孟帥 徐鵬 張迎信 王宏 曹立勇 程式華 沈希宏

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利用CRISPR/Cas9技術(shù)編輯粒長(zhǎng)基因改善粳稻花時(shí)

孟帥 徐鵬 張迎信 王宏 曹立勇 程式華 沈希宏*

(中國(guó)水稻研究所/浙江省超級(jí)稻研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/水稻生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 311401；)

【目的】花時(shí)不遇是影響雜交水稻制種產(chǎn)量的直接因素之一，已有研究表明水稻粒型差異對(duì)花時(shí)有影響。本研究采用功能缺失突變來(lái)研究粳稻花時(shí)差異，以期為粒型影響花時(shí)提供佐證?！痉椒ā坷肅RISPR/Cas9技術(shù)來(lái)定向編輯控制粒長(zhǎng)基因，獲得13對(duì)粒型差異的近等基因系粳稻，小區(qū)種植，采用目測(cè)法來(lái)調(diào)查花時(shí)?！窘Y(jié)果】獲得轉(zhuǎn)基因T0植株并對(duì)其T1植株測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)白25、吉粳102、浙粳88、武運(yùn)粳27和J42均發(fā)生單堿基插入移碼突變，墾鑒稻6號(hào)、空育131、浙粳22、揚(yáng)粳4227、南粳9108、J5933、J6167和J5938均發(fā)生部分堿基缺失突變。對(duì)T1植株粒型考查表明，突變體的粒長(zhǎng)均顯著長(zhǎng)于野生型。對(duì)穩(wěn)定的后代花時(shí)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，粒型變長(zhǎng)的突變體均比野生型花時(shí)有所提前，且吉粳102、空育131、浙粳88、武運(yùn)粳27、揚(yáng)粳4227這5個(gè)材料的突變體花時(shí)均顯著早于野生型，其余材料開花也提早，但不顯著。【結(jié)論】長(zhǎng)粒型粳稻突變體的花時(shí)早于短粒粳稻野生型，這一研究可為粳稻粒型育種提供參考，加速長(zhǎng)粒粳稻親本選育，有望推動(dòng)雜交粳稻發(fā)展。

粳稻；花時(shí)；CRISPR/Cas9；

我國(guó)水稻的種植面積約3067 萬(wàn)hm2，其中粳稻種植面積約占21.7%，而雜交粳稻的種植面積僅占粳稻播種面積的5%[1-3]，相比雜交秈稻而言，雜交粳稻的發(fā)展相對(duì)緩慢，應(yīng)用十分有限，其中制種產(chǎn)量低是影響雜交粳稻發(fā)展的主要因素之一[4-5]。粳稻開花習(xí)性差是制約制種產(chǎn)量的主要因素，主要表現(xiàn)在開花不集中且分散，高峰期不明顯[6]。

對(duì)于雜交水稻育種而言，不育系柱頭外露是一個(gè)優(yōu)良性狀，柱頭外露有利于水稻異花授粉，從而提高異交結(jié)實(shí)率。研究表明，粳稻的柱頭一般不外露或者外露率很低[7]，選育柱頭外露率高的粳稻材料相對(duì)較難。除了選擇柱頭外露率高的材料外，田大成等[8]認(rèn)為花時(shí)不遇對(duì)粳稻異交結(jié)實(shí)特性影響較大。造成這一差異的因素主要有3種，即花器官特性、品種類型間差異、谷粒的長(zhǎng)寬比[9]。近年來(lái)，隨著雜交水稻親本開花習(xí)性研究的不斷深入[10]，同一亞種(秈稻或粳稻)水稻，其開花習(xí)性也存在差異。谷粒越長(zhǎng)，開花越早；谷粒越圓，開花越遲[11-13]，而這在粳稻品種中尤為突出，但對(duì)這一現(xiàn)象目前還缺乏系統(tǒng)深入研究，其分子調(diào)控機(jī)制還不十分清楚。由于谷粒長(zhǎng)度和長(zhǎng)寬比具有穩(wěn)定的遺傳特性，因此，粒型可作為現(xiàn)今選育早花時(shí)不育系的一種參考[14]，可望通過(guò)改變谷粒的長(zhǎng)度和長(zhǎng)寬比來(lái)調(diào)整水稻開花早晚的問(wèn)題。

