徐士儒，王云霞，連若純，張諝，陳偉洪，何來(lái)賓，陳婉如，陳現(xiàn)*

(1.深圳中山泌尿外科醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，深圳市圍著床期生殖免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，深圳中山生殖與遺傳研究所，深圳　518045；2.深圳市福田區(qū)婦幼保健院婦產(chǎn)科，深圳　518045)

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(recurrent miscarriage，RM)是指孕20周前連續(xù)發(fā)生3次或3次以上的自然流產(chǎn)，在育齡婦女中發(fā)病率為1%～3%[1]。研究表明，引起RM的病因主要包括遺傳、內(nèi)分泌和解剖結(jié)構(gòu)異常、生殖道感染等，另外還有約40%～50%的患者病因不明[1]。免疫因素在RM的發(fā)生過(guò)程中可能起著重要的作用。正常妊娠的維持需要母體對(duì)胎兒產(chǎn)生免疫耐受，而免疫因素引起的RM可能是免疫耐受機(jī)制被破壞的結(jié)果。自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell，NK cell)在妊娠免疫機(jī)制中起著重要的調(diào)節(jié)作用，與RM中母胎免疫紊亂機(jī)制相關(guān)。周?chē)狢D3-CD56+NK細(xì)胞的比例及NK細(xì)胞毒性增加可能與RM患者的不良妊娠結(jié)局有關(guān)[2-3]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)維生素D對(duì)免疫系統(tǒng)有著重要的調(diào)節(jié)作用。特別是活性1，25(OH)2D，可抑制T淋巴細(xì)胞的增值和分化[4]，能夠促進(jìn)Th1向Th2型免疫反應(yīng)的轉(zhuǎn)變[5]，以及能夠抑制B細(xì)胞的增殖、漿細(xì)胞的分化和IgG抗體的分泌[6]。上述研究表明維生素D是一重要的免疫調(diào)節(jié)因子，維生素D缺乏可能參與了某些免疫因素介導(dǎo)的疾病發(fā)生。目前維生素D水平如何影響RM患者外周血NK細(xì)胞的數(shù)量和毒性尚不明確。本研究旨在探究RM患者血清中維生素D水平與外周血NK細(xì)胞數(shù)量和毒性的關(guān)系，以期為尋找RM的病因和臨床治療策略提供新的方向。

材料與方法

一、研究對(duì)象

選取2014年1月至2016年3月首次來(lái)本院治療的99例的不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(unexplained recurrent miscarriage，uRM)患者為研究對(duì)象。所有患者均經(jīng)過(guò)詳細(xì)詢(xún)問(wèn)病史、全身及婦科檢查、染色體核型分析、宮腔感染和宮腔鏡以及內(nèi)分泌等系統(tǒng)性檢查，入選標(biāo)準(zhǔn)為：(1)抗磷脂抗體(如抗β2糖蛋白1抗體、抗心磷脂抗體、抗磷脂酰絲氨酸抗體等)、抗核抗體(抗SSA抗體、抗SSB抗體、抗Sm抗體等)和抗甲狀腺抗體檢測(cè)為陰性；(2)夫婦雙方染色體及胚胎染色體核型分析正常；(3)女方無(wú)生殖道感染和生殖道畸形；(4)內(nèi)分泌激素水平正常；(5)未有藥物治療或維生素D補(bǔ)充史。所有患者均在黃體中期首次抽取外周血，并于當(dāng)天分別檢測(cè)維生素D水平，NK細(xì)胞比例和NK細(xì)胞毒性。

