高翠娟，鄭亞琴

臨沂大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 臨沂　276000

隨著化石資源的不斷消耗以及環(huán)境污染問(wèn)題的加劇，利用微生物合成高附加值的工業(yè)產(chǎn)物受到愈來(lái)愈多的關(guān)注與重視[1]。在眾多的平臺(tái)化合物中，琥珀酸在食品、化工、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域都具有非常廣泛的應(yīng)用[2-3]。琥珀酸還可以作為中間體合成γ-丁內(nèi)酯、1,4-丁二胺、四氫呋喃等化合物[4]。眾多附加應(yīng)用使得琥珀酸在 2004年被美國(guó)能源部確定為最具價(jià)值的生物煉制產(chǎn)品[5]。

在微生物細(xì)胞內(nèi)，琥珀酸是TCA循環(huán)的中間代謝產(chǎn)物，因此可利用生物質(zhì)原料發(fā)酵法生產(chǎn)琥珀酸[6-7]。當(dāng)前，利用大腸桿菌等基因工程菌生產(chǎn)琥珀酸可以達(dá)到較高的產(chǎn)率和產(chǎn)量，但是細(xì)菌不耐受酸及滲透壓，需要添加堿液以維持中性的發(fā)酵環(huán)境[8-10]。發(fā)酵過(guò)程持續(xù)不斷的pH值調(diào)節(jié)增加了染菌的概率。發(fā)酵結(jié)束后需要用酸調(diào)節(jié) pH值至酸性，使琥珀酸鹽轉(zhuǎn)變成琥珀酸，發(fā)酵成本大幅增加[11]。跟細(xì)菌等原核生物相比較，酵母能耐受低pH值，增加了其在工業(yè)應(yīng)用的優(yōu)勢(shì)。

解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica是非傳統(tǒng)酵母，嚴(yán)格好氧，利用完整的TCA循環(huán)和電子傳遞鏈維持生長(zhǎng)[12-13]。它能積累大量的有機(jī)酸，包括檸檬酸、異檸檬酸、α-酮戊二酸等[14-16]。經(jīng)過(guò)代謝工程改造后，敲除琥珀酸脫氫酶 (Succinate dehydrogenase，SDH)的編碼基因或者弱化該基因的啟動(dòng)子，Y. lipolytica可積累琥珀酸[17-18]。2010年Gao 等通過(guò)敲除Sdh2亞基成功構(gòu)建可積累4.0 g/L琥珀酸的Y. lipolytica重組菌，隨后采用化學(xué)誘變的方法獲得琥珀酸產(chǎn)量進(jìn)一步提高的突變株。我們課題組通過(guò)基因敲除Y. lipolyticaPo1f的 SDH的Sdh5亞基獲得了重組菌PGC01003[19]。PGC01003在不控制 pH值的中性環(huán)境下以甘油作碳源發(fā)酵足夠長(zhǎng)時(shí)間能生產(chǎn)琥珀酸，這充分證明了該菌株的魯棒性。然而，實(shí)驗(yàn)存在一些亟待解決的問(wèn)題。重組菌在發(fā)酵產(chǎn)生琥珀酸的同時(shí)，由于代謝溢出，還產(chǎn)生較多的副產(chǎn)物乙酸。乙酸對(duì)菌體具有毒害作用，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和琥珀酸發(fā)酵。如果不控制發(fā)酵液的pH值，琥珀酸的產(chǎn)量很低[19]。

為實(shí)現(xiàn)低 pH值發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸，我們對(duì)Y. lipolytica乙酸代謝的可能途徑進(jìn)行分析，并通過(guò)代謝工程的策略降低乙酸的溢出 (圖 1)。首先干擾旁路代謝 (Pyruvate dehydrogenase bypass，PDH bypass)，基因敲除丙酮酸脫羧酶 (Pyruvate decarboxylase，PDC)基因或者過(guò)量表達(dá)乙酰輔酶A合酶 (Acetyl coenzyme A synthetase，ACS)，分析重組菌的乙酸產(chǎn)量變化。隨后基因敲除乙酰輔酶A水解酶 (Acetyl-CoA hydrolase，ACH1)，獲得重組菌PGC11505，乙酸分泌量大幅降低。

圖1　解脂酵母Y. lipolytica的主要中心代謝途徑Fig. 1　Central pathways related to succinic acid production of Y. lipolytica.

