羅文娟，冶娟，馬文宇，郭硯，陶叢敏

(青海大學(xué)附屬醫(yī)院，西寧810001)

黑果枸杞為茄科枸杞屬，為傳統(tǒng)名貴藥材，主要長于我國柴達(dá)木盆地一帶和歐洲中亞地帶，具有降血脂、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗衰老、治療心血管疾病、預(yù)防動(dòng)脈硬化、防治阿爾茨海默病等功能[1]。黑果枸杞中含有的原花青素(PC)是一種低聚體花青素，水溶性強(qiáng)，易吸收[2]，在食品開發(fā)、醫(yī)學(xué)美容及臨床藥用等方面都有著廣闊的應(yīng)用前景。2016年11月～2017年9月，我們以紫外線(UV)照射聯(lián)合皮下注射D-半乳糖，通過內(nèi)源性生理因素和外源性環(huán)境因素共同作用建立老化動(dòng)物模型模擬皮膚的自然衰老，觀察柴達(dá)木黑果枸杞PC在皮膚衰老模型中抗氧化、抗衰老的機(jī)制，為黑果枸杞的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料

健康昆明種雌性小鼠50只，45日齡，體質(zhì)量18～22 g，購于西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d，其間自由攝食飲水，室溫控制在(20±5)℃。柴達(dá)木黑果枸杞PC粉末(西安瑞林生物)；水溶性維生素E粉末、D-半乳糖(北京索萊寶生物)。超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、丙二醛(MDA)、羥脯氨酸(Hyp)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；小鼠半胱氨酸蛋白酶(caspase)-3、caspase-9酶聯(lián)免疫吸附測試盒(武漢伊萊瑞特生物公司)。infinite M200PRO酶標(biāo)儀(TECAN公司)。X-Mark型BIO-RAD酶標(biāo)儀(BIO-RAD公司)，DU800分光光度計(jì)(BECKMAN COULTER公司)，W201B水浴鍋(金壇市岸頭科輝儀器廠)，BB150 CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)，SIGMA 3K15離心機(jī)(SIGMA公司)，長波紫外線(UVA，峰波長值為340 nm)燈管、中波紫外線(UVB，峰波長值為313 nm)燈管(南京卡知電子科技有限公司)，UV輻照儀(北京精密儀器有限公司)。

1.2　動(dòng)物分組與模型建立

將小鼠隨機(jī)分為正常對照組、模型對照組、維生素E組、PC低劑量組、PC高劑量組各10只。剪去小鼠頸背部長毛，用雙蒸水配置4%的硫化鈉溶液，均勻涂抹在頸背部，范圍約2 cm×3 cm;6～8 min后待毛發(fā)變?yōu)榈S色并略透明后，紗布輕輕拭去，溫水沖洗。正常對照組小鼠正常光照飼養(yǎng)。模型對照組、維生素E組、PC低劑量組、PC高劑量組參照文獻(xiàn)[3]方法制備皮膚衰老模型。每日頸背部皮下注射5% D-半乳糖10 mL/kg，同時(shí)隔日進(jìn)行UV照射，UVA、UVB燈管各1支，平行排列，間距約5 cm，每次照射前燈管預(yù)熱15 min，光源距鼠約40 cm垂直高處，照射時(shí)間為40 min/次，隔日照射1次，持續(xù)40 d(UVA累計(jì)輻照劑量為98.4 J，UVB累計(jì)輻照劑量為78.4 J)。

1.3　干預(yù)方法

從開始注射D-半乳糖后第11天起，PC低劑量組、PC高劑量組分別給予50、100 mg/(kg·d)PC溶液灌胃，正常對照組、模型對照組給予等體積生理鹽水灌胃，維生素E組給予等體積維生素E溶液灌胃，連續(xù)灌胃30 d。

1.4　皮膚含水量檢測

實(shí)驗(yàn)第41天，斷髓處死小鼠，快速取背部照光及注射處皮膚組織，去除皮下脂肪及其他結(jié)締組織，預(yù)冷生理鹽水漂洗，濾紙拭干，-80 ℃保存。取0.5 cm×0.5 cm大小皮膚，濾紙拭干，精確稱取濕重，隨即放入80 ℃烘箱中烘干12 h，精密稱取干重，以(濕重-干重)/濕重×100%計(jì)算皮膚含水量。

1.5　皮膚組織上清液中SOD、GSH-PX活力和MDA、Hyp水平檢測

取背部衰老皮膚0.5 g，置入研缽中，加少許液氮研磨，移至試管中;加入預(yù)冷生理鹽水4.5 mL，用組織勻漿器在冰水浴中勻漿5～8 min，制成10%組織勻漿。以3 500 r/min離心15 min，取上清液;采用酶生化法檢測SOD、GSH-PX活力和MDA、Hyp水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.6　皮膚組織上清液中caspase-9、caspase-3水平檢測

