鄧發(fā)軍，潘宇，常飛，房偉，方澤民，肖亞中

安徽大學(xué) 現(xiàn)代生物制造安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 安徽省微生物與生物催化工程研究中心，安徽 合肥　230601

β-葡萄糖苷酶 (E.C. 3.2.1.21) 能催化水解或轉(zhuǎn)移β-1,4-糖苷鍵，是糖苷水解酶類(lèi)的重要成員[1-2]。早期研究表明，β-葡萄糖苷酶廣泛存在于生物體內(nèi)，其在纖維素降解、生物燃料煉制中有廣泛的應(yīng)用潛力[3-5]。隨著研究的深入，β-葡萄糖苷酶在食品加工及活性苷元制備等方面也逐步展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力[6-8]。由于原核生物來(lái)源的β-葡萄糖苷酶具有較好的催化能力和較高的產(chǎn)量，近年來(lái)關(guān)于其表達(dá)及性質(zhì)研究的報(bào)道越來(lái)越多[9-12]。與原始產(chǎn)酶菌株相比，利用大腸桿菌Escherichia coli作為宿主細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá)原核生物來(lái)源重組 β-葡萄糖苷酶，具有發(fā)酵周期更短、酶蛋白產(chǎn)量更高等優(yōu)勢(shì)，因此其在β-葡萄糖苷酶生產(chǎn)中有廣泛的應(yīng)用[13-15]。然而，在大腸桿菌高密度發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中，菌體生物量和異源蛋白表達(dá)量往往受到溶解氧不足的限制而難以達(dá)到較高的水平[16]。因此，改進(jìn)大腸桿菌異源表達(dá)方法、提高大腸桿菌對(duì)低溶氧環(huán)境的適應(yīng)能力，對(duì)于提高β-葡萄糖苷酶的產(chǎn)量、加快推進(jìn)其工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用具有重要意義。

透明顫菌Vitreoscilla最早發(fā)現(xiàn)于湖泊等淡水沉積物中，是一種革蘭氏陰性細(xì)菌，屬于貝日阿托氏菌屬 (Beggiatoasp.)。為了適應(yīng)其生存的厭氧環(huán)境，透明顫菌能夠合成一種類(lèi)似于動(dòng)物血紅蛋白的多肽，被稱(chēng)為透明顫菌血紅蛋白(VitreoscillaHemoglobin，VHb)。研究發(fā)現(xiàn) VHb在不同的胞內(nèi)環(huán)境下可以呈現(xiàn)出不同的狀態(tài) (氧化態(tài)、氧合態(tài)和還原態(tài)) 并且可以互相轉(zhuǎn)化并具有氧結(jié)合性[17]。Wang等將VHb和耶羅維亞酵母脂肪酶在畢赤酵母中共表達(dá)，在10 L發(fā)酵罐微氧環(huán)境中脂肪酶的產(chǎn)量增加了約84%[18]。Pablos等在大腸桿菌菌株W3110中表達(dá)VHb后，微氧環(huán)境中菌體生物量提高了約33%，同時(shí)菌體比生長(zhǎng)速率提高了約30%[19]。

本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建獲得β-葡萄糖苷酶突變體蛋白Bgl1A (A24S/F297Y)，其具有葡萄糖和乙醇雙耐受的特性，在大豆異黃酮苷元制備中表現(xiàn)出優(yōu)秀的應(yīng)用潛力[20]。然而在使用大腸桿菌高密度發(fā)酵制備 Bgl1A (A24S/F297Y) 時(shí)，溶解氧不足阻礙了酶蛋白產(chǎn)量的進(jìn)一步提高。為了緩解大腸桿菌菌體在高密度發(fā)酵中的溶解氧不足的限制，本研究將VHb和Bgl1A (A24S/F297Y) 在大腸桿菌中進(jìn)行共表達(dá)，并在搖瓶水平和3 L發(fā)酵罐水平考察了 VHb的表達(dá)對(duì)菌體生物量和酶活變化的影響情況。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1　質(zhì)粒、菌株和培養(yǎng)基