根據(jù)內(nèi)分泌協(xié)會(huì)臨床實(shí)踐指南，維生素D缺乏為25(OH)D水平<20 ng/ml，維生素D不足為25(OH)D在20～29.9 ng/ml之間，維生素D充足為25(OH)D≥30 ng/ml[7]。因此，本研究的99例RM患者根據(jù)其血清中25(OH)D水平被分為三組，即維生素D正常(vitamin D normal group，VDN)組35例、維生素D不足(vitamin D insufficiency group，VDI)組51例和維生素D缺乏(vitamin D deficiency group，VDD)組13例。維生素D不足和缺乏的患者每天口服0.5 μg的1，25(OH)2D(羅蓋全，上海羅氏制藥有限公司)，時(shí)長(zhǎng)2個(gè)月。64例患者中，1例患者失訪，3例拒絕1，25(OH)2D治療，23例患者在維生素D補(bǔ)充過(guò)程中聯(lián)合了其它治療(如淋巴細(xì)胞治療)。僅有37例患者為單純1，25(OH)2D治療，其中有2例來(lái)自VDD組?？紤]到VDD組的樣本過(guò)少，因此將維生素D不足和缺乏的患者混合為一組。1，25(OH)2D治療后，再次抽取患者黃體中期的周?chē)?，并檢測(cè)其N(xiāo)K細(xì)胞比例和細(xì)胞毒性。本研究入選患者均簽署檢測(cè)項(xiàng)目和治療知情同意書(shū)，實(shí)驗(yàn)流程獲得醫(yī)院學(xué)術(shù)與倫理學(xué)委員會(huì)許可。

二、實(shí)驗(yàn)設(shè)備和試劑

1.實(shí)驗(yàn)設(shè)備：ARCHITECT PLUS isR 2000自動(dòng)化檢測(cè)系統(tǒng)(Abbott，美國(guó))，BD FACSCanto II流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson，美國(guó))。

2.主要實(shí)驗(yàn)試劑：ARCHITECT 25-OH Vitamin D Reagent Kit(Abbott，美國(guó))，BD Multitest 6-color TBNK Reagent Kit(Becton Dickinson，美國(guó))，BD FACS裂解液(Becton Dickinson，美國(guó))，K562細(xì)胞株(購(gòu)自武漢大學(xué)保藏中心)，碘化丙啶(PI，Sigma，美國(guó))，10-壬基溴代吖啶橙染料(DIO，Invitrogen，美國(guó))，淋巴細(xì)胞分離液(Axis-Shield，挪威)，RPMI 1640培養(yǎng)基(Invitrogen，美國(guó))，新生牛血清(杭州四季青公司，中國(guó))。

三、方法

1.維生素D水平檢測(cè)：血清中25(OH)D水平的檢測(cè)采用化學(xué)發(fā)光微粒子免疫方法，所有步驟根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)完成。

2.外周血NK細(xì)胞數(shù)量檢測(cè)：采用免疫熒光流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)。逆向加樣法加入肝素抗凝血100 μl于Trucount管(Becton Dickinson，美國(guó))中，再分別加入CD45-PerCP、CD3-FITC和CD16/CD56-PE抗體，室溫避光標(biāo)記15 min，加入經(jīng)10倍稀釋的BD FACS裂解液 2 ml，振勻，室溫避光10 min，樣本充分溶血后用PBS洗滌2次，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，并用FACSDiva軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)獲取和分析，計(jì)數(shù)CD3-CD16+CD56+NK細(xì)胞的比例。

3.NK細(xì)胞毒性檢測(cè)[8]：抽取患者肝素抗凝血15 ml，用Ficoll密度梯度法分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)，充分洗滌后，用完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1 × 107/ml備用；同時(shí)收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562細(xì)胞(NK細(xì)胞敏感的靶細(xì)胞)，加入PBS緩沖液10～20 ml重懸細(xì)胞，室溫離心，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml；按細(xì)胞數(shù)1×106/ml加入3 mmol/L DIO染料，37℃孵育20 min；染色結(jié)束后，將K562細(xì)胞懸液用培養(yǎng)液洗滌2次；棄上清，通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)用完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105/ml備用；將處理好的PBMCs及K562細(xì)胞分別以50∶1、25∶1和12.5∶1的比例混合培養(yǎng)在96孔培養(yǎng)板中，每個(gè)比例設(shè)3個(gè)重復(fù)，每孔用培養(yǎng)液補(bǔ)足至200 μl；置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱混合培養(yǎng)4 h；4 h后，在混合培養(yǎng)孔中加入PI對(duì)死亡的K562細(xì)胞進(jìn)行染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，F(xiàn)ACSDiva軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有統(tǒng)計(jì)分析均采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。治療前各組NK細(xì)胞比例和NK細(xì)胞毒性采用單因素方差分析；治療前后NK細(xì)胞比例和NK細(xì)胞毒性變化采用配對(duì)t檢驗(yàn)分析，以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

結(jié)　　果

一、RM患者一般資料及維生素D 水平

99例RM患者中，35例(35.4%)患者維生素D水平正常(≥30 ng/ml)，51例患者(51.5%)維生素D不足(20～29.9 ng/ml)，13例(13.1%)為患者維生素D缺乏(<20 ng/ml)。