取背部皮膚組織勻漿離心所得上清液，采用雙抗體夾心ELISA法檢測caspase-3、caspase-9水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.7　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2　結(jié)果

2.1　四組皮膚外觀及行為學(xué)特征比較

D-半乳糖注射聯(lián)合UV輻照1周后，模型對照組小鼠毛色灰暗無光，行動(dòng)逐漸遲緩、精神淡漠，出現(xiàn)畏光、抱團(tuán)、飲食飲水量減少等現(xiàn)象;頸背部皮膚出現(xiàn)皮革樣改變、皺紋加深、脫屑，出現(xiàn)紅斑、色沉，脊柱逐漸變硬并隆起;造模40 d時(shí)，以上現(xiàn)象更明顯。與模型對照組比較，維生素E組、PC低劑量組、PC高劑量組上述癥狀明顯減輕。正常對照組小鼠毛色光滑鮮亮，皮膚彈性正常，行動(dòng)敏捷，正常飲食攝水。

2.2　四組皮膚含水量比較

正常對照組、模型對照組、維生素E組、PC低劑量組、PC高劑量組皮膚含水量分別為63.34%±4.35%、42.63%±2.36%、48.41%±3.04%、55.30%±2.56%、61.60%±2.48%。模型對照組皮膚含水量低于正常對照組(P<0.05)，維生素E組及PC低、高劑量組皮膚含水量較模型對照組升高(P均<0.05)，PC低、高劑量組較維生素E組升高(P均<0.05)。

2.3　四組皮膚組織上清液中SOD、GSH-PX活力和MDA、Hyp水平比較

模型對照組SOD、GSH-PX活力和Hyp水平較正常對照組降低，MDA水平升高(P均<0.05)；與模型對照組比較，維生素E組及PC低、高劑量組皮膚組織上清液中SOD、GSH-PX活力和Hyp水平升高，MDA水平降低(P均<0.05)；PC低、高劑量組SOD活力和Hyp水平較維生素E組升高，MDA水平較維生素E組降低(P均<0.05)。見表1。

表1　四組皮膚組織上清液中SOD、GSH-PX活力和MDA、Hyp水平比較

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型對照組比較，#P<0.05；與維生素E組比較，△P<0.05。

2.4　四組皮膚組織上清液中caspase-9、caspase-3水平比較

模型對照組caspase-9、caspase-3水平較正常對照組升高(P均<0.05)；維生素E組及PC低、高劑量組較模型對照組降低(P均<0.05)；PC低、高劑量組較維生素E組降低(P均<0.05)。見表2。

表2　　　　四組皮膚組織上清液中caspase-9、caspase-3水平比較

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型對照組比較，#P<0.05；與維生素E組比較，△P<0.05。

3　討論

皮膚老化是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程，按來源可分為內(nèi)源性老化和外源性老化兩部分[4]。內(nèi)源性老化受個(gè)體遺傳信息的控制，是不可阻止、只能延緩的不可逆老化；外源性老化是皮膚受外界多種因素(UV、風(fēng)吹日曬、霧霾、吸煙等)影響，其中最主要的因素是UV輻射，因此外源性老化又稱為光老化，光老化是可以預(yù)防的。UV按波長不同可分為UVA、UVB、短波UV(UVC)，到達(dá)皮膚表皮，引起皮膚衰老的主要是UVA和UVB，其中UVA可穿透皮膚全層。D-半乳糖可打亂細(xì)胞的正常代謝水平，使自由基蓄積，導(dǎo)致全身性的衰老[5]。本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)1周后小鼠毛色灰暗，行動(dòng)遲緩，出現(xiàn)畏光、抱團(tuán)、飲食飲水量減少現(xiàn)象，精神衰退；暴露部位皮膚出現(xiàn)皮革樣改變、皺紋加深、脫屑，出現(xiàn)紅斑甚至糜爛，脊柱逐漸變硬并隆起。這表明皮下注射D-半乳糖聯(lián)合紫外線UVA+UVB輻照可引起皮膚老化。

黑果枸杞為茄科枸杞屬類植物，多棘刺灌木，主要分布在高山、沼澤、沙漠地帶，是一種獨(dú)特的藥食兩用植物。黑果枸杞具有多種營養(yǎng)成分，除含有人體必需的18種氨基酸外還包括各種氨基酸、多糖、脂肪酸、甜菜堿、維生素、多種微量元素等，營養(yǎng)及藥用價(jià)值很高[6]。其中所包含的PC是高效的天然抗氧化劑，能有效清除機(jī)體內(nèi)的自由基[7]。PC具有強(qiáng)大的生理功能，包括抗氧化、預(yù)防及治療心腦血管疾病、抗腫瘤、抗病毒、防治眼部疾病等多種功能。