突變體蛋白 Bgl1A (A24S/F297Y) 表達(dá)菌株E. coliBL21 (DE3)/pET22b-bgl為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。質(zhì)粒pET-22b為本實(shí)驗(yàn)室保存。透明顫菌血紅蛋白基因序列 (vgb) 根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性進(jìn)行密碼子優(yōu)化，并由生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成。表達(dá)菌株 BL21 (DE3) 購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

搖瓶培養(yǎng)基采用 LB培養(yǎng)基和 TB培養(yǎng)基。LB培養(yǎng)基 (1 L)：酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，氯化鈉10 g。TB培養(yǎng)基 (1 L)：酵母提取物24 g，胰蛋白胨12 g，甘油4 mL，使用時(shí)加入終濃度為17 mmol/L的 KH2PO4和 72 mmol/L K2HPO4緩沖液。發(fā)酵罐初始培養(yǎng)基為改良TB培養(yǎng)基 (增加甘油至終濃度15 g/L)。發(fā)酵罐補(bǔ)料培養(yǎng)基 (1 L)：酵母提取物45 g，胰蛋白胨45 g，甘油500 mL。

1.1.2　主要試劑和儀器

限制性核酸內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、TaqDNA聚合酶均購(gòu)自TaKaRa公司；isopropy-β-D-thiogalactoside (IPTG) 購(gòu)自生工生物工程 (上海)股份有限公司；p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside(pNPG) 購(gòu)自Sigma公司；質(zhì)粒抽提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自 Axygen公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純?cè)噭?。大腸桿菌的高密度發(fā)酵使用Eppendorf BioFlo 115的3 L發(fā)酵罐。

1.2　方法

1.2.1　表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

以T7啟動(dòng)子表達(dá)VHb的質(zhì)粒pET22b-T7-vgb構(gòu)建：以pUC57-vgb為模板，使用引物vgb-F和vgb-R克隆出vgb片段，使用內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ分別對(duì)vgb片段和 pET22b質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，并對(duì)酶切后的片段進(jìn)行回收。使用T4 DNA連接酶將回收后的vgb片段和 pET22b片段進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌株BL21 (DE3)。

以雙順?lè)醋有问焦脖磉_(dá) VHb和 β-葡萄糖苷酶Bgl1A (A24S/F297Y) 的質(zhì)粒pET22b-bgl-Bicvgb構(gòu)建：以pET22b-bgl和pUC57-vgb為模板，使用引物 bgl-F、bgl-Bic-R和引物 vgb-Bic-F、vgb-Bic-R分別克隆出bgl和vgb片段，以獲得的bgl和vgb片段為模板，使用重疊延伸PCR進(jìn)一步獲得bgl-Bic-vgb片段。使用內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ分別對(duì)bgl-Bic-vgb片段和pET22b質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，并對(duì)酶切后的片段進(jìn)行回收。使用T4 DNA連接酶將回收后的bgl-Bic-vgb片段和pET22b片段進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化進(jìn)入表達(dá)菌株BL21 (DE3)。雙順?lè)醋有问街?，bgl和vgb的間隔序列為 GAAGGAGATAT ATAATG，其中 GAAGGAG為核糖體結(jié)合位點(diǎn)RBS，bgl終止密碼子TAA與vgb起始密碼子ATG重疊，保證VHb的表達(dá)。

表1　本研究所用的引物Table 1　Primers used in this research

以 T7啟動(dòng)子形式共表達(dá) VHb和 β-葡萄糖苷酶 Bgl1A (A24S/F297Y) 的共表達(dá)質(zhì)粒 pET22bbgl-T7-vgb構(gòu)建：以按上述方法構(gòu)建獲得的pET22b-vgb為模板，使用引物T7-Pro-F和T7-Ter-R克隆獲得T7-vgb片段。使用內(nèi)切酶Tth111Ⅰ分別對(duì)T7-vgb片段和pET22b-bgl質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，并對(duì)酶切后的片段進(jìn)行回收。使用T4 DNA連接酶將回收后的T7-vgb片段和pET22b-bgl片段進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化進(jìn)入表達(dá)菌株BL21 (DE3)。

