龔　化,周治軍,盧　童,徐　康,魯　文

(1天門市第一人民醫(yī)院泌尿外科,天門　431700;2天門市第一人民醫(yī)院神經內科;*通訊作者,E-mail:luwenwh2005@163.com)

腎癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率呈逐年上升趨勢。腎癌對放化療均不敏感,早期腎癌主要采取手術治療,但手術方式的進步并未明顯改善腎癌患者的預后[1,2]。腎癌發(fā)生發(fā)展的具體機制至今仍不明確,尋找調控腎癌增殖、侵襲等生物學行為的基因已成為腎癌防治研究領域的重要方向[3]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是近年來腫瘤研究的熱點,在多種腫瘤中表達異常,在腫瘤中的調控作用逐漸引起人們的關注[4,5]。LINC01128是一種新發(fā)現(xiàn)的lncRNA,其在腫瘤特別是腎癌中的具體作用及機制尚不清楚。本研究通過qPCR檢測發(fā)現(xiàn)LINC01128在腎癌細胞株中表達降低,從而進一步探索了LINC01128對腎癌細胞A498的增殖和侵襲的影響,并在基因及蛋白水平對其作用機制進行了研究,為尋找腎癌的新治療靶點方面提供了實驗基礎。

1　材料與方法

1.1　細胞株和主要試劑

腎癌細胞株A498、ACHN、786-O、OS-RC-2和人近端腎小管上皮細胞HK-2購自上海拜力生物科技有限公司;RPMI-1640培養(yǎng)液和胎牛血清購自美國HyClone公司;陰性對照質粒、LINC01128高表達質粒及PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司構建;Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司;熒光實時定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司;一抗PTEN、CDK4、Cyclin D1、E-cadherin、N-cadherin和GAPDH均購于美國CST公司;細胞周期檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司;CCK-8試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司;Transwell小室購自美國Corning公司。

1.2　細胞培養(yǎng)和轉染

在37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內,采用含10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)腎癌細胞A498、ACHN、786-O和OS-RC-2,采用含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)人近端腎小管上皮細胞HK-2。選取對數(shù)生長期的A498細胞進行轉染操作,根據(jù)Lipofectamine 2000說明書進行轉染操作,分別瞬時轉染實驗分為對照組(轉染陰性對照質粒)和實驗組(轉染LINC01128高表達質粒)。

1.3　qPCR檢測LINC01128和PTEN mRNA表達

消化收集細胞,用TRIzol法提取細胞總RNA,逆轉錄為cDNA,采用熒光實時定量PCR試劑盒進行qPCR檢測,以GAPDH為內參。LINC01128引物上游5′-GTCGGGTTCTGTTGGAGTG-3′,下游5′-CGAGATCATGCCATTGTGAC-3′。PTEN引物上游5′-TGGATTCGACTTAGACTTGACCT-3′,下游5′-GGTGGGTTATGGTCTTCAAAAGG-3′。GAPDH引物上游5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′,下游5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′。qPCR擴增條件為:95 ℃ 3 min;95 ℃ 15 s、58.8 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s,35個循環(huán)。qPCR閾值Ct值以2-ΔΔCt分析處理。

1.4　Western blot檢測PTEN蛋白及相關蛋白表達

選取對數(shù)期各組細胞,消化收集A498細胞,加入RIPA裂解液提取細胞總蛋白,測定蛋白濃度,取40 μg蛋白經聚丙烯酰氨凝膠電泳后,轉移至PVDF膜,5%脫脂牛奶封閉2 h,4 ℃下與一抗孵育過夜,室溫下與二抗孵育2 h,滴加ECL顯影液曝光顯影。

1.5　流式細胞術檢測細胞周期分布

選取對數(shù)期各組細胞,消化收集A498細胞,預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次,預冷的70%乙醇溶液重懸細胞,4 ℃固定過夜。離心后用PBS溶液洗滌2次,100 μl PBS溶液重懸細胞,加入5 μl RNase A溶液,37 ℃水浴15 min,加入5 μl碘化丙啶溶液后在4 ℃避光孵育15 min,加入PBS溶液400 μl,充分混勻后,應用流式細胞儀檢測兩組A498細胞周期。