自由基學(xué)說認(rèn)為，細(xì)胞代謝過程中產(chǎn)生的自由基是造成機(jī)體衰老的主要原因之一[8]，其中大多是氧自由基(ROS)。正常機(jī)體可通過體內(nèi)的酶和非酶兩種不同的防御系統(tǒng)清除體內(nèi)蓄積的自由基[9]，使氧化應(yīng)激維持平衡狀態(tài)。酶防御系統(tǒng)指SOD、GSH-PX等這些體內(nèi)活性物質(zhì)，通過酶的水解反應(yīng)清除自由基，其含量及活性可反映機(jī)體抗氧化能力。年齡的增長及外源性因素的破壞使得氧化與抗氧化能力失衡，引起機(jī)體的氧化損傷，導(dǎo)致ROS蓄積。而MDA是ROS攻擊細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化的最終降解產(chǎn)物，使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)、降解，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，間接反映機(jī)體老化[10，11]。膠原蛋白是真皮的重要成分，可維持皮膚的水分和彈性。Hyp是膠原蛋白主要成分[12]，在膠原蛋白中占13.4%，是構(gòu)成膠原蛋白的主要骨架。隨著年齡的增長及自由基的蓄積，Hyp發(fā)生交聯(lián)、降解，使膠原蛋白斷裂，皮膚失去彈性、干燥，產(chǎn)生皺紋。皮膚衰老過程中水合能力下降，含水量減少，導(dǎo)致皮膚萎縮變薄，產(chǎn)生細(xì)紋。因此，皮膚組織中的SOD、GSH-PX、MDA、Hyp水平及皮膚含水量均可作為反映皮膚衰老的指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，UV照射聯(lián)合皮下注射D-半乳糖可使皮膚的含水量明顯下降、皮膚組織上清中SOD、GSH-PX活力和Hyp水平降低，MDA水平升高，說明UV和D-半乳糖可破壞機(jī)體的酶防御系統(tǒng)，導(dǎo)致MDA等物質(zhì)的蓄積，造成機(jī)體損傷，降低皮膚組織Hyp水平及皮膚含水量，加速皮膚的老化；給予PC、維生素E灌胃后皮膚的含水量、組織上清中SOD、GSH-PX活力和Hyp水平、含水量升高，MDA水平降低；且PC低、高劑量組較維生素E組效果更明顯。說明PC及維生素E均可保護(hù)小鼠機(jī)體的酶防御系統(tǒng)，提高機(jī)體的抗氧化應(yīng)激能力，減輕小鼠皮膚的氧化損傷，且PC的抗氧化效果高于維生素E。

細(xì)胞凋亡因子與皮膚衰老也有著密切的關(guān)系，氧化應(yīng)激反應(yīng)蓄積的過量ROS會(huì)破壞細(xì)胞線粒體，使細(xì)胞釋放更多的細(xì)胞色素C，進(jìn)而活化caspase家族[13]?；罨纳嫌蔚蛲鍪紕?dòng)因子caspase-9可激活下游的凋亡效應(yīng)因子caspase-3，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡;caspase-3能夠在下游產(chǎn)生級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)[14]，同時(shí)進(jìn)一步促進(jìn)上游caspase-9活化，加速細(xì)胞凋亡。caspase-3的激活標(biāo)志著凋亡進(jìn)入不可逆的過程。相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，一定量的UV輻照能活化caspase家族中的caspase-9、caspase-3，打開線粒體凋亡通路，引發(fā)細(xì)胞凋亡[15,16]。本研究中，模型對照組caspase-9、caspase-3水平較正常對照組升高，表明UV和D-半乳糖可上調(diào)caspase-9、caspase-3表達(dá)，引起細(xì)胞凋亡，加快皮膚的老化進(jìn)程；給予PC、維生素E灌胃后，caspase-9、caspase-3水平降低，PC低、高劑量組較維生素E組效果更明顯。這說明黑果枸杞PC與維生素E均能下調(diào)caspase-9、caspase-3水平，進(jìn)而阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生，且黑果枸杞PC抑制凋亡的效果高于維生素E，這可能與PC中的酚羥基降低ROS含量，熄滅caspase上游信號(hào)有關(guān)[17]。

綜上所述，黑果枸杞PC可增加皮膚的含水量，對抗UV聯(lián)合D-半乳糖對小鼠皮膚的氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少機(jī)體活性氧物質(zhì)的蓄積，同時(shí)熄滅caspase上游信號(hào)，下調(diào)caspase-9的表達(dá)，進(jìn)一步下調(diào)caspase-3的表達(dá)，阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)展，減輕細(xì)胞凋亡，減緩皮膚衰老。本實(shí)驗(yàn)為黑果枸杞PC抑制UV聯(lián)合D-半乳糖所致氧化損傷及細(xì)胞凋亡提供理論依據(jù)，為黑果枸杞的開發(fā)和應(yīng)用提供新的市場及藥用價(jià)值。

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