1.2.2　發(fā)酵培養(yǎng)方法

挑取活化的表達(dá)菌株單克隆接種于含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min振蕩過(guò)夜培養(yǎng)。將培養(yǎng)獲得的種子液以1%接種量 (V/V) 接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，同時(shí)添加氨芐青霉素至終濃度100 μg/mL，放置于37 ℃搖床中振蕩培養(yǎng)。當(dāng)發(fā)酵液菌體生物量OD600值達(dá)到0.6時(shí)，添加終濃度0.2 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并將誘導(dǎo)溫度設(shè)置為28 ℃，在不同誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行取樣，并對(duì)樣品的生物量和發(fā)酵酶活進(jìn)行測(cè)定。在搖瓶水平 (250 mL三角瓶)中模擬低溶氧環(huán)境進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)設(shè)置裝液量為200 mL，搖床轉(zhuǎn)速為120 r/min；高溶氧誘導(dǎo)表達(dá)條件為裝液量50 mL，搖床轉(zhuǎn)速為220 r/min。

在3 L發(fā)酵罐中進(jìn)行高密度發(fā)酵時(shí)，將過(guò)夜培養(yǎng)的種子液以 1%接種量 (V/V) 接種于 50 mL含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)OD600達(dá)到1.5–2.5時(shí)，按5%接種量接種于3 L發(fā)酵罐中。發(fā)酵罐中的初始培養(yǎng)基為1 L的改良TB培養(yǎng)基。用25% (V/V) 氨水控制發(fā)酵過(guò)程中的發(fā)酵液pH在6.8–7.2之間，適當(dāng)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌速度來(lái)控制溶氧。采用三階段控制：第一階段為接種后至菌體生物量達(dá)到OD600=25時(shí)，調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量控制溶氧在10%以上；當(dāng)菌體生物量達(dá)到OD600=25時(shí)，進(jìn)入第二階段，將空氣流速控制在3.5 L/min、攪拌轉(zhuǎn)速控制在500 r/min并維持6 h；第三階段提高轉(zhuǎn)速至1 000 r/min，并在通氣中加入0.5 L/min的氧氣直至發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵過(guò)程中溫度控制在 28 ℃，當(dāng)發(fā)酵液溶氧 (DO) 上升幅度超過(guò)30%時(shí)，開(kāi)始進(jìn)行補(bǔ)料，補(bǔ)料速率設(shè)置為6 mL/(L·h)。當(dāng)菌體生物量達(dá)到OD600=25時(shí)，添加IPTG至終濃度0.2 mmol/L進(jìn)行誘導(dǎo)，在不同誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行取樣并對(duì)樣品的生物量和發(fā)酵酶活進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3　分析方法

將不同誘導(dǎo)條件下取得的樣品在4 000 r/min離心20 min獲得菌體，用適當(dāng)體積50 mmol/L的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液 (pH 6.5) 重懸菌體。隨后使用超聲破碎的方法對(duì)細(xì)胞壁進(jìn)行破碎，超聲條件設(shè)置為：超聲4 s，靜置6 s，超聲時(shí)間設(shè)置為15 min。將超聲破碎后的破碎液在12 000 r/min離心10 min，分別收集上清和沉淀，并對(duì)樣品采用SDS-PAGE進(jìn)行分析。

β-葡萄糖苷酶活力測(cè)定：pNPG溶液 (100 mmol/L)和緩沖液各取25 μL和450 μL并混勻。預(yù)熱3 min后，向反應(yīng)液中加入適當(dāng)稀釋的酶液25 μL開(kāi)始反應(yīng)。反應(yīng)時(shí)間設(shè)置為10 min，終止反應(yīng)方法為加入500 μL的碳酸鈉溶液 (母液濃度為1 mol/L)。在05 nm處測(cè)量終止反應(yīng)后的反應(yīng)液的OD值。依據(jù)pNP標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計(jì)算pNP的濃度和酶的活性及相對(duì)活性。酶活單位 (U) 定義：即在酶最適作用條件下，每分鐘催化水解pNPG 生成 1 μmol NP所需要的酶量為1 U。

