鄧通元，黃桂柳，黃贊松，周喜漢，胡高裕，覃月秋

(右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣西百色533000)

原發(fā)性肝癌以肝細胞癌(簡稱肝癌)為主，是常見的惡性腫瘤，患者預(yù)后差，其5年生存率不超過30%[1]。肝癌的發(fā)生常缺乏典型的臨床表現(xiàn)，多數(shù)患者確診時已出現(xiàn)腫瘤的遠處侵襲和轉(zhuǎn)移，是導(dǎo)致患者治療效果欠佳、預(yù)后不良的重要原因。研究顯示，肝癌的轉(zhuǎn)移與某些基因的改變與表達有關(guān)。鈣黏蛋白(E-cadherin)和免疫球蛋白類黏附因子CD44在肝癌的侵襲與轉(zhuǎn)移過程中起重要作用。研究[2，3]表明，在肝癌細胞及手術(shù)切除的伴有轉(zhuǎn)移的肝癌組織中可檢測到E-cadherin和CD44表達異常，其與肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。新近研究[4]發(fā)現(xiàn)，中藥在抗腫瘤治療中具有一定的療效?？鄥⑺貫榭鄥?、苦豆子、廣豆根等中藥活性成分的提取物，具有抗肝癌的作用。我們的前期研究[5～7]發(fā)現(xiàn)，苦參素具有抑制肝癌細胞增殖、增強順鉑抗肝癌細胞及肝癌移植瘤的作用。2015～2016年，我們在前期實驗的基礎(chǔ)上，進一步觀察不同濃度苦參素對肝癌細胞增殖、侵襲和遷移能力的影響，并檢測細胞中E-cadherin和CD44表達的變化，探討苦參素抗肝癌作用的分子機制。

1　材料與方法

1.1　材料

肝癌HepG2細胞株購自中科院上海細胞庫；青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶、PVDF膜購自北京索萊寶科技有限公司；DMEM培養(yǎng)液、PBS緩沖液、小牛血清購自北京賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司；總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green ERTM qPCR Super Mix試劑盒及E-cadherin和CD44引物購自TaKaRa生物公司；Transwell小室購于美國康寧公司，Matrigel基質(zhì)膠購自BD公司；一抗、二抗及抗體稀釋液購自武漢博士德公司。

1.2　細胞培養(yǎng)與分組

將HepG2細胞加入DEPE培養(yǎng)液(含10%小牛血清和青、鏈霉素各100 μg/mL)，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后換液，待細胞生長至貼壁狀態(tài)，細胞融合接近90%傳代。取對數(shù)生長期細胞，分為陰性對照組和苦參素低、中、高濃度組，陰性對照組加入細胞培養(yǎng)液，苦參素低、中、高濃度組分別加入終濃度為1.0、2.0、4.0 mg/mL的苦參素和細胞培養(yǎng)液。每組設(shè)5個復(fù)孔。

1.3　細胞增殖抑制率測算

采用MTT法。將細胞按5×104/mL接種于96孔板。待細胞貼壁后，按1.2方法進行分組處理。另設(shè)空白對照組，僅加入細胞培養(yǎng)液。培養(yǎng)24、48、72 h后，分別加入5 mg/mL MTT，繼續(xù)孵育4 h。吸凈上清液后加入DMSO，置恒溫振蕩箱中，37 ℃振蕩10 min。在全自動酶標儀上，于490 nm波長處測定各孔光密度OD值，計算各組細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=[1-(實驗組OD值-空白對照組OD值)/(陰性對照組OD值-空白對照組OD值)]×100%。

1.4　細胞侵襲能力觀察

采用Transwell細胞侵襲實驗。取40 μL稀釋好的Matrigel基質(zhì)膠加入預(yù)冷的Transwell小室中，37 ℃孵育2 h使其凝固。取各組細胞制成懸液，調(diào)整細胞密度為1×105/mL。分別在Transwell小室上室加入含0.1%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液稀釋的細胞懸液200 μL，下室加入500 μL含20%胎牛血清的DMEM高糖完全培養(yǎng)基。37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，甲醇固定，0.1%結(jié)晶紫室溫下染色，倒置顯微鏡拍照，顯微鏡下觀察穿膜細胞數(shù)，計數(shù)中間及四周5個高倍鏡下視野細胞數(shù)，計算平均數(shù)。