1　材料與方法

1.1　菌種和質(zhì)粒

解脂酵母Y. lipolyticaPo1f (URA3–，Leu2–)由法國(guó)INRA實(shí)驗(yàn)室的Madzak Catherine教授饋贈(zèng)。產(chǎn)琥珀酸的重組酵母菌株均為作者所在實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保存[20]，詳見(jiàn)表1。

1.2　培養(yǎng)基

酵母種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)基為 YPG完全培養(yǎng)基，含20 g/L甘油，20 g/L蛋白胨，10 g/L酵母粉，自然pH。制備固體培養(yǎng)基時(shí)添加2%的瓊脂。

1.3　培養(yǎng)方法

1.3.1　種子培養(yǎng)

挑取生長(zhǎng)良好的單菌落接種于含 50 mL的YPG液體培養(yǎng)基的 250 mL三角瓶中，28 ℃、220 r/min培養(yǎng)24 h。

1.3.2　乙酸耐受培養(yǎng)

將種子培養(yǎng)液按 1%接種量轉(zhuǎn)接至含不同濃度乙酸 (1、2、5 g/L) 的 YPG 液體培養(yǎng)基中，28 ℃、220 r/min 培養(yǎng) 24?48 h。

1.3.3　搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

將種子培養(yǎng)液按1%接種量轉(zhuǎn)接至50 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基 YPG中，28 ℃、220 r/min培養(yǎng)，定時(shí)取樣測(cè)定菌體OD600、甘油和有機(jī)酸的含量。

1.4　分析檢測(cè)

菌體濃度采用分光光度計(jì)測(cè) 600 nm下的吸光度。采用HPLC定量檢測(cè)發(fā)酵液中的甘油和有機(jī)酸的含量。HPLC分析條件：流動(dòng)相為5 mmol/L稀硫酸，色譜柱為 Aminex HPX-87H (Bio-Rad，USA)，流速 0.6 mL/min，柱溫 65 ℃，進(jìn)樣量 10 μL，檢測(cè)器為示差折光檢測(cè)器。

表1　本文所用的產(chǎn)琥珀酸重組酵母Table 1　Strains of recombinant Y. l ipolytica for succinic acid production

2　結(jié)果與分析

2.1　重組菌PGC01003的琥珀酸發(fā)酵

前期，基因敲除了解脂酵母 Po1f菌株中參與TCA循環(huán)的琥珀酸脫氫酶 (Succinate dehydrogenase，SDH) 的Sdh5亞基編碼基因Ylsdh5，成功構(gòu)建了琥珀酸脫氫酶失活的突變株，獲得可積累琥珀酸的解脂酵母重組菌 PGC01003[19]。圖 2分別列出了重組菌PGC01003和對(duì)照菌Po1f在YPG搖瓶發(fā)酵時(shí)甘油濃度、菌體OD值、琥珀酸、乙酸、檸檬酸的產(chǎn)量?？梢钥吹?，重組菌 PGC01003從24 h開(kāi)始菌體生長(zhǎng)減緩，30 h達(dá)到穩(wěn)定期，OD值最大為14.0，發(fā)酵結(jié)束時(shí)甘油仍殘余3.8 g/L。而Po1f可以持續(xù)生長(zhǎng)至72 h，直至甘油消耗完全方停止生長(zhǎng)，OD值達(dá)到 33.5。Po1f的發(fā)酵產(chǎn)物主要是檸檬酸 (5.0 g/L)，只有極少量的琥珀酸和乙酸產(chǎn)生，PGC01003幾乎不分泌檸檬酸 (0.4 g/L)，產(chǎn)生5.0 g/L琥珀酸。由于代謝流量不平衡，PGC01003發(fā)生代謝溢出，產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物乙酸，在24 h時(shí)生成2.8 g/L乙酸，30 h時(shí)繼續(xù)增加至4.8 g/L，48 h時(shí)乙酸濃度高達(dá)6.1 g/L，發(fā)酵終止。

為檢驗(yàn)增加溶氧是否有助于改善重組菌PGC01003的生長(zhǎng)和琥珀酸生成，我們采用不帶/帶擋板的搖瓶以及不同裝液量進(jìn)行發(fā)酵 (圖 3)。由圖 3A可以看出，由于溶氧的增加，使用帶擋板的搖瓶可以提高對(duì)照菌Po1f的菌體生長(zhǎng)，其OD值由34.0增至71.0，增長(zhǎng)了1倍。然而，裝液量為30 mL和50 mL時(shí)是否帶擋板對(duì)PGC01003的生物量影響較少；裝液量提高到80 mL以上時(shí)，PGC01003在帶擋板的搖瓶中生長(zhǎng)較好，可獲得更高的生物量。此外，在裝液量相同的發(fā)酵液中帶擋板搖瓶的琥珀酸產(chǎn)量略有降低 (圖3B)，這可能是增加的溶氧促進(jìn)了菌體的前期生長(zhǎng)和維持所致。通過(guò)改變裝液量或采用帶擋板的搖瓶來(lái)改變發(fā)酵液溶氧的方式不能提高重組菌的琥珀酸產(chǎn)量。

圖2　解脂酵母PGC01003 (A) 和Po1f (B) 的琥珀酸發(fā)酵比較Fig. 2　Fermentation profiles of PGC01003 (A) and Po1f (B) in YPG flasks. Squares stand for OD600,circles stand for glycerol concentrations,diomands stand for succinic acid concentrations,upright triangles stand for acetic acid concentrations and inverted triangles stand for citric acid concentrations.

