林濤，沈曉露*，潘豪杰，吳雪清

(1.溫州市人民醫(yī)院，溫州　325000；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，溫州　325000)

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(Recurrent spontaneous abortion，RSA)是指同一個(gè)性伴侶連續(xù)超過兩次妊娠均未成功，即連續(xù)遭受 2 次或 2 次以上自然流產(chǎn)或胚胎停育。結(jié)局是不能得到正常的有生機(jī)的胎兒(28周內(nèi))，RSA容易引起繼發(fā)不孕，給患者帶來強(qiáng)大的精神心理壓力，嚴(yán)重影響個(gè)人、夫妻雙方甚至整個(gè)家庭的生活品質(zhì)，對個(gè)人、家庭、社會影響較大，是目前生殖領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)。RSA在育齡期女性中的發(fā)病率為1%～3%[1]，其中50%以上原因不明，稱為不明原因性RSA(Unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA)[2]。現(xiàn)有研究表明，部分URSA患者會出現(xiàn)血栓前狀態(tài)(Prethrombotic state，PTS)，導(dǎo)致胎盤小、微血管內(nèi)血栓形成，胎盤血流灌注下降，較大的影響母體與胎兒之間的物質(zhì)交換[3-4]，最終引起流產(chǎn)。目前臨床上常用的PTS的指標(biāo)有：D-二聚體的檢測，同時(shí)行血同型半胱氨酸(Hcy)、活化蛋白C抵抗試驗(yàn)(APC-R)、凝血酶原時(shí)間(PT)、部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、凝血酶Ⅲ(ATⅢ)等檢測。

本研究通過大樣本的URSA病例，檢測代表PTS的D-二聚體的變化，同時(shí)聯(lián)合其它PTS的分子標(biāo)志物，如Hcy、PT、APTT、APC-R，找到URSA的PTS下D-二聚體的界值，及其它有價(jià)值的指標(biāo)聯(lián)合預(yù)測URSA，指導(dǎo)保胎，減少流產(chǎn)的發(fā)生率，并找到PTS的實(shí)驗(yàn)室可參考的臨界值及參考范圍，用來指導(dǎo)低分子肝素(LWMH)進(jìn)行保胎治療。

對象與方法

一、研究對象

收集2013年6月至2017年6月在本院婦科就診的2 975 例患者，其中要求門診行人工流產(chǎn)術(shù)、既往無稽留流產(chǎn)史的早孕患者1 160 例為早孕組(NEP組)；此次為宮內(nèi)早孕、單活胎、既往有≥2次稽留流產(chǎn)的患者673 例為RSA早孕組(AEP組)；既往有稽留流產(chǎn)史，此次未孕患者1 142 例(ANP組)。AEP及ANP納入標(biāo)準(zhǔn)為：單胎、無內(nèi)外科及婦科合并癥。排除標(biāo)準(zhǔn)為：(1)生殖道結(jié)構(gòu)畸形：超聲或?qū)m腔鏡檢查子宮畸形，如縱隔子宮、單角子宮等，子宮內(nèi)膜息肉和子宮黏膜下肌瘤；(2)糖尿病、甲狀腺疾病等內(nèi)分泌異常；(3)感染：弓形體病、風(fēng)疹、巨細(xì)胞性包涵體病毒、皰疹、梅毒(TORCH)陽性，衣原體、淋球菌感染；(4)夫婦染色異常；(5)自身免疫性疾?。嚎剐牧字贵w陰性，抗核抗體陽性，系統(tǒng)性紅斑狼瘡等；(6)血栓史。AEP、ANP、NEP患者檢測TORCH、空腹血糖、甲狀腺功能及其抗體、抗β2-GP-1抗體、狼瘡抗體、子宮B超，絨毛染色體檢查(胚胎停育者)等，對照研究。AEP及NEP患者除進(jìn)行D-二聚體的檢測，同時(shí)行血Hcy、APC-R、PT、APTT檢查。入選所有參加者均告知詳細(xì)細(xì)節(jié)并簽署知情同意書，本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)。