是第一個(gè)被克隆調(diào)控粒型的基因，主要調(diào)控水稻粒長(zhǎng)和粒重的主效QTL。當(dāng)其N端調(diào)控器官大小的結(jié)構(gòu)域(OSR)發(fā)生功能缺失突變后，會(huì)導(dǎo)致水稻籽粒變長(zhǎng)[15-17]。CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/ CRISPR-associated Protein 9)[18-20]是近幾年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種對(duì)基因進(jìn)行編輯的技術(shù)，該技術(shù)操作簡(jiǎn)便，效率高，安全可靠且成本較低[21-23]。研究者利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)擬南芥、水稻等植物進(jìn)行了基因編輯[24-26]。Shan等[27]利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)水稻基因和實(shí)現(xiàn)編輯，該技術(shù)在水稻基因編輯中開創(chuàng)了先例，與此同時(shí)，基因編輯技術(shù)也給花時(shí)研究提供了一種新的技術(shù)途徑與方法。

紅色字母表示起始密碼子，藍(lán)色字母表示PAM序列。線條表示內(nèi)含子，黑盒子代表外顯子。

Fig. 1. Schematic diagram of the geneand the targeted site.

本研究主要利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)控制粒長(zhǎng)主效基因進(jìn)行編輯，通過(guò)改善水稻粒長(zhǎng)及長(zhǎng)寬比來(lái)探究花時(shí)差異，進(jìn)而為粳稻育種研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

13對(duì)近等基因系材料，來(lái)自長(zhǎng)白25、吉粳102、空育131、墾鑒稻6號(hào)、浙粳22、浙粳88、武運(yùn)粳27、揚(yáng)粳4227、南粳9108、J5933、J6167、J5938、J42及它們的基因編輯突變體。T1植株2016年冬季種植于中國(guó)水稻研究所海南陵水轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)基地，進(jìn)行陽(yáng)性株鑒定、基因型檢測(cè)和粒型等性狀的調(diào)查；T2植株夏季種植于中國(guó)水稻研究所富陽(yáng)轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)基地，2017年5月22日、6月5日、6月20日分3期播種，溫室內(nèi)于7月22日播種，調(diào)查開花。

1.2 靶位點(diǎn)的選擇及驗(yàn)證

根據(jù)CRISPR/Cas9系統(tǒng)識(shí)別前間區(qū)序列鄰近基序(Protospacer Adjacent Motif, PAM)，在上游約20個(gè)核苷酸序列處設(shè)計(jì)靶位點(diǎn)序列AGTGACATG GCAATGGCGG，并添加接頭引物GS3-CAS9，靶位點(diǎn)的特異性通過(guò)Cas-OFFinder (http://www. rgenome.net/cas-offinder/)分析和水稻基因組BLAST分析驗(yàn)證，最終將靶序列選在第1外顯子上(圖1)。

1.3 CRISPR/Cas9表達(dá)載體的構(gòu)建及基因編輯

本研究所用中間載體SK-gRNA和表達(dá)載體PC1300-Cas9由中國(guó)水稻研究所基因資源挖掘課題組提供。利用試劑盒快速把sgRNA靶位點(diǎn)序列插入中間載體SK-gRNA中，然后將含有靶位點(diǎn)的序列用酶Ⅰ(Ferment公司產(chǎn)品)切割下來(lái)，最后再用T4(NEB公司)連接酶連接至最終載體PC1300-Cas9上。用載體引物T3及引物GS3-CAS9R對(duì)構(gòu)建的最終載體測(cè)序分析(測(cè)序由杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司完成)，驗(yàn)證質(zhì)粒構(gòu)建正確。后期送公司完成轉(zhuǎn)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化水稻愈傷，并獲得T0代轉(zhuǎn)基因植株。

表1 本研究所用引物

1.4 引物

本研究所用的引物見(jiàn)表1，引物由杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。

1.5 T0代陽(yáng)性株及基因型的檢測(cè)

用CTAB法[28]提取轉(zhuǎn)基因T0代植株葉片DNA，放置在－20℃冰箱中保存。分別用設(shè)計(jì)的潮霉素引物HygF/R和載體引物CAS9F/R擴(kuò)增，然后將提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，PCR體系如下：2×Master Mix 7.5 μL，前后引物(10 μmol/L)各0.5 μL，DNA 1 μL，ddH2O 5.5 μL。PCR程序如下：94℃下90 s；94℃下30 s；57℃下30 s；72℃下30 s；72℃下5 min；10℃下5 min。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后用EB溶液染色并拍照。能跑出條帶的說(shuō)明是陽(yáng)性植株，然后進(jìn)行基因型的檢測(cè)。