2　結(jié)果與分析

2.1　單獨(dú)表達(dá)VHb對(duì)大腸桿菌的影響

在高溶氧條件下，LB培養(yǎng)基中加入IPTG對(duì)VHb誘導(dǎo)表達(dá)8 h后，菌體生物量即可達(dá)到OD600值為4.44±0.19，無(wú)VHb表達(dá)的對(duì)照組OD600值僅為2.24±0.12 (圖1A)。在低溶氧條件下誘導(dǎo)VHb表達(dá) 24 h后，重組菌生物量比對(duì)照組提高了70.21% (圖 1B)。

高溶氧條件下，在營(yíng)養(yǎng)更為豐富的 TB培養(yǎng)基誘導(dǎo) VHb表達(dá) 8 h后的菌體生物量達(dá)到4.41±0.22，對(duì)照組為 2.9±0.15；隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，含 VHb的菌體OD600值達(dá)到 13.8±0.96，無(wú)VHb的對(duì)照組為11.4±0.79 (圖2A)。在低溶氧環(huán)境中TB培養(yǎng)基中誘導(dǎo)表達(dá)24 h后的菌體生物量OD600值為 2.99±0.32，比對(duì)照組的生物量提高了45.82 % (圖2B)。初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在大腸桿菌BL21 (DE3) 中誘導(dǎo)表達(dá)VHb能夠提高菌體的生物量。

2.2　搖瓶水平共表達(dá)β-葡萄糖苷酶和VHb

為了獲得不同的誘導(dǎo)表達(dá)強(qiáng)度，分別使用雙順?lè)醋有问胶蚑7啟動(dòng)子形式對(duì)VHb和β-葡萄糖苷酶在大腸桿菌中進(jìn)行共表達(dá)，考察不同共表達(dá)形式對(duì)菌體生物量和β-葡萄糖苷酶酶活的影響。高溶氧條件下，在LB培養(yǎng)基中以兩種形式誘導(dǎo)表達(dá)VHb均能夠在誘導(dǎo)前期促進(jìn)菌體生物量增加。

圖1　LB培養(yǎng)基中生物量隨誘導(dǎo)時(shí)間的變化情況 (A為高溶氧條件，B為低溶氧條件)Fig. 1　Changes of biomass in the LB medium with time under aerobic (A) and microaerobic (B) conditions.

2.2.1　搖瓶水平中雙順?lè)醋有问焦脖磉_(dá)β-葡萄糖苷酶和VHb

雙順?lè)醋忧闆r下，在誘導(dǎo)8 h時(shí)生物量較對(duì)照組均能增加 33.33%左右；隨誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)到24 h，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的生物量趨于一致(圖1A)。在TB培養(yǎng)基中，高溶氧條件下VHb的表達(dá)能夠持續(xù)促進(jìn)生物量增加，以雙順?lè)醋有问奖磉_(dá)VHb菌株的生物量在誘導(dǎo)24 h后達(dá)到OD600值為 16.25±0.98，比無(wú) VHb表達(dá)的對(duì)照組提高25.09% (圖 2A)。

低溶氧條件下，在兩種培養(yǎng)基中誘導(dǎo)表達(dá)VHb后菌體的生物量均得到明顯提高。LB培養(yǎng)基中采用雙順?lè)醋庸脖磉_(dá)方法在誘導(dǎo)8 h后的生物量達(dá)到OD600值為1.89±0.34，持續(xù)誘導(dǎo)至24 h后的生物量增加到OD600值2.29±0.36，比對(duì)照組提高了21.12% (圖1B)。在TB培養(yǎng)基中使用雙順?lè)醋訉?duì)VHb誘導(dǎo)表達(dá)24 h后，菌體生物量達(dá)到4.24±0.29，比對(duì)照組提高了35.03% (圖2B)。