二、研究方法

1.分組：按本次生育意愿及既往有無不明原因復(fù)發(fā)流產(chǎn)史，分為NEP組：要求門診行人工流產(chǎn)術(shù)、既往無稽留流產(chǎn)史的早孕患者(1 160 例)；AEP組：此次為宮內(nèi)早孕、單活胎、既往有≥2次稽留流產(chǎn)的患者(673 例)；ANP組：既往有稽留流產(chǎn)史，此次未孕患者(1 142 例)。

2.樣本收集：所有患者均為單胎，AEP及NEP組B超提示宮內(nèi)單胎，見心搏，即查D-二聚體及其它各指標(biāo)。ANP組未孕，即查D-二聚體及其它各指標(biāo)。

3.指標(biāo)檢測：(1)D-二聚體水平檢測：采用免疫比濁法、懸浮法、分光光度法吸收測量含乳膠粒子的變化，含有共價(jià)包被有抗體的乳膠顆粒懸浮液的混合樣品?？乖贵w引起乳膠粒子的凝集反應(yīng)，可分光光度法測(2)Hcy：通過氧化型Hcy經(jīng)三乙羧乙基膦(TCEP)還原成游離的Hcy，Hcy和自由基反應(yīng)，循環(huán)放大，通過還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)+轉(zhuǎn)換成煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)后，吸光度檢測轉(zhuǎn)化率。(3)APC-R：基于對凝血時(shí)間測試的血漿放置在含鈣培養(yǎng)基中含有人體活化蛋白C和鈣化中的延長。(4)PT：用含鈣凝血活酶測定患者血漿凝固時(shí)間。(5)APTT：標(biāo)準(zhǔn)數(shù)量的腦磷脂(血小板替代物)和特定激活物(硅土)存在條件下血漿的復(fù)鈣時(shí)間。所有患者均行D-二聚體水平檢測，AEP及NEP患者除進(jìn)行D-二聚體的檢測，同時(shí)行血Hcy、APC-R、凝血酶原PT、APTT檢查。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graphpad Prism 6.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用受試者工作特征曲線(ROC)下面積(AUC)計(jì)算界值，界值取敏感性和特異性最大時(shí)D-二聚體及其它各項(xiàng)指標(biāo)的值。兩組數(shù)據(jù)之間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)　　果

一、各組患者的一般資料

三組患者的年齡、體重指數(shù)(BMI)、孕次數(shù)值相近，無顯著性差異；與AEP組相比，NEP組及ANP組的基礎(chǔ)FSH、抗苗勒管激素(AMH)略低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

表1　三組患者的一般資料(-±s)

二、AEP和NEP組各指標(biāo)的比較

AEP組中，D-二聚體的臨界值是0.65 mg/L，兩組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中D-二聚體ROC曲線下面積0.89(P<0.01)，對復(fù)發(fā)性流產(chǎn)有較好的診斷及預(yù)測價(jià)值(表2，圖1)。陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值分別為90.24%、72.67%。

表2　NEP與AEP患者PTS各指標(biāo)的比較

注：臨界值采用NEP組與AEP組相比較得出ROC曲線下面積

注：AUC為ROC曲線下面積圖1　NEP和AEP組D-二聚體和Hcy最佳界值判定的ROC曲線

Hcy、PT臨界值分別是9.75 μmol/L、12.85 s，兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而APCR、APTT則無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

AEP組中PT的AUC為0.55，陽性預(yù)測值36.79%(P<0.05)，對RSA有預(yù)測價(jià)值，其最佳臨界值取12.85 s(圖2)。NEP與ANP組的PT無顯著性差異(P>0.05)(圖3)。