1.6 靶位點(diǎn)的檢測(cè)

為了檢測(cè)靶位點(diǎn)的突變類型，我們?cè)O(shè)計(jì)引物GS3-F/G來(lái)擴(kuò)增T0代陽(yáng)性株的目的片段，將含有目的片段的樣品送測(cè)序公司測(cè)序分析。純合體出現(xiàn)單峰，雜合體出現(xiàn)雙峰，對(duì)于雜合株可用在線軟件工具DSDecode(http://dsdecode.scgene.com/)進(jìn)行峰圖分析，以獲得雜合突變信息[29-30]。

1.7 突變體表型分析

在抽穗期選取同一背景下野生型和突變體植株各6株，分別觀察記錄抽穗日期，取其平均值。同時(shí)在成熟期測(cè)量其株高，并選取所選每個(gè)單株的主穗，考查植株粒型。將種子烘干，每個(gè)單株隨機(jī)選擇50粒飽滿的種子測(cè)量粒長(zhǎng)、粒寬及長(zhǎng)寬比。獲得的數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2010進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.8 花時(shí)調(diào)查

采用目測(cè)法[31]調(diào)查水稻花時(shí)。分別進(jìn)行田間和溫室試驗(yàn)。田間每份材料種植6株，作為一個(gè)小區(qū)，每期每株調(diào)查7 d的花時(shí)，取每份材料花時(shí)的平均值。溫室的光溫參數(shù)如下：7:30－19:30, 30℃, 相對(duì)濕度為75%；19:31－次日7:30, 24℃, 相對(duì)濕度為85%。溫室內(nèi)，每份材料種植3株，每株調(diào)查5 d的花時(shí)，取平均值。花時(shí)統(tǒng)計(jì)以午夜0點(diǎn)為基準(zhǔn)，用分鐘來(lái)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 CRISPR/Cas9表達(dá)載體的構(gòu)建

已知基因是調(diào)控粒長(zhǎng)的主效基因，通過(guò)對(duì)該基因的序列分析發(fā)現(xiàn)，該基因由5個(gè)外顯子組成，編碼一個(gè)由232個(gè)氨基酸組成的跨膜蛋白，而該基因編碼的蛋白對(duì)粒型起負(fù)調(diào)控作用。在第1外顯子上選取一條長(zhǎng)度為20 bp特異性較好的靶位點(diǎn)序列，并將其構(gòu)建到中間載體上后再連接到表達(dá)載體中，用于開展轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)(圖2)。

2.2 獲取轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株

將帶有靶位點(diǎn)的表達(dá)載體通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化到受體材料內(nèi)并獲得轉(zhuǎn)基因T0植株，然后通過(guò)載體引物CAS9來(lái)鑒定載體是否成功整合到植株體的基因組內(nèi)。分別獲得長(zhǎng)白25、吉粳102、空育131、墾鑒稻6號(hào)、浙粳22、浙粳88、武運(yùn)粳27、揚(yáng)粳4227、南粳9108、J5933、J6167、J5938和J42轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株苗32、38、42、45、40、55、40、33、56、33、38、39、45株。將這13份突變材料分別種植于海南獲得T1植株。

HPT－潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因；LB－左邊界；RB－右邊界；Cas9蛋白的啟動(dòng)子是35S；GS3的sgRNA的啟動(dòng)子為U3。

Fig. 2. Schematic diagram illustrating the structure of CRISPR/Cas9-expressing vector targeting with.

靶序列為紅色部分，PAM序列用藍(lán)色部分，堿基插入的用藍(lán)色小寫字母表示，缺堿基的用藍(lán)色連字表示。WT－野生型；CB25－長(zhǎng)白25； KJD6－墾鑒稻6號(hào)；JJ102－吉粳102；KY131－空育131；ZJ22－浙粳22；NJ9108－南粳9108；ZJ88－浙粳88；WYJ27－武運(yùn)粳27；YJ4227－揚(yáng)粳4227。圖4和表3中的品種代號(hào)與該圖相同。

Fig. 3. Mutation types atloci of thirteenvarieties in T1generation.