以雙順?lè)醋有问焦脖磉_(dá) VHb能夠提高 β-葡萄糖苷酶的發(fā)酵總酶活。圖3中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在LB培養(yǎng)基中以雙順?lè)醋有问焦脖磉_(dá)VHb，高溶氧條件誘導(dǎo)8 h后β-葡萄糖苷酶的發(fā)酵酶活達(dá)到 (10.35±0.45) U/mL，比對(duì)照組提高 19.79%；低溶氧條件誘導(dǎo)24 h后酶活達(dá)到 (5.68±0.45) U/mL，比對(duì)照組提高15.92%。在TB培養(yǎng)基中以雙順?lè)醋有问焦脖磉_(dá)VHb后，高溶氧條件下β-葡萄糖苷酶的發(fā)酵酶活達(dá)到 (36.4±2.2) U/mL，比對(duì)照組提高20.93%；在低溶氧條件下發(fā)酵總酶活為(9.78±0.55) U/mL，比對(duì)照組提高25.38%。

2.2.2　搖瓶水平中 T7啟動(dòng)子形式共表達(dá) β-葡萄糖苷酶和VHb

LB培養(yǎng)基中采用 T7啟動(dòng)子共表達(dá)方法，在誘導(dǎo)8 h后的生物量達(dá)到OD600值為1.86±0.33，持續(xù)誘導(dǎo)至 24 h后的生物量增加到OD600值為2.31±0.43，比對(duì)照組提高了 22.22% (圖 1B)。在TB培養(yǎng)基中使用T7啟動(dòng)子對(duì)VHb誘導(dǎo)表達(dá)24 h后，菌體生物量OD600值為4.19±0.33，比對(duì)照組提高了31.85% (圖2B)。

以 T7啟動(dòng)子表達(dá)VHb時(shí) β-葡萄糖苷酶的總酶活均低于對(duì)照組，在高溶氧條件LB和TB培養(yǎng)基中僅為 (5.47±0.35) U/mL和 (21.14±1.31) U/mL；在低溶氧條件下的總酶活僅為 (2.91±0.29) U/mL和 (6.47±0.48) U/mL。SDS-PAGE結(jié)果顯示，以T7啟動(dòng)子表達(dá)VHb時(shí)，有部分VHb以包涵體的形式存在 (圖4)。

2.3　3L發(fā)酵罐水平共表達(dá)β-葡萄糖苷酶和VHb

為了考察大腸桿菌高密度發(fā)酵中共表達(dá)VHb對(duì)菌體生物量和β-葡萄糖苷酶產(chǎn)量的影響，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)攪拌槳轉(zhuǎn)速和通氣量進(jìn)行調(diào)節(jié)，將高密度發(fā)酵過(guò)程分為三階段。在第一階段中，由于維持了較高的溶氧水平，發(fā)酵菌體能夠快速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，重組工程菌在發(fā)酵6 h后菌體密度均能夠達(dá)到OD600值為25左右，此時(shí)加入IPTG對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)。誘導(dǎo)表達(dá)2 h后，調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速至500 r/min和降低通氣量至3.5 L/min使發(fā)酵溶氧水平降至5%以下。在第二階段中使用雙順?lè)醋有问胶蚑7啟動(dòng)子形式共表達(dá) VHb的工程菌生物量均超過(guò)對(duì)照組。經(jīng)過(guò)6 h的低溶氧發(fā)酵后，增大攪拌轉(zhuǎn)速至1 000 r/min并在通氣中增加氧氣0.5 L/min進(jìn)行第三階段發(fā)酵。共表達(dá)VHb的工程菌對(duì)氧氣的利用能力均高于對(duì)照組。大腸桿菌生物量在第三階段增長(zhǎng)迅速，其中以雙順?lè)醋有问焦脖磉_(dá)VHb的工程菌生物量在發(fā)酵20 h時(shí)達(dá)到最大生物量 (OD600值為67.14±2.98)，以T7啟動(dòng)子共表達(dá)VHb的工程菌BL21(DE3)/pET22b-bgl-T7-vgb生物量達(dá)到最大 (OD600值為73.28±3.21)，無(wú) VHb表達(dá)的對(duì)照菌株生物量?jī)H為OD600值48.83±3.24 (圖5A)。以雙順?lè)醋有问焦脖磉_(dá)VHb能夠顯著提高β-葡萄糖苷酶的發(fā)酵酶活，誘導(dǎo)14 h后達(dá)到最大發(fā)酵酶活 (141.23±6.84) U/mL。而以T7啟動(dòng)子表達(dá) VHb的工程菌 β-葡萄糖苷酶發(fā)酵酶活為 (110.12±5.26) U/mL，無(wú)VHb表達(dá)的對(duì)照菌發(fā)酵酶活為 (104.45±6.98) U/mL (圖 5B)。