1.6　克隆形成實驗檢測細胞增殖能力

選取對數(shù)期各組細胞,消化收集A498細胞,以1×103個/孔接種于6孔板,連續(xù)培養(yǎng)直到肉眼可見清晰的細胞克隆。棄上清,1 ml甲醇固定10 min,1 ml 0.1%的結晶紫溶液染色10 min,流水洗去多余染液,室溫下晾干,每孔取4個視野計數(shù)細胞克隆數(shù),取平均值。

1.7　CCK-8法檢測細胞增殖活性

選取對數(shù)期各組細胞,消化收集A498細胞,以5×103個/孔接種于96孔板,每組設4個復孔。分別在培養(yǎng)的第1,2,3,4,5天加入10 μl CCK-8溶液,培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h,終止培養(yǎng),吸去培養(yǎng)液,每孔加入150 μl二甲基亞砜,振蕩10 min,酶標儀測定490 nm波長各孔的吸光度(OD值)。

1.8　Transwell實驗檢測細胞侵襲能力

在Transwell上室內每孔加入40 μg基質膠進行包被,培養(yǎng)箱內放置4 h,待基質膠充分凝固。選取對數(shù)期各組細胞,消化收集A498細胞,用無血清培養(yǎng)液制成單細胞懸液,上室中接種細胞3×104個/孔。下室加入含10% FBS的培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取出上室,用棉簽拭去上室內未穿過膜的細胞,0.1%的結晶紫染液將小室多孔膜下表面的細胞染色,顯微鏡下觀察,每孔取4個視野計數(shù)細胞數(shù),取平均值。

1.9　統(tǒng)計學分析

2　結果

2.1　腎癌細胞株中LINC01128的表達

qPCR結果顯示，腎癌細胞株A498、ACHN、786-O、OS-RC-2和人近端腎小管上皮細胞HK-2中LINC01128的表達分別為0.18±0.08，0.60±0.10，0.44±0.07，0.55±0.13和1.02±0.24(P<0.05，見圖1)，A498細胞中LINC01128的表達最低，表明LINC01128可能參與腎癌的發(fā)生發(fā)展。

與對照組(HK-2)比較,*P<0.05,**P<0.01圖1　qPCR檢測腎癌細胞株中LINC01128表達情況Figure 1　Expression of LINC01128 in renal cancer cell lines by qPCR

2.2　A498細胞中LINC01128和PTEN mRNA的表達

qPCR結果顯示，對照組和實驗組A498細胞中LINC01128相對表達量分別為1.09±0.57和72.27±13.78(t=10.320,P<0.001)，A498細胞中PTEN mRNA相對表達量分別為1.03±0.29和4.10±1.15(t=5.179,P=0.002)。實驗組中LINC01128和PTEN mRNA的相對表達量顯著高于對照。

2.3　高表達LINC01128對腎癌細胞PTEN蛋白及相關蛋白表達的影響

Western blot結果顯示,與對照組相比,實驗組中PTEN和E-cadherin蛋白表達升高,CDK4、Cyclin D1和N-cadherin蛋白表達降低(見圖2),表明LINC01128具有促進PTEN蛋白表達的作用。

圖2　Western blot檢測PTEN及相關蛋白的表達Figure 2　Expression of PTEN and related proteins by Western blot

2.4　高表達LINC01128對腎癌細胞周期分布的影響

流式細胞術顯示,實驗組中G0/G1期細胞比例顯著高于對照組(P<0.01),S期和G2/M期細胞比例顯著低于對照組(P<0.05,見表1),表明LINC01128可抑制A498細胞周期的進展。

分組G0/G1期S期G2/M期對照組41.84±3.8229.97±3.5528.19±4.88實驗組61.06±5.96**18.33±4.03**20.61±2.58*

與對照組比較,*P<0.05,**P<0.01

2.5　高表達LINC01128對腎癌細胞增殖活性的影響

CCK-8法結果顯示，在第4天，對照組和實驗組A498細胞的吸光度OD值分別為1.88±0.19和1.18±0.12(t=6.261，P<0.001)。在第5天，對照組和實驗組細胞的吸光度OD值分別為2.67±0.47和1.51±0.24(t=4.385，P=0.005)，實驗組的腎癌A498細胞吸光度明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見圖3)。表明高表達LINC01128的A498細胞的增殖活性受到抑制。