1.5　細胞遷移能力觀察

除在Transwell小室內(nèi)未加入Matrigel外，其他步驟與侵襲實驗相同。

1.6　細胞中E-cadherin、CD44 mRNA表達檢測

采用Real-time PCR方法。取各組作用48 h后的細胞制成懸液，調(diào)整細胞密度為1×106/mL，采用TaKaRa試劑盒提取細胞總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明制備cDNA。以cDNA為模板，GAPDH為內(nèi)參進行擴增。引物序列：E-cadherin上游5′-GAGTGCCAACTG-GACCATTCAGTA-3′，下游5′-CACAGTCACACACGC-TGACCTCTA-3′，擴增片段長度164 bp；CD44上游5′-CAGGGCTGGGCTTAGACAGA-3′，下游5′-CTGGCCAATGATGTTCACAGA-3′，擴增片段長度178 bp；GAPDH上游5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′，擴增片段長度138 bp。反應(yīng)體系：2×Super Real Premix Plus 10 μL，上、下游引物各0.8 μL，cDNA 2 μL，50×ROX Reference Dye 1 μL， RNase Free dH2O 6.4 μL，總體系20 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃、30 s；變性95 ℃、10 s，退火60 ℃、34 s，共40個循環(huán)；延伸55～95 ℃、30 s，共81個循環(huán)。PCR擴增結(jié)束后，分析儀即顯示標準曲線、擴增曲線、熔解曲線和CT值。用2-ΔΔCt法計算mRNA的相對表達量。

1.7　細胞中E-cadherin、CD44蛋白表達檢測

采用Western blotting法。取各組作用48 h后的細胞，加入細胞裂解液提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取總蛋白20 μg制備蛋白樣品變性上樣，于8%～10% SDS-PAGE膠上電泳，PVDF轉(zhuǎn)膜，膜封閉1.5 h后，在孵育盒中加一抗(小鼠源抗CD44抗體、小鼠源抗E-cadherin抗體，小鼠源抗β-actin抗體)4 ℃孵育過夜。TBST洗膜，加二抗(HRP標記的羊抗鼠抗體)，室溫孵育1.5 h。TBST洗膜，用化學(xué)發(fā)光法曝光顯影，膠片掃描后，用Image J軟件行灰度值分析。以E-cadherin和CD44蛋白與內(nèi)參β-actin蛋白灰度值的比值表示蛋白的相對表達量。

1.8　統(tǒng)計學(xué)方法

2　結(jié)果

2.1　各組細胞增殖抑制率比較

苦參素高濃度組細胞增殖抑制率較中、低濃度組升高，中濃度組較低濃度組升高(P均<0.05)；苦參素中、高濃度組細胞增殖抑制率在72 h高于48 h和24 h，48 h高于24 h(P均<0.05)。見表1。

表1　各組細胞增殖抑制率比較

注：與苦參素低濃度組比較，aP<0.05，與苦參素中濃度組比較，bP<0.05；與同組24 h比較，cP<0.05；與同組48 h比較，dP<0.05。

2.2　各組細胞侵襲和遷移能力比較

細胞侵襲實驗顯示，苦參素低、中、高濃度組的穿膜細胞數(shù)分別為(97.73±9.43)、(69.73±8.93)、(42.87±5.02)個，均少于陰性對照組的(124.07±11.61)個(P均<0.05)；苦參素低濃度組多于中、高濃度組，中濃度組多于高濃度組(P均<0.05)。細胞遷移實驗顯示，苦參素低、中、高濃度組穿膜細胞數(shù)分別為(111.20±9.56)、(78.60±5.17)、(43.87±1.60)個，均少于對照組的(145.67±12.87)個(P均<0.05)?？鄥⑺氐蜐舛冉M多于中、高濃度組，中濃度組多于高濃度組(P均<0.05)。

2.3　各組細胞E-cadherin、CD44 mRNA表達比較

苦參素低、中、高濃度組E-cadherin mRNA相對表達量均較陰性對照組升高(P均<0.05)；中濃度組高于低、高濃度組(P均<0.05)，低、高濃度組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)?？鄥⑺亟M低、中、高濃度組CD44 mRNA相對表達量均較陰性對照組降低(P均<0.05)，苦參素不同濃度組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表2。

2.4　各組細胞E-cadherin、CD44蛋白表達水平比較

苦參素低、中、高濃度組E-cadherin蛋白表達水平均較陰性對照組升高(P均<0.05),苦參素不同濃度組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)；苦參素中、高濃度組CD44蛋白表達水平較陰性對照組降低，其中低濃度組較中、高濃度組升高(P均<0.05)，中、高濃度組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表2　各組細胞E-cadherin、CD44 mRNA表達比較