圖3　LB培養(yǎng)基和TB培養(yǎng)基中β-葡萄糖苷酶酶活的變化情況 (A為L(zhǎng)B培養(yǎng)基，B為T(mén)B培養(yǎng)基)Fig. 3　Changes of β-glucosidase activity in LB medium (A) and TB medium (B) with time.

3　討論

圖4　SDS-PAGE分析三角瓶中低溶氧條件下β-葡萄糖苷酶和VHb的表達(dá)情況 (TB培養(yǎng)基)Fig. 4　SDS-PAGE assay for the expression of β-glucosidase and VHb in TB medium under microaerobic condition in triangular flask. M stands for molecular marker,super and precip denote the supernatant and precipitate components of broken cells.

圖5　3 L發(fā)酵罐中生物量和酶活變化情況Fig. 5　Changes of biomass and β-glucosidase activity in 3 L fermentor with time.

β-葡萄糖苷酶在生物能源、食品工業(yè)、保健品行業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，但是在利用大腸桿菌高密度發(fā)酵生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶時(shí)，溶解氧不足往往阻礙了酶蛋白產(chǎn)量的進(jìn)一步提高。在供氧不足的情況下，大腸桿菌糖酵解代謝和三羧酸循環(huán)代謝不均衡引發(fā)的乙酰輔酶A積累，進(jìn)而積累的乙酰輔酶A在?；D(zhuǎn)移酶和乙酸激酶等作用下生成乙酸等其他副產(chǎn)物[16,21-22]。本研究通過(guò)在大腸桿菌中共表達(dá)透明顫菌血紅蛋白VHb并對(duì)共表達(dá)方法進(jìn)行優(yōu)化對(duì)比，提高了大腸桿菌對(duì)溶氧的利用和對(duì)低溶氧環(huán)境的耐受能力。Pablos等對(duì) VHb影響大腸桿菌代謝進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，VHb能加快三羧酸循環(huán)進(jìn)程，提高菌體對(duì)乙酰輔酶A的消耗速度，進(jìn)而在一方面能夠促進(jìn)菌體生物量的增加，另一方面可以抑制乙酸等代謝副產(chǎn)物的生成[16,23]。本研究在搖瓶水平中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，VHb與目標(biāo)蛋白的共表達(dá)能夠在高溶氧環(huán)境中最大提高23.17%的生物量，在低溶氧環(huán)境中最大能夠提高35.03%的生物量。與我們的結(jié)果類(lèi)似，Liu等在大腸桿菌中共表達(dá)VHb和eGFP，在搖瓶中的低溶氧條件下提高了 eGFP蛋白的表達(dá)量[24]。值得注意的是，在高溶氧條件下，IPTG對(duì)VHb誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體生物量比無(wú)VHb表達(dá)的對(duì)照組高。此結(jié)果暗示VHb在搖瓶中模擬高溶氧環(huán)境時(shí)，也能夠提高大腸桿菌菌體對(duì)溶解氧的利用效率，并在一定程度上緩解了異源蛋白表達(dá)所帶來(lái)的代謝壓力。Li等將空腸彎曲桿菌Campylobacter jejuni中的血紅蛋白CBh在大腸桿菌BL21 (DE3) 中進(jìn)行異源表達(dá)，在500 mL三角瓶中裝液量100 mL，200 r/min條件下，誘導(dǎo)表達(dá)CBh的菌株生物量 (OD600值) 在平臺(tái)期較對(duì)照組有22.2%的提高[25]。Kim等使用BL21 (DE3) 作為表達(dá)宿主，將VHb與目標(biāo)蛋白進(jìn)行共表達(dá)，最終在發(fā)酵罐中獲得了提高1.9倍的目標(biāo)蛋白產(chǎn)量[26]。

