竇維佳,王景杰,劉震雄

(中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)(第四軍醫(yī)大學(xué))唐都醫(yī)院消化內(nèi)科,西安　710038;#共同第一作者;*通訊作者,E-mail:liuzhx816@126.com)

1　材料與方法

1.1　材料

收集2012-06～2014-06經(jīng)空軍軍醫(yī)大學(xué)(第四軍醫(yī)大學(xué))唐都醫(yī)院手術(shù)切除的結(jié)腸癌64例,同時在距癌組織邊緣>5 cm處的正常組織取標本作為癌旁組織,所有癌組織標本均經(jīng)病理確診,癌旁組織確認為無癌細胞及明顯炎癥細胞浸潤?；颊吖?4例,其中男性40例,女性24例,年齡31-76歲,中位年齡57.9歲。所取標本經(jīng)過液氮速凍后保存在-80 ℃冰箱中用于提取總RNA。所有患者術(shù)前均未接受化療、放療或生物治療等相關(guān)治療措施。

1.2　方法

1.2.1RNA的提取取100 mg組織放入液氮預(yù)冷的研缽中,將組織塊迅速研磨成粉末,置1.5 ml離心管中,加入1 ml Trizol充分勻漿,室溫靜置5 min;加入0.2 ml氯仿,振蕩15 s,靜置2 min;4 ℃離心,12 000g×15 min,取上清;加入0.5 ml異丙醇,將管中液體輕輕混勻,室溫靜置10 min;4℃離心,12 000g×10 min,棄上清;加入1 ml 75%乙醇,輕輕洗滌沉淀。4 ℃,7 500g×5 min,棄上清;晾干,加入適量的DEPC H2O溶解(65 ℃促溶10-15 min);用260 nm波長分光測定RNA濃度,OD值為1相當于大約40 μg/ml的單鏈RNA。用1 cm光徑,用ddH2O稀釋DNA樣品50倍并以ddH2O為空白對照,根據(jù)此時讀出的OD260值即可計算出樣品稀釋前的濃度:RNA(mg/ml)=40×OD260讀數(shù)×稀釋倍數(shù)(50)/1 000。

1.2.2qRT-PCR應(yīng)用PrimeScript RT reagent Kit試劑盒將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s。以cDNA為模板應(yīng)用SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒進行PCR擴增,變性:95 ℃ 5 min,循環(huán):95 ℃ 10 s,58 ℃ 10 s,72 ℃ 10 s(共45個循環(huán)),溶解曲線分析:95 ℃ 5 s,50 ℃ 1 min,97 ℃(1個循環(huán)),冷卻:40 ℃ 30 s。以U6作為內(nèi)參,所有引物購自RiBoBio公司。miR-200b引物序列:5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATCGGCACTG CATACGACAAAATATGGAAC-3′(RT引物),5′-TGCGGGTGCTCCGCTCCGCAGC-3′(qRT-PCR正義引物),5′-CAGTGCACGCTCCGA-3′(qRT-PCR反義引物);miR-200c引物序列:5′-GTCGTCCAGTGCAGGGTCCGAGGTAGTTCGCACTGCATACGACGCG GAAC-3′(RT引物),5′-TGCGGTTCACAGTGGCTAAG-3′(qRT-PCR正義引物),5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′(qRT-PCR反義引物);U6引物序列:5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′(RT引物),5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′(qRT-PCR正義引物),5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′(qRT-PCR反義引物),采用2-ΔΔCt分析miRNA的相對表達水平。每個樣本設(shè)置3個復(fù)孔,實驗重復(fù)3次。

1.3　統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件對結(jié)果進行分析。獨立樣本t檢驗分析結(jié)腸癌及癌旁組織中miR-200b、miR-200c的表達差異。以平均表達值作為截點將結(jié)腸癌組織中miR-200b和miR-200c的表達分為低表達組和高表達組,用卡方檢驗分別分析miR-200b、miR-200c表達與臨床病理指標的關(guān)系。Pearson相關(guān)系數(shù)檢測結(jié)腸癌組織中miR-200b及miR-200c表達的相關(guān)性。所有檢驗均為雙側(cè),P<0.05被認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1　miR-200b及miR-200c在結(jié)腸癌與癌旁組織中的表達

應(yīng)用qRT-PCR對64例結(jié)腸癌及癌旁組織中miR-200b及miR-200c表達分別進行檢測,結(jié)果表明與正常組織相比,miR-200b在結(jié)腸癌中表達明顯降低,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見圖1)。同樣,miR-200c在結(jié)腸癌中的表達較正常組織亦顯著降低(P<0.05,見圖1)。

與癌旁組織比較,*P<0.05圖1　結(jié)腸癌與癌旁組織中miR-200b和miR-200c的表達Figure 1　Expression of miR-200b and miR-200c in colon cancer and matched adjacent non-tumor tissues