圖2　NEP組和AEP組PT最佳界值判定的ROC曲線

圖3　ANP組與NEP組中PT值的比較

三、NEP與AEP、ANP三組D-二聚體的比較

與AEP組相比，NEP、ANP組的D-二聚體的臨界值及95%的區(qū)間值均顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；AEP組D-二聚體臨界值顯著大于NEP及ANP組(P<0.05)，但NEP與ANP組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表3)。

表3　三組患者D-二聚體水平的比較

注：與AEP組相比，*P<0.05

討　　論

URSA廣義上來講屬于不孕癥范圍，其特殊性是妊娠后連續(xù)性的胚胎丟失，而不能得到有生機(jī)兒，給個(gè)人、家庭及社會以沉重負(fù)擔(dān)，給孕婦沉重的心理負(fù)擔(dān)，對社會危害巨大。URSA病因復(fù)雜，但血栓及PTS形成是其共同的病理生理結(jié)果之一，導(dǎo)致胎盤內(nèi)小血栓形成，胎盤血流灌注下降，嚴(yán)重影響母胎之間的物質(zhì)交換進(jìn)而引起流產(chǎn)。目前尚無統(tǒng)一檢測PTS的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)及PTS的規(guī)范化治療或指南。本文通過對673 例URSA早孕組(AEP)與本次單活胎、既往無稽留流產(chǎn)史早孕患者1 160 例(NEP)進(jìn)行對比，分析了D-二聚體、Hcy、PT、APTT、APC-R五個(gè)PTS指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)D-二聚體、Hcy、PT對URSA有預(yù)測性，但D-二聚體敏感性及特異性最高，可作為篩查指標(biāo)；Hcy、PT的敏感性、特異性次于D-二聚體，但二者是否可以作為聯(lián)合篩查指標(biāo)仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。而APTT、APC-R作為URSA的PTS篩查指標(biāo)意義大不。同時(shí)對AEP、NEP、ANP三組病例進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)D-二聚體在三組中的關(guān)系是：AEP組比ANP及NEP組高，而ANP與NEP相比則無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。祝麗瓊等[5]的研究結(jié)果提示URSA患者未孕婦女D-二聚體水平同正常未孕婦女無差別，與上述結(jié)論一致。AEP組D-二聚體臨界值大于ANP及NEP組，說明URSA患者妊娠后血液進(jìn)一步進(jìn)入高凝狀態(tài)，D-二聚體較URSA未孕狀態(tài)高。說明D-二聚體水平升高可作為高凝狀態(tài)判斷指標(biāo)，可用來預(yù)測URSA血栓前狀態(tài)。

D-二聚體是提示PTS和繼發(fā)性纖溶亢進(jìn)極其敏感的指標(biāo)，在URSA中含量顯著升高，說明患者存在較為嚴(yán)重的PTS[6]。妊娠婦女，尤其是RSA患者，D-二聚體含量顯著高于正常妊娠婦女，提示RSA患者可能存在微血栓或PTS，導(dǎo)致胎盤組織微循環(huán)的缺血缺氧，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞受損進(jìn)而導(dǎo)致部分絨毛變性壞死，與此同時(shí)，機(jī)體啟動繼發(fā)性纖溶活動，以清除子宮靜脈竇以及螺旋動脈內(nèi)的血栓，從而加速再生和修復(fù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，最終顯示出來的是含量明顯升高的D-二聚體。同時(shí)，對于血栓已形成或有形成傾向，使用LWMH抗凝治療已得到國內(nèi)及國際的充分認(rèn)可，并且D-二聚體可以作為指導(dǎo)肝素使用及抗血栓的監(jiān)測指標(biāo)[7]。研究表明，D-二聚體含量在體內(nèi)升高，表明機(jī)體纖溶以及凝血系統(tǒng)均被激活，處于繼發(fā)性纖溶亢進(jìn)狀態(tài)，也是提示體內(nèi)血栓形成的重要指標(biāo)之一[8]。