2.3 基因型檢測(cè)

為了進(jìn)一步了解這13份突變體材料的基因型，提取T1陽(yáng)性植株DNA，并用引物GS3測(cè)序分析。每份材料均選取發(fā)生純合突變的序列進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)果表明，長(zhǎng)白25、吉粳102、浙粳88、武運(yùn)粳27和J42均在第1外顯子ATG下游8 bp處發(fā)生單堿基(T、G)插入突變，而墾鑒稻6號(hào)、空育131、浙粳22、揚(yáng)粳4227、南粳9108、J5933、J6167和J5938發(fā)生部分堿基缺失突變(圖3)。

2.4 T1植株性狀考查分析

對(duì)T1植株后代純合的植株進(jìn)行粒型考種分析和農(nóng)藝性狀考查。結(jié)果表明，13份突變體粒型均比野生型顯著增長(zhǎng)，長(zhǎng)寬比也顯著增長(zhǎng)(圖4)。其中長(zhǎng)白25、墾鑒稻6號(hào)、吉粳102、空育131、浙粳88、武運(yùn)粳27、揚(yáng)粳4227、J6167、J42等9份材料的突變體的粒長(zhǎng)較野生型植株增加0.22~0.94 mm，且達(dá)極顯著水平，而浙粳22、南粳9108、J5933、J5938等4份材料的突變體粒長(zhǎng)較野生型植株增加0.01~0.26 mm，達(dá)顯著水平。同時(shí)13份突變體的株高均比其野生型低，且長(zhǎng)白25、墾鑒稻6號(hào)、吉粳102、空育131、浙粳22、浙粳88、武運(yùn)粳27、揚(yáng)粳4227、J6167、J5938、J42等11份材料表現(xiàn)出顯著差異(0.05水平)。所有材料在播始?xì)v期上無(wú)明顯差異(表3)。

2.5 花時(shí)差異分析

選取同一背景條件下的13對(duì)材料，選取后代純合突變植株進(jìn)行田間花時(shí)調(diào)查統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表明突變體的花時(shí)早于野生型花時(shí)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，吉粳102、武運(yùn)粳27、空育131和浙粳88的突變體花時(shí)均比野生型的花時(shí)早10~15 min，吉粳102和浙粳88的突變體在花時(shí)上表現(xiàn)出顯著差異，而空育131和武運(yùn)粳27在花時(shí)上表現(xiàn)出極顯著差異(表3，圖5-A)。在溫室內(nèi)進(jìn)一步對(duì)花時(shí)觀察發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)白25、空育131、浙粳88、武運(yùn)粳27和揚(yáng)粳4227野生型的花時(shí)均比突變體的花時(shí)晚大約17 min(圖5-B)，最終統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，長(zhǎng)白25、空育131、浙粳88和武運(yùn)粳27的花時(shí)均表現(xiàn)出極顯著差異，而且揚(yáng)粳4227的花時(shí)也表現(xiàn)出顯著差異。因此，通過(guò)以上數(shù)據(jù)的分析發(fā)現(xiàn)，溫室內(nèi)的花時(shí)差異均比田間的花時(shí)差異大，且揚(yáng)粳4227的觀察結(jié)果進(jìn)一步顯示環(huán)境因素對(duì)水稻花時(shí)的影響，盡管環(huán)境因素對(duì)花時(shí)存在影響，但綜上調(diào)查結(jié)果表明粳稻粒型對(duì)水稻花時(shí)存在影響，即長(zhǎng)粒型的粳稻開花較早。

圖4 T1植株13份材料及其突變體粒型性狀

Fig. 4. Grain shape of the thirteen materials and their T1mutants.

表3 T1植株13份材料及其突變體的農(nóng)藝性狀

*和**分別表示野生型與突變體在0.05，0.01水平上顯著差異。

*,** Significant difference between WT and mutant at 0.05, 0.01 level, respectively.

A－田間試驗(yàn)。B－溫室調(diào)查。JJ102-吉粳102；KY131－空育131；ZJ88－浙粳88；WYJ27－武運(yùn)粳27；YJ4227－揚(yáng)粳4227；WT－野生型。*表示差異達(dá)0.05顯著水平; **表示差異達(dá)0.01顯著水平。

Fig. 5. Flowering time of five materials and their mutants.