本研究中對(duì)發(fā)酵罐獲得的發(fā)酵樣品進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果顯示，使用 T7啟動(dòng)子表達(dá)VHb雖然比雙順?lè)醋有问侥軌颢@得更多的蛋白表達(dá)量，但有部分VHb形成了不可溶的包涵體，不能夠發(fā)揮其相應(yīng)的氧傳遞功能 (圖 4，圖 7)。過(guò)量表達(dá)的 VHb雖然能夠幫助大腸桿菌對(duì)溶氧的利用 (圖5C)，但也在一定程度上消耗了大腸桿菌的資源，進(jìn)而導(dǎo)致β-葡萄糖苷酶的表達(dá)受到限制。以雙順?lè)醋有问竭M(jìn)行異源蛋白的共表達(dá)，所獲得的 VHb表達(dá)量較 T7啟動(dòng)子獲得的表達(dá)量低，但均為可溶的活性形式存在于細(xì)胞中，這不僅有利于獲得較高的菌體生物量，β-葡萄糖苷酶的表達(dá)量也得到提高。以上結(jié)果表明，在大腸桿菌中以雙順?lè)醋有问焦脖磉_(dá) VHb和 β-葡萄糖苷酶能夠提高低溶氧環(huán)境中的生物量水平和酶蛋白的表達(dá)水平，是有開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景的一種蛋白表達(dá)方法。

圖6　3 L發(fā)酵罐中溶氧變化情況Fig. 6　Changes of solube oxygen in 3 L fermentor with time.

圖7　SDS-PAGE分析3 L發(fā)酵罐中β-葡萄糖苷酶和VHb的表達(dá)情況Fig. 7　SDS-PAGE assay for the expression of β-glucosidase and VHb in 3 L fermentor. M stands for molecular marker,super and precip denote the supernatant and precipitate components of broken cells.

[1]Leah R,Kigel J,Svendsen I,et al. Biochemical and molecular characterization of a barley seed β-glucosidase. J Biol Chem,1995,270:15789–15797.

[2]Chamoli S,Kumar P,Navani NK,et al. Secretory expression,characterization and docking study of glucose-tolerant β-glucosidase fromB. subtilis. Int J Biol Macromol 2016,85: 425–433.

[3]Youn SY,Park MS,Ji GE. Identification of the β-glucosidase gene fromBifidobacteriumanimalissubsp.lactisand its expression inB.bifidumBGN4.J Microbiol Biotechnol,2012,22(12): 1714–1723.

[4]Yao GS,Wu RM,Kan QB,et al. Production of a high-efficiency cellulase complex via β-glucosidase engineering inPenicillium oxalicum. Biotechnol Biofuels,2016,9: 78.

[5]Cripwell R,Favaro L,Rose SH,et al. Utilisation of wheat bran as a substrate for bioethanol production using recombinant cellulases and amylolytic yeast.Appl Energ,2015,160: 610–617.

[6]Gueguen Y,Chemardin P,Janbon G,et al. A very efficient β-glucosidase catalyst for the hydrolysis of flavor precursors of wines and fruit juices. J Agr Food Chem,1996,44(8): 2336–2340.

[7]Yan FY,Xia W,Zhang XX,et al. Characterization of β-glucosidase fromAspergillus terreusand its application in the hydrolysis of soybean isoflavones.J Zhejiang Univ Sci B,2016,17(6): 455–464.

[8]Kaya M,Ito J,Kotaka A,et al. Isoflavone aglycones production from isoflavone glycosides by display of β-glucosidase fromAspergillus oryzaeon yeast cell surface. Appl Microbiol Biotechnol,2008,79(1):51–60.

[9]Gu MZ,Wang JC,Liu WB,et al. Expression and displaying of β-glucosidase fromStreptomyces coelicolorA3 inEscherichia coli. Appl Biochem Biotechnol,2013,170(7): 1713–1723.

