zèng)予本實(shí)驗(yàn)室的用于構(gòu)建L-Phe生物傳感器的一種質(zhì)粒，該生物傳感器能將的表達(dá)水平轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色熒光信號[8]。構(gòu)建L-Phe生物傳感器（pSen-tyrP），是將R基因、前200個(gè)核苷酸和突變的啟動(dòng)子連接到pSenly中。突變啟動(dòng)子本體表達(dá)水平及調(diào)控后表達(dá)水平將由pSen-tyrP轉(zhuǎn)變?yōu)榭蓹z測的黃色熒光，這樣可以挑選出受調(diào)控影響較大的啟動(dòng)子，以進(jìn)行高產(chǎn)L-Phe菌株的構(gòu)建。

1 材料與方法

1.1 材料

試劑主要有購自O(shè)mega Bio-Tek公司的DNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒以及純化試劑盒，Thermo公司的DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶，Solarbio公司的抗生素、L-PHE二肽，以及實(shí)驗(yàn)室已有的DH5α感受態(tài)細(xì)胞、LB培養(yǎng)基等。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

啟動(dòng)子的突變是在＋3的基礎(chǔ)上，通過＋35、-10區(qū)以及D盒2三個(gè)區(qū)域單個(gè)突變位點(diǎn)的組合，圖1為文獻(xiàn)已知的啟動(dòng)子單個(gè)基因突變[4]。將突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)在PCR擴(kuò)增引物上，以擴(kuò)增出組合突變的啟動(dòng)子。設(shè)計(jì)的突變啟動(dòng)子引物詳見表1。

圖1 tyrP＋3啟動(dòng)子的突變

表1 設(shè)計(jì)的突變啟動(dòng)子引物

注：小寫字母為突變后的堿基

1.2.2 DNA片段擴(kuò)增

利用PCR技術(shù)對所需要的目的片段進(jìn)行擴(kuò)增。進(jìn)行PCR時(shí)采用50 μL體系，見表2，擴(kuò)增片段見表3。

表2 PCR體系構(gòu)成

注：X代表引物的具體名稱

表3 PCR擴(kuò)增片段及長度

注：一對引物能合成一條片段。例如，pSen-EYFP-HⅠ-LF與PSen-tyrP＋3-15-LR擴(kuò)增出HⅠ＋3-15片段；PSen-tyrP＋3-15-LF與pSen-EYFP-Ⅰ-LR擴(kuò)增出Ⅰ＋3-15片段；pSen-EYFP -Ⅰ-LF與pSen-EYFP-HⅠ-LR擴(kuò)增出H-Ⅰ片段，這3個(gè)片段就能組裝成為PSen-tyrP＋3-15質(zhì)粒

1.2.3 核酸電泳及膠回收

目的片段擴(kuò)增完成后，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行核酸電泳，來判斷是否擴(kuò)增出目的片段，若有則進(jìn)行膠回收。按照Gel Extrction Kit（200）試劑盒對電泳的目的片段進(jìn)行回收?；厥掌螠y完濃度做好標(biāo)記后-20 ℃保存。

1.2.4 重疊延伸PCR

用重疊延伸PCR（SOE PCR）技術(shù)將HⅠ-X與Ⅰ-X進(jìn)行連接。具體操作參照文獻(xiàn)[9-10]。

1.2.5 酶切連接

構(gòu)建sinsor質(zhì)粒是用酶切連接的方法將HⅠ-X-Ⅰ與HⅠ-Ⅰ兩個(gè)大片段連接成環(huán)狀。將HⅠ-X-Ⅰ與HⅠ-Ⅰ兩個(gè)大片段進(jìn)行酶切，酶切后按照cycle-pure Kit（200）試劑盒方法進(jìn)行純化。純化后的酶切連接操作均按照Thermo FD 相關(guān)酶的說明書進(jìn)行。圖2為連接后的質(zhì)粒圖譜。

圖2 pSenPHE-tyrP質(zhì)粒圖譜圖

1.2.6 化學(xué)轉(zhuǎn)化及陽性驗(yàn)證

為驗(yàn)證是否連接成功，將連接后的體系用化學(xué)轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)中進(jìn)行初步抗性篩選。化學(xué)轉(zhuǎn)化方法參照文獻(xiàn)[11]。經(jīng)過初步篩選的菌株可用菌落PCR驗(yàn)證，再次篩選以除去突變的假陽性。PCR完成后進(jìn)行電泳，若片段長度為2 000～2 100 bp則證明連接陽性。