D-二聚體在URSA患者再次妊娠的界值是0.65 mg/L，可以認(rèn)為在這個(gè)范圍內(nèi)，妊娠相對是安全的。超過這個(gè)范圍，即有使用肝素防止PTS或血栓，進(jìn)行保胎的必要性。目前臨床上公認(rèn)LMWH用來對URSA血栓前狀態(tài)進(jìn)行抗凝保胎治療，其應(yīng)用廣泛。臨床上目前除用常規(guī)黃體酮保胎外，對于URSA尚可用LWMH保胎，效果顯著，其判斷效果的最重要依據(jù)之一即是D-二聚體，URSA再次懷孕不加干預(yù)再次流產(chǎn)的概率約60%～70%。Tong等[9]對150名合并PTS的RSA孕婦用LWMH抗凝聯(lián)合阿司匹林保胎治療，保胎成功率高達(dá)84.3%甚至更高。D-二聚體是重要的預(yù)測和指導(dǎo)用藥指標(biāo)，可能的原因是LWMH降低孕婦血液高凝狀態(tài)，減小了血液粘滯度，降低小微血管的阻力，增加了胎盤血流量，改變了宮內(nèi)微環(huán)境，降低組織缺血缺氧，進(jìn)而促進(jìn)了胎兒的生長發(fā)育，減少胎盤血栓形成。

本研究結(jié)果顯示：Hcy在RSA產(chǎn)早孕患者中的界值是9.75 μmol/L。本研究結(jié)果所獲得的Hcy的界值與2006年美國心臟協(xié)會公布的“卒中指南”、世界衛(wèi)生組織出版的第11版《國際疾病分類》、2010年“中國高血壓防治指南”中，在防治干預(yù)價(jià)值、臨床檢測與診斷、篩查上，10 μmol/L這一水平為高同型半胱氨酸血癥(HHcy)閾值[10]，是大致相符的。大量研究證明，體內(nèi)HHcy是RSA的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，其有促凝的功能，超過正常范圍濃度的Hcy將導(dǎo)致孕婦出現(xiàn)RSA[11]。Eskes等[12]的研究進(jìn)一步證實(shí)HHcy與流產(chǎn)、宮內(nèi)生長受限(FGR)、胎盤早剝關(guān)系密切，HHcy是胎盤血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。HHcy同時(shí)伴有其他血栓形成危險(xiǎn)因素時(shí)，胎盤血管疾病導(dǎo)致的RSA的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)將成倍增加[13]。HHcy可引起絨毛血管分化發(fā)育不良，造成胚胎死亡、流產(chǎn)[14]。HHcy對RSA的影響，除了血管因素，還可能因?yàn)檠蠬cy含量過高，代謝時(shí)消耗大量的一碳單位，影響胚胎的DNA合成，導(dǎo)致流產(chǎn)的發(fā)生。另外，Hcy還可提高氧自由基含量，使得代謝紊亂，阻礙胚胎存活、阻礙神經(jīng)管發(fā)育，出現(xiàn)畸形。

上世紀(jì)末，Dahlback等[15]報(bào)道，在一些血栓或PTS疾病患者中，APTT并未延長，即使加入純化的活化蛋白 C也無明顯變化，這種現(xiàn)象被稱為APC-R現(xiàn)象。本研究中APC-R在預(yù)測RSA再次妊娠風(fēng)險(xiǎn)時(shí)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，即該指標(biāo)無臨床意義(注：本次研究檢驗(yàn)過程做過數(shù)次質(zhì)控)。該結(jié)果與部分文獻(xiàn)結(jié)果不一致，一般認(rèn)為APC-R與RSA存在一定的相關(guān)性。董衛(wèi)紅等[16]報(bào)道：胎盤部位的血栓形成是APC-R引起流產(chǎn)尤其是晚期流產(chǎn)的重要原因之一。APC-R 患者時(shí)常存在高凝狀態(tài)，妊娠后可短暫獲得APC-R升高，提高了血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)性。該文獻(xiàn)強(qiáng)調(diào)APC-R檢查結(jié)果與晚期流產(chǎn)的關(guān)系，而本文著重研究早期妊娠及早期RSA。Ayadurai等[17]發(fā)現(xiàn)，血漿中APC-R值經(jīng)歷過孕早期短暫上升以后，從孕 14 周開始逐步減少，到36周減少到最低點(diǎn)，產(chǎn)后 8 周恢復(fù)到正常水平。由于APC-R值越低，即加入APC后APTT的延長時(shí)間越短，則APC-R的陽性率越高，發(fā)生血栓的危險(xiǎn)越大，該文獻(xiàn)強(qiáng)調(diào)14周后APC-R的陽性率上升。故可認(rèn)為，早期RSA患者孕早期(13周內(nèi))APC-R無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Pihusch等[18]認(rèn)為早期反復(fù)流產(chǎn)與APC-R無關(guān)。本結(jié)果與其相一致。