[10]Mai ZM,Su HF,Zhang S. Characterization of a metagenome-derived β-glucosidase and its application in conversion of polydatin to resveratrol.Catalysts,2016,6(3): 35.

[11]Cui CH,Kim JK,Kim SC,et al. Characterization of a ginsenoside-transforming β-glucosidase fromPaenibacillus mucilaginosusand its application for enhanced production of minor ginsenoside F-2. PLoS ONE,2014,9(1): e85727.

[12]Maki ML,Armstrong L,Leung KT,et al. Increased expression of β-glucosidase A inClostridium thermocellum27405 significantly increases cellulase activity. Bioengineered 2013,4(1): 15–20.

[13]Naz S,Ikram N,Rajoka MI,et al. Enhanced production and characterization of a β-glucosidase fromBacillus haloduransexpressed inEscherichia coli. Biochemistry,2010,75(4): 513–518.

[14]Ohmiya K,Takano M,Shimizu S. Cloning of a β-glucosidase gene fromRuminococcus albusand its expression inEscherichia coli. Ann N Y Acad Sci,1991,646: 41–52.

[15]Shin KC,Lee HJ,Oh DK. Substrate specificity of β-glucosidase fromGordonia terraefor ginsenosides and its application in the production of ginsenosides Rg3,Rg2,and Rh1from ginseng root extract. J Biosci Bioeng,2015,119(5): 497–504.

[16]Pablos TE,Sigala JC,Le Borgne S,et al. Aerobic expression ofVitreoscillahemoglobin efficiently reduces overflow metabolism inEscherichia coli.Biotechnol J,2014,9(6): 791–799.

[17]Tyree B,Webster DA. Electron-accepting properties of cytochrome o purified fromVitreoscilla. J Biol Chem,1978,253(21): 7635–7637.

[18]Wang XF,Sun YC,Shen XG,et al. Intracellular expression ofVitreoscillahemoglobin improves production ofYarrowia lipolyticalipase LIP2 in a recombinantPichia pastoris. Enzyme Microb Technol,2012,50(1): 22–28.

[19]Pablos TE,Mora EM,Le Borgne S,et al.Vitreoscillahemoglobin expression in engineeredEscherichia coli: improved performance in high cell-density batch cultivations. Biotechnol J,2011,6(8):993–1002.

[20]Fang W,Yang Y,Zhang XX,et al. Improve ethanol tolerance of β-glucosidase Bgl1A by semi-rational engineering for the hydrolysis of soybean isoflavone glycosides. J Biotechnol,2016,227: 64–71.

[21]Stark BC,Dikshit KL,Pagilla KR. Recent advances in understanding the structure,function,and biotechnological usefulness of the hemoglobin from the bacteriumVitreoscilla. Biotechnol Lett,2011,33(9): 1705–1714.

[22]Khosla C,Curtis JE,DeModena J,et al. Expression of intracellular hemoglobin improves protein synthesis in oxygen-limitedEscherichia coli.Biotechnology,1990,8(9): 849–853.

[23]Khleifat KM,Abboud MM,Al-Mustafa AH,et al.Effects of carbon source andVitreoscillahemoglobin(VHb) on the production of β-galactosidase inEnterobacter aerogenes. Curr Microbiol,2006,53(4): 277–281.

[24]Liu T,Chen JY,Zheng Z,et al. Construction of highly efficientE. coliexpression systems containing low oxygen induced promoter and partition region.Appl Microbiol Biotechnol,2005,68(3): 346–354.

[25]Xu L,Xiong W,Yang JK,et al. RecombinantEscherichiacoliStrains with inducibleCampylobacter jejunisingle domain hemoglobin CHb expression exhibited improved cell growth in bioreactor culture.PLoS ONE,2015,10(3):e0116503.

[26]Kim D,Hwang DS,Kang DG,et al. Enhancement of mussel adhesive protein production inEscherichia coliby co-expression of bacterial hemoglobin.Biotechnol Prog,2008,24(3): 663–666.