1.2.7 提取質(zhì)粒及測序

將陽性驗(yàn)證正確的單菌落接種到5 mL帶Cm抗性的液體LB中，在37 ℃搖床上過夜培養(yǎng)，第二天進(jìn)行提取質(zhì)粒并保存菌液以留作備用。吸取質(zhì)粒5 μL，上下驗(yàn)證引物各10 μL，標(biāo)上名稱并且填好測序單后送去測序，測序引物見表4。將驗(yàn)證正確的質(zhì)粒以及提取該質(zhì)粒保存的菌液留下，不正確的質(zhì)粒、菌液棄去。

表4 測序引物

1.3 流式細(xì)胞儀檢測元件起始熒光強(qiáng)度

將質(zhì)粒對應(yīng)的菌液在含有Cm抗性的平板上三級劃線，過夜培養(yǎng)后挑取單菌落接種到5 mL液體LB培養(yǎng)基中，并放入37 ℃搖床過夜培養(yǎng)；第二天以該菌液接種LB液體培養(yǎng)至菌液光密度（OD）到0.5～0.7，將菌液取出并且放入1.5 mL的EP管5 000 r/min 離心3 min，棄上清。將離心后的沉淀用預(yù)冷的1×PBS重懸，之后5 000 r/min 離心3 min以除去殘留的LB液體，再加入500 μL預(yù)冷的1×PBS重懸沉淀；取1.5 mL EP管加入990 μL預(yù)冷的1×PBS，再加入重懸的菌液10 μL，混勻后置于冰盒上檢測其熒光值。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果見表5。

表5 突變質(zhì)粒菌株初始熒光細(xì)胞流式儀檢測結(jié)果

1.4 L-Phe二肽誘導(dǎo)后熒光強(qiáng)度檢測

將菌株接種到5 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃搖床過夜培養(yǎng)，次日將過夜培養(yǎng)的菌液接種到無菌96孔板當(dāng)中。每個(gè)菌株做6個(gè)平行，另外接6個(gè)孔用于檢測OD，每個(gè)孔加入M9培養(yǎng)基600 μL，按照1∶50接菌（過夜培養(yǎng)的菌液12 μL），后用封口膜封口，37 ℃震蕩培養(yǎng)3～5 h，震蕩條件為800 r/min，相對濕度80%。從3 h開始檢測OD，當(dāng)OD達(dá)0.5～0.6時(shí)添加L-苯丙氨酸二肽。配制濃度為20 μg/μL苯丙氨酸二肽母液，添加苯丙氨酸二肽濃度見表6。加好后繼續(xù)震蕩培養(yǎng)并檢測熒光強(qiáng)度。

表6 苯丙氨酸二肽濃度配制表

2 結(jié)果與分析

突變質(zhì)粒菌株初始熒光強(qiáng)度流式數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖3。經(jīng)過數(shù)據(jù)分析后發(fā)現(xiàn)，突變-10和-35區(qū)的-15、-37、-38位點(diǎn)降低轉(zhuǎn)錄水平，對-11、-12、-13位點(diǎn)以及D2區(qū)域進(jìn)行突變則使轉(zhuǎn)錄水平增強(qiáng)，這也符合Yang等人的研究[4]。在＋3啟動(dòng)子單個(gè)突變位點(diǎn)基礎(chǔ)上進(jìn)行的組合突變說明，增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的突變位點(diǎn)組合具有一定的疊加效果，而在增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的突變位點(diǎn)組合中引入降低轉(zhuǎn)錄的突變位點(diǎn)則有明顯的抵消效果。

圖3 突變質(zhì)粒菌株初始熒光細(xì)胞流式儀統(tǒng)計(jì)結(jié)果

圖4為添加不同濃度后pSenPHE-tyrP的流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果，經(jīng)對比后可以看出，利用二肽誘導(dǎo)后突變的表達(dá)水平有明顯的變化：-11、-12、-13位點(diǎn)以及D2區(qū)域這些增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的突變位點(diǎn)不管是單獨(dú)還是進(jìn)行組合，它們的增加趨勢比未突變大；而降低轉(zhuǎn)錄的突變位點(diǎn)-37與增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的突變位點(diǎn)進(jìn)行組合后沒有增加趨勢。當(dāng)二肽濃度持續(xù)增大時(shí)，的表達(dá)均有下降的趨勢。