2.6　高表達LINC01128對腎癌細胞克隆形成能力的影響

克隆形成實驗顯示，對照組和實驗組A498細胞形成的克隆數(shù)分別為191.68±35.69和71.23±29.05(t=5.234，P=0.002，見圖4)。與對照組相比，實驗組腎癌細胞形成的克隆數(shù)顯著減少(P<0.05)，表明高表達LINC01128后腎癌細胞的克隆形成能力被抑制。

與對照組比較,*P<0.05,**P<0.01圖3　CCK-8法檢測LINC01128對腎癌細胞增殖活性的影響Figure 3　Effect of LINC01128 on the proliferation of renal cell carcinoma cells detected by CCK-8 assay

圖4　LINC01128對腎癌細胞克隆形成能力的影響Figure 4　Effect of LINC01128 on colony forming ability of renal cell carcinoma cells

2.7　高表達LINC01128對腎癌細胞侵襲能力的影響

Transwell實驗結果顯示,對照組和實驗組A498細胞穿過多孔膜的細胞數(shù)分別為122.55±33.40和32.62±11.82(t=5.076,P=0.002,見圖5),實驗組腎癌細胞穿膜能力明顯低于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。提示高表達LINC01128的A498細胞的侵襲能力受到抑制。

圖5　LINC01128對腎癌細胞侵襲能力的影響Figure 5　Effect of LINC01128 on invasive ability of renal cell carcinoma cells

3　討論

腎癌的發(fā)病是一個綜合病因導致的復雜過程,目前尚未研究透徹[6]。由于腎癌對放、化療均不敏感,研究調控腎癌細胞增殖、侵襲等的相關基因一直是研究熱點[7,8]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類長度大于200個核苷酸的不編碼蛋白的內源性RNA分子,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的調節(jié)作用[9]。已有研究發(fā)現(xiàn),lncRNA的表達異常與腎癌的發(fā)生發(fā)展密切相關。lncRNA如PVT1、ROR、Z38等具有促進腎癌細胞增殖或轉移的作用,表現(xiàn)為癌基因的作用[10-12]。另一些lncRNA如EGOT、SDPR-AS、CASC2等在腎癌細胞中發(fā)揮抑癌作用[13-15]。LINC01128是一種新發(fā)現(xiàn)的lncRNA,其調控腫瘤如腎癌的具體機制尚處于研究階段。

本研究通過qPCR檢測,LINC01128在腎癌細胞株中的表達量低于人近端腎小管上皮細胞,尤其在A498細胞中LINC01128表達量降低的更為顯著。PTEN被普遍認為是一種抑癌基因,具有磷酸酶活性[16]。PTEN在腎癌組織和細胞中表達降低,與腎癌的增殖和轉移等生物學行為密切相關,通過促進PTEN基因的表達,可能會抑制腎癌細胞的增殖和轉移[17,18]。本研究證實,高表達LINC01128可明顯促進PTEN基因的表達。本實驗結果表明,高表達LINC01128后的腎癌細胞周期進展被抑制,細胞的增殖活性和增殖能力降低,細胞的侵襲能力下降,表明高表達LINC01128具有抑制腎癌細胞增殖和侵襲的作用。Western blot實驗顯示,高表達LINC01128促進PTEN基因的表達后,CDK4、Cyclin D1和N-cadherin蛋白的表達水平降低,E-cadherin蛋白的表達水平增加。Cyclin D1和CDK4可形成復合物,調控細胞周期G-S進度。G1期阻滯導致A498細胞不能進入S期合成DNA,從而抑制了細胞增殖[19]。LINC01128可能通過抑制CyclinD1-CDK4復合物的形成,阻滯細胞周期,進而抑制A498細胞增殖。上皮間質轉化(EMT)是指上皮細胞失去極性,上皮細胞表型如E-cadherin蛋白表達降低,減值表型N-cadherin蛋白表達升高,細胞黏附力下降,細胞遷移和侵襲能力增強[20]。LINC01128可能通過抑制N-cadherin蛋白的表達、促進E-cadherin蛋白的表達,從而間接抑制A498細胞的遷移和侵襲能力。

綜上所述,本研究表明LINC01128在腎癌細胞株中呈低表達,高表達LINC01128可能阻滯A498細胞于G0/G1期,抑制腎癌腎胞的增殖和侵襲能力,作用機制可能為LINC01128促進細胞中PTEN基因的表達,從而抑制腫瘤細胞的生長。為LINC01128作為腎癌的診斷指標,以及預防和治療腎癌提供實驗依據(jù)。

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