PT和APTT是臨床上對凝血功能的常規(guī)檢查，屬于反映凝血系統(tǒng)的篩選試驗(yàn)：凝血因子I、Ⅱ、V、Ⅶ、X的含量及水平表現(xiàn)在PT的值，是臨床上最常用的反映外源性凝血路徑的篩選方法，血液呈現(xiàn)高凝狀態(tài)時(shí)PT值顯著縮短。APTT反映內(nèi)源性凝血途徑中與除第Ⅶ、Ⅷ因子外的所有促凝物質(zhì)有關(guān)[19]。本研究中，PT值在RSA患者再次妊娠中有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，PT值下降，界值是12.85 s，而在URSA未妊娠患者與正常妊娠患者中，PT值則無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與黃鈺華等[20]的研究一致，他們認(rèn)為在RSA早期妊娠者的PT值較未妊娠者明顯縮短，與妊娠期凝血因子合成增多，形成血液的高凝狀態(tài)有關(guān)。

綜上所述，URSA中PTS作為其共同的病理生理結(jié)果，其在臨床上已達(dá)成共識并逐漸得到重視，D-二聚體作為PTS的指標(biāo)之一，因其無創(chuàng)性、可重復(fù)性及敏感性，廣泛應(yīng)用于臨床。本研究通過較大樣本的URSA病例，檢測代表血栓前狀態(tài)的D-二聚體的變化，同時(shí)聯(lián)合其它PTS分子標(biāo)志物，如PT、APTT、Hcy、APC-R，得到URSA-PTS狀態(tài)D-二聚體的臨界值，及其它有價(jià)值的PTS分子標(biāo)志物參考值。嘗試解決目前臨床上PTS的臨界值及參考值都是針對正常未孕人群制定的，缺乏URSA的PTS參考范圍的局面。本文大樣本量的URSA再次早孕患者與正常無不良孕史的早孕人群進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，結(jié)論是：早期URSA患者D-二聚體水平顯著升高，存在血栓形成傾向，D-二聚體檢測可預(yù)測URSA發(fā)生血栓的可能性，改善妊娠結(jié)局。URSA再次妊娠早孕期D-二聚體的臨界值為0.65 mg/L，可認(rèn)為排除其它引起高凝狀態(tài)的病因，這一范圍的D-二聚體繼續(xù)妊娠是相對安全的。

但本研究仍存在一些不足，即未對D-二聚體 0.65 mg/L這一臨界值在URSA再次懷孕早期患者中使用LWMH保胎情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，其在保胎中的應(yīng)用價(jià)值需進(jìn)一步驗(yàn)證，也是該項(xiàng)研究的下一步思路。另外，目前尚有一些文獻(xiàn)及研究發(fā)現(xiàn)B超下子宮動脈血流阻力對URSA有提示及預(yù)測作用[21]，進(jìn)一步研究預(yù)計(jì)增加行B超下子宮動脈血流結(jié)合PTS分子標(biāo)志物預(yù)測URSA，希望能指導(dǎo)LWMH進(jìn)行保胎。

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