3 討論

我國(guó)雜交水稻自1973年利用野敗胞質(zhì)實(shí)現(xiàn)三系配套以來(lái)，已取得舉世矚目的成就，幾十年來(lái)，科技人員主要通過(guò)提高柱頭外露率等方法來(lái)提高異交結(jié)實(shí)率，進(jìn)而提高雜交水稻制種產(chǎn)量。但水稻花時(shí)差異的不同也會(huì)對(duì)異交結(jié)實(shí)率產(chǎn)生一定的影響[32]。因此，改善水稻花時(shí)已成為育種家們不斷追求的目標(biāo)，現(xiàn)今對(duì)早花時(shí)材料的發(fā)掘和利用，可以有效解決雜交水稻制種中花時(shí)不遇的問(wèn)題。水稻花時(shí)是一個(gè)非常復(fù)雜的調(diào)控過(guò)程，不僅受基因網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控，還受外部環(huán)境的影響，二者共同作用所產(chǎn)生的多種信息匯集在一起從而精準(zhǔn)的調(diào)控水稻的花時(shí)[33]。然而我們?cè)谟N過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)粒的粳稻比短粒粳稻花時(shí)相對(duì)較早且較集中。為此，我們通過(guò)基因編輯技術(shù)在粳稻中構(gòu)建了近等基因系，進(jìn)行粳稻粒型與花時(shí)的關(guān)系研究。

本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)控制粒長(zhǎng)主效基因進(jìn)行編輯，獲得了粒長(zhǎng)較長(zhǎng)的突變體。通過(guò)田間和溫室對(duì)水稻花時(shí)的統(tǒng)計(jì)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，田間觀察結(jié)果顯示吉粳102、空育131、浙粳88和武運(yùn)粳27的野生型和突變體在花時(shí)上能夠表現(xiàn)出顯著的差異，而在溫室內(nèi)調(diào)查發(fā)現(xiàn)除了以上4份材料在花時(shí)上表現(xiàn)出顯著差異外，揚(yáng)粳4227也表現(xiàn)出顯著差異水平，說(shuō)明環(huán)境對(duì)水稻花時(shí)是有影響的?；〞r(shí)存在差異的植株，它們?cè)谥旮呱弦泊嬖诓町?，通過(guò)對(duì)基因的研究發(fā)現(xiàn)，該基因?qū)χ旮咝誀钜泊嬖谟绊?，而高超明等[34]研究發(fā)現(xiàn)田間溫度和濕度離地表距離不同而存在差異，這一現(xiàn)象說(shuō)明控制粒長(zhǎng)的基因可能通過(guò)改變株高差異來(lái)間接影響花時(shí)。然而一些研究學(xué)者認(rèn)為引起花時(shí)差異的原因可能因?yàn)椴牧媳旧磉z傳背景的不同[35]，傳統(tǒng)的秈稻粒長(zhǎng)較傳統(tǒng)的粳稻長(zhǎng)，且秈亞種材料開花較粳稻要早。除此之外也有研究表明水稻分蘗角度的不同也會(huì)影響稻穗周圍的溫度和濕度[36]，水稻抽穗期溫濕度的不同會(huì)對(duì)花時(shí)產(chǎn)生影響[37]，但這些影響是否與粒型差異有關(guān)目前還尚未報(bào)道。