圖3　PGC01003在不帶/帶擋板的搖瓶以及不同裝液量條件下菌體OD值 (A) 和琥珀酸產(chǎn)量分析 (B)Fig. 3　OD (A) and succinic acid fermentation (B) of PGC01003 in flasks without/with baffles and with varied volumes of fermentation broth.

2.2　PDH旁路改造對(duì)琥珀酸發(fā)酵的影響

為提高琥珀酸的產(chǎn)量，首先采用代謝工程干擾 PDH旁路的策略阻斷乙酸的溢出。PDH旁路由丙酮酸脫羧酶催化細(xì)胞質(zhì)丙酮酸脫羧生成乙醛，乙醛在乙醛脫氫酶的作用下氧化為乙酸。細(xì)胞質(zhì)的乙酸可以進(jìn)一步被乙酰輔酶 A合酶(Acetyl-CoA synthase，ACS) 轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A。乙酰輔酶A作為細(xì)胞內(nèi)的高能代謝物，參與許多重要的合成和分解代謝[21]。本實(shí)驗(yàn)分別采用基因敲除丙酮酸脫羧酶編碼基因Ylpdc、過(guò)量表達(dá)ACS的方法降低乙酸的濃度。

敲除 PGC01003的Ylpdc基因獲得重組菌株P(guān)GC11203，PGC11203在 YPG培養(yǎng)基發(fā)酵 72 h仍產(chǎn)生較高的乙酸 (表2)，琥珀酸的產(chǎn)量和菌體OD略有下降，Ylpdc基因的缺失不但沒(méi)有降低乙酸的溢出，而且還影響菌體的生長(zhǎng)和琥珀酸發(fā)酵。另一替代策略是在PGC01003中過(guò)量表達(dá)ACS，將細(xì)胞質(zhì)中多余的乙酸轉(zhuǎn)化為高能化合物乙酰輔酶A。分別表達(dá)了Y. lipolytica自身的ACS和來(lái)自沙門(mén)氏菌Salmonella enterica的ACS，所構(gòu)建的新菌株分別是PGC11301 (Ylacs) 與PGC11401(oSEacsL641P)。文獻(xiàn)報(bào)道，ACS的活性受到翻譯后乙?；c去乙酰化系統(tǒng)修飾。而將S. enterica的ACS蛋白質(zhì)中第641位的脯氨酸替換為亮氨酸可阻止其乙?；?，進(jìn)而維持其活性狀態(tài)[21]。根據(jù)Y. lipolytica的密碼子偏好優(yōu)化了SEacsL641P，并合成全新的基因序列oSeacs用于在Y. lipolytica的表達(dá)，其發(fā)酵情況如表2所示。PGC11301的發(fā)酵情形與PGC01003相當(dāng)，表明直接表達(dá)Y. lipolytica自身的 ACS不能有效控制乙酸的溢出。相比之下，異源表達(dá)oSEacsL641P的重組菌PGC11401的菌體OD600增加至14.4，琥珀酸產(chǎn)量為6.3 g/L (提高了 14.5%)，乙酸產(chǎn)量降至 4.6 g/L，下降了24.6%。對(duì)PDH旁路途徑的擾動(dòng)策略中，僅表達(dá)異源的oSEacsL641P降低了乙酸溢出，進(jìn)而改善菌體生長(zhǎng)，增加琥珀酸生產(chǎn)。經(jīng)過(guò)點(diǎn)突變的oSEacsL641P能有效保持活性狀態(tài)，催化乙酸生成乙酰輔酶A。