RM患者的流產(chǎn)次數(shù)和維生素D水平在三組間具有顯著差異，而三組間的年齡、體重指數(shù)(BMI)無(wú)顯著差異(P>0.05)(表1)。

表1　RM患者的基線資料及維生素D水平(-±s)

注：與VDN組相比，*P<0.05；與VDI組相比，#P<0.05

二、外周血NK細(xì)胞數(shù)量和NK細(xì)胞毒性

外周血中CD3-CD56+NK細(xì)胞比例在三組間無(wú)明顯差異(P>0.05)。三組間的NK細(xì)胞毒性情況：與VDN組相比，效靶比(effector-to-target ratio，E∶T)為50∶1、25∶1和12.5∶1的NK細(xì)胞毒性在VDI中顯著增加(P<0.05)。而且，E∶T為25∶1和12.5∶1的情況下，NK細(xì)胞毒性在VDD和VDN兩組中有顯著差異(P<0.05)。然而，在E∶T為50∶1的情況下，VDI和VDD兩組的NK細(xì)胞毒性無(wú)顯著差異(P>0.05)(圖1，表2)。

A：三組CD3-CD56+ NK細(xì)胞的比例分析；B、C、D：三組效靶比為50∶1、25∶1和12.5∶1的NK細(xì)胞毒性，相互比較，*P<0.05圖1　RM患者外周血NK細(xì)胞數(shù)量和NK毒性的比較

三、1，25(OH)2D補(bǔ)充對(duì)外周血NK細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞毒性的影響

低維生素D水平的RM患者經(jīng)維生素D治療后，CD3-CD56+NK細(xì)胞比例與治療前相比無(wú)顯著差異(P>0.05)。NK細(xì)胞毒性在三個(gè)E：T條件下均顯著降低(P<0.05)(圖2，表3)。

A：治療前后CD3-CD56+ NK細(xì)胞的比例分析；B、C、D：治療前后效靶比為50∶1、25∶1和12.5∶1的NK細(xì)胞毒性，**P<0.01圖2　1，25(OH)2D對(duì)RM患者外周血NK細(xì)胞數(shù)量和NK毒性的影響

組別例數(shù)CD3-CD56+NK細(xì)胞(%)效靶比(E∶T)50∶125∶112 5∶1VDN3515 7±5 345 3±12 435 8±11 823 0±10 6VDI5117 1±7 051 6±8 8?43 2±9 1?30 2±10 3?VDD1316 4±7 152 3±12 1?45 4±11 9?#32 8±11 0?#

注：與VDN組相比，*P<0.05；與VDI組相比，#P<0.05

表3　1，25(OH)2D對(duì)RM患者外周血NK細(xì)胞數(shù)量和NK毒性的影響(n=37，-±s)

注：與治療前相比，*P<0.05

討　　論

生殖免疫學(xué)觀點(diǎn)認(rèn)為，妊娠是一種成功的同種異體移植，認(rèn)為RM的發(fā)生是同種異體移植失敗。成功妊娠依賴(lài)于母體對(duì)胎兒產(chǎn)生正確的識(shí)別和免疫耐受。NK細(xì)胞為異質(zhì)性細(xì)胞群體，根據(jù)其表面CD56分子的表達(dá)水平主要分為CD56dimCD16+和CD56brightCD16-NK兩個(gè)細(xì)胞亞群，CD56dimCD16+NK細(xì)胞具有較強(qiáng)的殺傷功能，能夠誘導(dǎo)NK細(xì)胞的抗體依賴(lài)細(xì)胞毒性反應(yīng)(ADCC)，對(duì)同種異體抗原具有殺傷作用，可在絨毛間隙中直接與絨毛接觸殺傷胚胎[9]。CD56brightCD16-NK細(xì)胞主要功能是分泌細(xì)胞因子如干擾素(IFN-γ)和腫瘤壞死因子(TNF)-β等，殺傷功能較弱。由此可見(jiàn)，NK細(xì)胞在妊娠的建立和維持以及胎盤(pán)的發(fā)育過(guò)程中同樣發(fā)揮著重要作用。文獻(xiàn)報(bào)道，RM患者外周血中NK細(xì)胞比例和毒性均顯著增加[3]，認(rèn)為NK細(xì)胞數(shù)量的增加是導(dǎo)致RM的一個(gè)重要因素[10]。與非妊娠女性比較，早期妊娠的女性其外周血中NK細(xì)胞活性顯著降低[3]。這些結(jié)果均表明NK細(xì)胞比例和毒性的降低可能能夠抑制母體對(duì)胎兒的同種免疫反應(yīng)。