13份突變體的粒型雖然比野生型顯著增長(zhǎng)，但增加的粒長(zhǎng)僅有0.52 mm左右。而國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)中長(zhǎng)、中、短粒的標(biāo)準(zhǔn)分別為：6.50－7.5 mm、5.51－6.49 mm、<5.5 mm[38]。也就是說(shuō)，基因編輯材料的粒長(zhǎng)雖然顯著增加，但未達(dá)到從短粒到中粒長(zhǎng)粒的變化。這也許是造成本研究探究的粒型對(duì)開花的影響結(jié)果不是很理想的原因。我們利用創(chuàng)制的長(zhǎng)粒粳稻(≥6.5 mm)與傳統(tǒng)團(tuán)粒粳稻進(jìn)行了田間觀察對(duì)比[39-40]，發(fā)現(xiàn)花時(shí)差異可以達(dá)到半小時(shí)以上，而且開花高峰明顯集中，在杭州8月下旬，長(zhǎng)粒粳稻花時(shí)主要集中在10:30－12:00，其開花高峰主要集中在11:00－11:30，團(tuán)粒粳稻花時(shí)主要集中在11:00－13:00，其開花高峰不明顯[41]，另外，本研究中由于所選的轉(zhuǎn)基因受體材料部分是長(zhǎng)粒型粳稻(≥6.5 mm)，已比傳統(tǒng)的粳稻增加1~2 mm，可以看出通過(guò)基因編輯后的長(zhǎng)粒粳稻，有些材料粒型增加并不是很明顯，或許這可以解釋為什么13對(duì)材料中只有5對(duì)材料在花時(shí)上表現(xiàn)出差異。選取調(diào)控粒型的其他基因?qū)υ囼?yàn)材料進(jìn)行基因編輯或?qū)?3份突變體材料進(jìn)行再編輯，或許會(huì)獲得粒長(zhǎng)增加比率更大的粒型結(jié)果，這對(duì)于我們探究粒型對(duì)花時(shí)關(guān)系的研究可能會(huì)更有說(shuō)服力，也有望深入研究粒型調(diào)控開花習(xí)性的分子機(jī)理。除此之外，粒型大小改變也可能會(huì)對(duì)花器官和漿片的發(fā)育產(chǎn)生影響，這些變化都可能影響水稻的花時(shí)，當(dāng)花器官發(fā)育不健全時(shí)，主要表現(xiàn)在花絲發(fā)育不正常，彈力不足，最終導(dǎo)致花絲不能正常伸出進(jìn)而影響水稻開花[42]。近幾年，隨著分子信息學(xué)的快速發(fā)展，已有研究表明漿片吸水膨大響應(yīng)內(nèi)外源信號(hào)來(lái)調(diào)控內(nèi)外稃分離，使得內(nèi)稃向內(nèi)擠壓，最后內(nèi)外稃分開，花絲伸出，水稻開花[43-45]。此外，已有研究報(bào)道水稻不育系的開花相對(duì)分散，不集中[46]，或許這可以為減少制種雙親花時(shí)差異提供新思路，可以通過(guò)編輯早開花材料的育性基因來(lái)延遲花時(shí)，為制種雙親花時(shí)相遇提供機(jī)遇。但目前對(duì)于水稻花時(shí)的調(diào)控機(jī)制還不十分清楚，對(duì)花時(shí)基因發(fā)掘和研究可望為花時(shí)改良提供理論參考。筆者相信，隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，可以進(jìn)一步了解水稻花時(shí)的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)機(jī)制，選育花時(shí)較好的粳稻親本，推動(dòng)雜交粳稻發(fā)展。

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CRISPR/Cas9-mediated Editing ofto Improve Flowering Time inRice

MENG Shuai, XU Peng, ZHANG Yingxin, WANG Hong, CAO Liyong, CHENG Shihua, SHEN Xihong*

(China National Rice Research Institute / State Key Laboratory of Rice Biology / Key Laboratory for Zhejiang Super Rice Research, Hangzhou 311401, China;)

【Objective】Flowering time asynchrony is one of the main factors limiting seed production of hybrid rice between male and female parents, and some studies have shown that flowering time is related to grain shape. Loss of function mutant ofwas used to study the difference of flowering time in this study so as to elucidate the impact of grain shape on flowering time.【Method】CRISPR/Cas9-mediated editing ofto achieve 13 pairs of near-isogenic linevarieties. Then the flowering time was investigated with visual methods. 【Result】T1individuals derived from T0generation were genotyped. The sequencing results show that some bases were mutated with single base insertion, including Changbai 25, Jijing 102, Zhejing 88, Wuyunjing 27, J42 and others with bases deletion, including Kenjiandao 6, Kongyu 131, Zhejing 22, Yangjing 4227, Nanjing 9108, J5933, J6167, J5938. For the grain shape of T1, themutants conferred longer grain length compared to the wild type, and themutants of Jijing 102, Kongyu 131, Zhejing 88, Wuyunjing 27 and Yangjing 4227 were significantly earlier in flowering time than those of the wild type. The others were also earlier, but not significant.【Conclusion】 Long-grainrice has an earlier flowering time than short-grainrice, which could provide references to study the grain-type breeding ofrice, and it would accelerate the breeding process of long-grainparents and promote the development of hybridrice.

rice; flowering time; CRISPR/Cas9;

Corresponding author, E-mail: xihongshen@126.com

Q785；S511.032

A

1001-7216(2018)02-0119-09

2017-09-11；

2017-11-17。

國(guó)家863計(jì)劃資助項(xiàng)目(2014AA10A603)；國(guó)家公益性農(nóng)業(yè)科技研究專項(xiàng)(201403002)；中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新工程超級(jí)稻育種創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)和水稻雜種優(yōu)勢(shì)研究機(jī)理研究創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)資助項(xiàng)目(CAAS-ASTIP-2013-CNRRI)；國(guó)家自然科學(xué)青年科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31501290)。

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10.16819/j.1001-7216.2018.7112