圖4 L-Phe二肽誘導(dǎo)突變菌株熒光變化情況

3 討論

對于pSen-tyrP質(zhì)粒在未添加Phe-Phe的樣品可檢測的熒光值，這歸因于在啟動(dòng)子控制下YFP的滲漏表達(dá)。啟動(dòng)子在L-Phe存在下被TyrR蛋白活化，且細(xì)胞外L-Phe濃度顯示與細(xì)胞內(nèi)L-Phe水平正相關(guān)[8]?；谶@個(gè)研究，在培養(yǎng)基中人工添加苯丙氨酸二肽，二肽通過轉(zhuǎn)運(yùn)途徑進(jìn)入胞內(nèi)后水解為L-Phe，從而改變胞內(nèi)L-Phe的濃度，最終用于調(diào)控的表達(dá)。

Yang等人研究了啟動(dòng)子單個(gè)位點(diǎn)的突變對表達(dá)的影響[4]，而本研究在單一突變的基礎(chǔ)上進(jìn)行多個(gè)突變位點(diǎn)的組合后發(fā)現(xiàn)，啟動(dòng)子強(qiáng)度并不僅僅是單個(gè)突變位點(diǎn)強(qiáng)度的加減，某些突變位點(diǎn)的組合會使啟動(dòng)子強(qiáng)度降低；用不同濃度的L-苯丙氨酸二肽進(jìn)行調(diào)控后，啟動(dòng)子強(qiáng)度的提升并不是一直增強(qiáng)，而且到達(dá)一定限度后隨著二肽濃度的增加，啟動(dòng)子強(qiáng)度反而會下降，對于這個(gè)問題，本研究認(rèn)為是培養(yǎng)液的滲透壓過高，導(dǎo)致細(xì)菌死亡而造成的。

4 結(jié)論

通過突變啟動(dòng)子，并將其與基因、前200個(gè)核苷酸連接到用于構(gòu)建生物傳感器的pSenlys質(zhì)粒中，構(gòu)建了一批pSen-tyrP質(zhì)粒。對pSen-tyrP質(zhì)粒測試發(fā)現(xiàn)，啟動(dòng)子的基礎(chǔ)活性發(fā)生了不同程度的增強(qiáng)或減弱，再對其進(jìn)行苯丙氨酸調(diào)控后發(fā)現(xiàn)：在一定濃度范圍內(nèi)，隨著L-苯丙氨酸濃度的升高，啟動(dòng)子強(qiáng)度也在一定范圍內(nèi)增強(qiáng)；并且與未突變啟動(dòng)子相比，突變-10區(qū)的-11、-12、-13位點(diǎn)以及d2區(qū)域后，突變啟動(dòng)子活性的增強(qiáng)趨勢較大，突變-37位點(diǎn)后沒有增強(qiáng)趨勢。這將有利于篩選出優(yōu)質(zhì)的突變啟動(dòng)子，為構(gòu)建L-Phe高產(chǎn)菌株奠定了基礎(chǔ)。

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責(zé)任編輯：張愛婷

Study onpromoter strength regulated by L-Phenylalanine

ZHAO Sheng1, LIU Yong-fei2, LIAN Zheng2, LIU Yan-fei1,Corresponding Author, ZHANG Da-wei2,Corresponding Author

（1. College of Animal Science and Veterinary Medicine, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China; 2. Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Science, Tianjin 300380, China）

TyrR is a global regulatory protein in the amino acid biosynthesis and transport pathway of（）, which controls the transcription of eight transcriptional units, including. Mutation of TyrR towas induced by site-directed mutagenesis of two RNAP（RNA polymerase）binding sites of thegene promoter, and the combination of TyrR and L-phenylalanine（L-Phe）greatly enhanced RNAP binding affinity on the downstream binding site（promoter）, so we can use L-Phe to control the promoter strength and then regulate the transcription level. In order to construct the L-Phe biosensor, thepromoter was transformed into a measurable fluorescence value, and thepromoter was used to construct the L-Phe biosensor. The intensity ofpromoter was controlled by L-Phe, and the intensity ofpromoter was changed. The intensity ofpromoter was changed in different degrees, and after L-Phe regulation,promoter intensity is also increased within a certain range with the concentration of L-Pheincreased. This is of great significance for the metabolic pathway of L-Phe production in E. coli, and it provides a new method for the construction of higher yield L-Phe strain.

TyrR;; L-Phenylalanine; biosensor; promoter intensity

Q815

A

1008-5394（2018）01-0049-05

10.19640/j.cnki.jtau.2018.01.011

2017-04-16

天津市科技支撐計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（11ZCZDSY08600）

趙勝（1995-），男，本科在讀，研究方向：微生物代謝。E-mail：zhaosheng355287@163.com。

劉燕霏（1970-），女，副教授，碩士，研究方向：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)。E-mail：674383573@qq.com。張大偉（1978-），男，研究員，博士，研究方向：微生物代謝。E-mail：zhang _dw@tib.cas.cn。