維生素D是維持人體生命所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，機(jī)體所需的大部分維生素D可在日光照射下由皮膚內(nèi)的7-脫氫膽固醇轉(zhuǎn)變而來(lái)，同時(shí)也可以從富含維生素D的食物中獲得。由皮膚生成的和食物來(lái)源的維生素D在肝臟中經(jīng)25羥基化酶的催化作用首先生成25(OH)D，血清25(OH)D是血液循環(huán)中維生素D的主要存在形式，常作為評(píng)價(jià)體內(nèi)維生素D營(yíng)養(yǎng)狀況的指標(biāo)。隨后，25(OH)D在腎臟1a羥基化酶的作用下轉(zhuǎn)換為具有活性的1，25(OH)2D，從而促進(jìn)腸道鈣離子的吸收以及骨代謝[7]。長(zhǎng)期以來(lái)，人們對(duì)維生素D的認(rèn)識(shí)主要集中在對(duì)骨代謝的調(diào)節(jié)。自1980年，人們發(fā)現(xiàn)維生素D受體在多種免疫細(xì)胞上表達(dá)后，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)維生素D對(duì)免疫系統(tǒng)有著重要的調(diào)節(jié)作用，與多種疾病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[11-12]。

近年來(lái)越來(lái)越多證據(jù)表明維生素D缺乏或不足與婦產(chǎn)科妊娠并發(fā)癥有關(guān)[13]。本研究數(shù)據(jù)表明在RM患者中維生素D缺乏或不足的比例較高，維生素D缺乏或不足的RM患者外周血NK細(xì)胞毒性顯著增加。本研究結(jié)果與Ota等[14]報(bào)道一致，認(rèn)為維生素D可參與調(diào)節(jié)RM患者的NK細(xì)胞毒性；他們還發(fā)現(xiàn)，維生素D對(duì)RM患者NK細(xì)胞數(shù)量也有顯著的調(diào)節(jié)作用。然而，本研究結(jié)果表明，與維生素D正常水平的RM患者比較，維生素D缺乏或不足的患者CD3-CD56+NK細(xì)胞的比例并沒(méi)有顯著變化。這些結(jié)果均表明維生素D可能對(duì)RM患者外周血NK細(xì)胞毒性起著重要的調(diào)節(jié)作用。因此，推測(cè)維生素D對(duì)NK細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞毒性的影響是相互獨(dú)立的。維生素D對(duì)NK細(xì)胞毒性的影響可能與穿孔素和顆粒酶的分泌有關(guān)，而與NK細(xì)胞數(shù)量無(wú)關(guān)[14]。由此可見(jiàn)，充足的維生素D水平在調(diào)控RM患者外周血NK細(xì)胞活性過(guò)程中可能發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

本研究結(jié)果尚表明維生素D的補(bǔ)充對(duì)RM患者以上這些異常的細(xì)胞免疫反應(yīng)具有一定的調(diào)節(jié)作用，RM患者經(jīng)過(guò)1，25(OH)2D治療后，其外周血所有效靶比條件下的NK細(xì)胞毒性均顯著降低。本研究結(jié)果與早期的研究結(jié)果一致[6，15-17]。根據(jù)最近的文獻(xiàn)報(bào)道，維生素D能夠促進(jìn)胞漿中去極化的穿孔素的表達(dá)，從而降調(diào)RM患者的NK細(xì)胞毒性[12]。但是，目前為止1，25(OH)2D對(duì)NK細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制仍不清楚。

綜上所述，在RM患者中維生素D缺乏或不足具有一定的免疫學(xué)意義。低水平RM患者其外周血NK細(xì)胞毒性可能異常增加，而補(bǔ)充1，25(OH)2D后可顯著降調(diào)NK細(xì)胞毒性。因此，對(duì)具有NK細(xì)胞毒性異常增加的RM患者，補(bǔ)充維生素D可作為一種新的輔助治療方案。

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