2.3　基因敲除Ylach1對(duì)琥珀酸發(fā)酵的影響

異源表達(dá)oSEacsL641P降低了乙酸產(chǎn)出，但是重組菌 PGC11401仍溢出較多的乙酸，造成碳源的浪費(fèi)，并影響細(xì)胞的正常生長(zhǎng)。因此，我們推測(cè)Y. lipolytica還存在其他的乙酸溢出路徑。經(jīng)過(guò)代謝途徑挖掘和文獻(xiàn)分析發(fā)現(xiàn)釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae的乙酰輔酶 A水解酶(Acetyl-CoA hydrolase，ACH1) 能催化乙酰輔酶A為乙酸和輔酶A[22]。隨后，研究者發(fā)現(xiàn)該酶位于線(xiàn)粒體中，它具備輔酶A轉(zhuǎn)移酶活性，可將乙酰輔酶A的乙?；D(zhuǎn)移至琥珀酸生成乙酸和琥珀酰輔酶A[23]。通過(guò)基因序列比對(duì)與查找，我們獲得Y. lipolytica的乙酰輔酶A水解酶編碼基因Ylach1(YALI0E30965g)，基因敲除Ylach1構(gòu)建了重組菌PGC11505。圖4A顯示，發(fā)酵96 h重組菌PGC11505的琥珀酸產(chǎn)量達(dá)到7.0 g/L，比PGC01003提高了27.3%，乙酸只有0.48 g/L，菌體的生長(zhǎng)接近對(duì)照菌 Po1f (OD600達(dá)到 29.4)。甘油被完全消耗掉，琥珀酸的轉(zhuǎn)化率達(dá)到0.30 g/g。ACH1的失活阻斷了線(xiàn)粒體中乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為乙酸，同時(shí)也降低了琥珀酸向琥珀酰輔酶A的轉(zhuǎn)化。乙酸溢出大幅度減少，這有利于菌體生長(zhǎng)，提高了琥珀酸的產(chǎn)量。

為進(jìn)一步驗(yàn)證乙酸對(duì)Y. lipolytica細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，向培養(yǎng)基中外源添加乙酸，檢測(cè)重組菌PGC11505的菌體生長(zhǎng)。圖4B顯示乙酸濃度為1 g/L即對(duì)PGC11505產(chǎn)生抑制作用，菌體的OD值在24 h和48 h分別降低了64.9%和66.0%。隨著乙酸濃度的增加，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制愈加明顯。當(dāng)外源添加乙酸濃度為5 g/L時(shí)，細(xì)胞的生長(zhǎng)被完全抑制。

表2　不同的基因工程重組菌的琥珀酸發(fā)酵比較 (72 h)Table 2　Fermentation profiles of different engineered strains including OD600,glycerol consumption,succinic acid production and acetic acid accumulation (72 h),data are mean values of three parallels

圖4　PGC11505琥珀酸發(fā)酵分析 (A) 與乙酸耐受實(shí)驗(yàn) (B)Fig. 4　Succinic acid fermentation profiles of PGC11505 (A) and effect of exogenous acetic acid on cell growth of PGC11505 (B). (A) Squares stand for OD600; circles stand for glycerol concentrations; diamonds stand for succinic acid concentrations and upright triangles stand for acetic acid concentrations.

3　結(jié)語(yǔ)

琥珀酸作為一種高附加值有機(jī)酸，具有重要的生理功能。目前，細(xì)菌生產(chǎn)琥珀酸可以達(dá)到較高的產(chǎn)率和產(chǎn)量，但是細(xì)菌不耐受酸及滲透壓，發(fā)酵過(guò)程需要添加堿液以維持中性環(huán)境，發(fā)酵結(jié)束后則需要用酸調(diào)節(jié) pH值至酸性，使琥珀酸鹽轉(zhuǎn)變成琥珀酸。酵母能耐受低pH值和環(huán)境壓力，增加了其在工業(yè)應(yīng)用的優(yōu)勢(shì)。解脂酵母是非傳統(tǒng)酵母，能積累檸檬酸等大量有機(jī)酸。由于代謝不平衡，通過(guò)失活琥珀酸脫氫酶所獲得的重組解脂酵母產(chǎn)生大量副產(chǎn)物乙酸[18-19]。乙酸的溢出對(duì)酵母細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，抑制菌體生長(zhǎng)和發(fā)酵。通過(guò)干擾旁路途徑，異源表達(dá)來(lái)自鼠沙門(mén)氏菌的乙酰輔酶A合酶可降低乙酸的溢出，乙酸產(chǎn)量降至4.6 g/L，下降了24.6%。而基因敲除乙酰輔酶A水解酶編碼基因，乙酸的溢出降低至0.4 g/L，琥珀酸產(chǎn)量提高到7.0 g/L。乙酸溢出的有效控制恢復(fù)了菌體生長(zhǎng)能力，為進(jìn)一步的代謝工程構(gòu)建高產(chǎn)琥珀酸的細(xì)胞工廠(chǎng)奠定基礎(chǔ)。

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