2.2　miR-200b及miR-200c在結(jié)腸癌中的表達及與臨床病理特征的關(guān)系

分別以miR-200b及miR-200c的平均表達值作為截點將病例分為高表達組和低表達組得到計量資料。miR-200b和miR-200c在結(jié)腸癌中呈低表達,卡方檢驗顯示miR-200b和miR-200c在結(jié)腸癌組織中的表達顯著低于癌旁組織(P<0.05,見表1)。另外,miR-200b及miR-200c的表達與腫瘤的病理分化程度、TNM分期及淋巴轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P<0.05,見表2),而與患者的年齡、性別無顯著相關(guān)性(P>0.05,見表2)。

表1miR-200b及miR-200c在結(jié)腸癌和癌旁組織中的表達

Table1ExpressionofmiR-200bandmiR-200cincoloncancerandnon-tumoradjacenttissues

組織nmiR?200bmiR?200c低表達高表達χ2P低表達高表達χ2P結(jié)腸癌組織64432190780003392562240013癌旁組織　6426382440

表2miR-200b及miR-200c的表達與臨床病理特征的關(guān)系

Table2RelationshipsbetweenexpressionofmiR-200bandmiR-200candclinicopathologicalfeaturesincoloncancer

臨床特征nmiR?200bmiR?200c低表達高表達χ2P低表達高表達χ2P　年齡2278013124110121　　<60歲2816121513　　≥60歲362792412　性別0045083222150137　　男4025152218　　女24186177　分化程度6493001195400002　　高中分化3015151317　　低分化34286268　TNM分期6977000867000010　?、?Ⅱ2311121013　?、?Ⅳ413292912　淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移104380001114620001　　否4021191921　　是24222204

2.3　miR-200b及miR-200c在結(jié)腸癌中表達的相關(guān)性

應(yīng)用Pearson相關(guān)系數(shù)對結(jié)腸癌組織中miR-200b及miR-200c表達水平進行相關(guān)性分析,結(jié)果顯示兩者呈顯著正相關(guān)(r=0.531,P<0.05,見圖2)。

為讓易地搬遷對象“搬得出，穩(wěn)得住，有事做，能致富”，爭取到2018年所有搬遷對象全面脫貧，湖南省汝城縣三措并舉，不斷強化監(jiān)管力度，確保了全縣易地扶貧搬遷工作的順利推進。截至10月31日，全縣所有集中安置點的搬遷對象均已分房到戶。

圖2　miR-200b及miR-200c在結(jié)腸癌中表達的相關(guān)性Figure 2　Correlation between miR-200b and miR-200c expression in colon cancer tissues

3　討論

結(jié)腸癌是常見的消化道腫瘤。近年來,隨著經(jīng)濟的發(fā)展和生活水平的提高,結(jié)腸癌的發(fā)病率及死亡率逐年升高,嚴重危害國民的健康及生命。因此,闡明結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展機制,找到有效的治療靶點顯得至關(guān)重要,但是結(jié)腸癌的發(fā)病機制尚未完全明確。

MicroRNAs(miRNAs)是一類能在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮調(diào)控基因表達的非編碼小RNA。大量研究證實miRNAs在結(jié)腸癌中發(fā)揮癌基因或抑癌基因功能。miR-200b及miR-200c屬于miR-200家族,其中包含miR-200a,miR-200b,miR-200c,miR-141以及miR-429等5個成員。研究表明miR-200家族成員在腫瘤增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等行為中均發(fā)揮重要的調(diào)控作用,且在腫瘤細胞、組織及血漿樣本中存在差異表達。miR-200b通過抑制FN1的表達,阻礙耐藥乳腺癌細胞EMT過程,發(fā)揮抑癌作用[6]。在垂體細胞瘤中,miR-200b下調(diào)PKCα表達抑制腫瘤增殖侵襲[7]。miR-200c可通過下調(diào)Foxf2表達從而抑制乳腺癌的轉(zhuǎn)移[8]。另外還有研究發(fā)現(xiàn)miR-200c可作為判斷非小細胞肺癌(NSCLC)預(yù)后的指標[9]。Tang等[5]同時研究miR-200b及miR-200c在胃癌中的表達,發(fā)現(xiàn)兩者在胃癌組織中均呈低表達,且與患者預(yù)后顯著相關(guān),過表達miR-200b及miR-200c可抑制胃癌細胞惡性生物學(xué)行為。雖然miR-200b或miR-200c單獨與腫瘤關(guān)系的相關(guān)報道有不少[10-15],但兩者與結(jié)腸癌關(guān)系并不十分清楚。

我們通過對64例結(jié)腸癌患者的癌及癌旁組織進行qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn),miR-200b及miR-200c在結(jié)腸癌組織中的表達均顯著低于癌旁組織。進一步分析兩者與結(jié)腸癌臨床病理學(xué)資料的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)miR-200b及miR-200c表達與腫瘤分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均相關(guān),即分化程度越低、TNM分期越高、存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時,miR-200b及miR-200c表達越低,且兩者表達呈明顯正相關(guān),提示miR-200b及miR-200c均在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮抑癌基因的作用,可能為結(jié)腸癌的診治提供新的潛在靶點,但具體的分子機制仍有待進一步深入研究。

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