注：與陰性對照組比較，*P<0.05；與苦參素中濃度組比較，#P<0.05。

表3　　　　各組細胞E-cadherin、CD44蛋白表達水平比較

注：與陰性對照組比較，*P<0.05；與苦參素低濃度組比較，#P<0.05。

3　討論

肝癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是一個多步驟、多因素相互作用的復(fù)雜過程，包括細胞外基質(zhì)降解、腫瘤細胞脫落、黏附、細胞遷移、細胞增殖及腫瘤血管形成等。目前關(guān)于肝癌侵襲、轉(zhuǎn)移的相關(guān)因子有黏附分子、基質(zhì)金屬蛋白酶、趨化因子、細胞因子、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變相關(guān)因子、整合素、細胞角蛋白等。在肝癌的侵襲、轉(zhuǎn)移過程中，存在多種細胞黏附分子的異常表達，其中以鈣黏素、連接素和CD44最為重要[8]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，苦參素具有抑制肝癌細胞增殖和增強順鉑抗肝癌細胞株及肝癌小鼠與裸鼠移植瘤作用。肝細胞癌治療效果差的主要原因是其早期易發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移，尋找抗肝癌侵襲、轉(zhuǎn)移作用的藥物具有重要意義。本研究在先前實驗的基礎(chǔ)上，測定了苦參素對HepG2細胞增殖的影響，苦參素對HepG2細胞的增殖抑制作用在高濃度組較中、低濃度組升高，中濃度組較低濃度組升高；72 h高于48 h和24 h，48 h高于24 h。表明苦參素對HepG2細胞增殖具有抑制作用。王涌等[9]報道，苦參堿能夠從細胞黏附、運動、降解等多環(huán)節(jié)抑制SMMC-7721細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。本研究顯示，在細胞侵襲及遷移實驗中，苦參素不同濃度組的穿膜細胞數(shù)均少于陰性對照組，其中苦參素低濃度組多于中、高濃度組，中濃度組多于高濃度組。表明苦參素對HepG2細胞具有抗侵襲轉(zhuǎn)移作用，1、2、4 mg/mL組苦參素均可以抑制HepG2細胞的侵襲和遷移能力。

為探討苦參素抗腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移作用的分子機制，我們從基因和蛋白表達水平驗證了苦參素對HepG2細胞中E-cadherin和CD44表達的影響。E-cadherin和CD44作為介導(dǎo)細胞黏附作用的細胞黏附分子，在維持細胞黏附過程中具有重要作用，其功能或表達異常都會造成細胞間黏附能力下降，導(dǎo)致腫瘤細胞脫離癌灶，啟動腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

E-cadherin是鈣黏素家族成員，是一種鈣離子依賴性細胞表面跨膜糖蛋白，它主要分布于上皮細胞中，通過細胞質(zhì)連環(huán)素與細胞骨架蛋白相連，介導(dǎo)細胞之間以及細胞與細胞外基質(zhì)黏附，維持細胞結(jié)構(gòu)和形態(tài)的穩(wěn)定，E-cadherin表達降低有利于腫瘤細胞脫離原發(fā)灶而發(fā)生轉(zhuǎn)移。在食管癌、胃癌、大腸癌等消化道惡性腫瘤相關(guān)報道研究中，可以觀察到E-cadherin表達異常，表現(xiàn)為不表達或表達下降，其表達強度與腫瘤組織分化、分級等呈負相關(guān)[10～12]。研究表明，E-cadherin是與肝癌侵襲和轉(zhuǎn)移關(guān)系最密切的鈣黏素。Chen等[13]對2 439例患者臨床資料的Meta分析顯示，E-cadherin表達水平下降可以降低肝癌患者1、3、5年的總體生存率，與肝細胞癌患者的不良預(yù)后有關(guān)。因此，E-cadherin表達降低可以作為肝細胞癌患者預(yù)后的一個潛在預(yù)測指標。

CD44是一種具有高度異質(zhì)性跨膜細胞黏附分子，按編碼細胞外區(qū)域部分外顯子的可變拼接性，主要分為標準型(CD44s)和變異型(CD44v)兩個亞型；在功能上，初步鑒定為CD44的細胞外基質(zhì)成分，透明質(zhì)酸的受體，并參與多種生理和病理過程，如癌癥的發(fā)展、血管生成、細胞黏附、傷口愈合和炎癥[14]。標準型幾乎在淋巴細胞、成纖維細胞和增生的上皮細胞等正常細胞可檢測到，而變異型則與腫瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移相關(guān)。大量研究表明，在腫瘤細胞中CD44一般表現(xiàn)為高表達，與肝癌、胃癌、大腸癌、宮頸癌、肺癌、喉癌等多種腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移有著密切的關(guān)聯(lián)。劉偉等[15]檢測了39例肝癌手術(shù)標本，發(fā)現(xiàn)CD44v6的陽性率為69.2%，其表達率和表達程度與肝癌的包膜有無、分化程度、臨床分期和有否轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系，在CD44v6呈中高度表達的肝癌中，多伴有腫瘤包膜的缺如、門靜脈癌栓及肝內(nèi)轉(zhuǎn)移等侵襲轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示，苦參素不同濃度組E-cadherin mRNA相對表達量均較陰性對照組升高，CD44 mRNA相對表達量均較陰性對照組降低。表明苦參素作用HepG2細胞后，細胞中E-cadherin表達升高，CD44表達降低，推測苦參素抑制肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用可能通過調(diào)節(jié)E-cadherin和CD44表達而起作用。

綜上所述，苦參素對HepG2細胞具有抑制細胞增殖、侵襲和遷移能力的作用，其機制可能與上調(diào)E-cadherin表達和下調(diào)CD44表達有關(guān)。

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