江紹鋒 王陳驕子 舒燦偉 周而勛

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水稻紋枯病菌基因的克隆及其表達(dá)分析

江紹鋒 王陳驕子 舒燦偉 周而勛*

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/廣東省微生物信號(hào)與作物病害防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣州 510642;)

【目的】為了闡明苯酚2-單加氧酶基因()在水稻紋枯病菌(AG-1ⅠA)黑化中的功能,【方法】采用常規(guī)PCR和RT-PCR技術(shù)對(duì)該基因進(jìn)行克隆和生物信息學(xué)分析，通過熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)檢測在兒茶酚脅迫下該基因的相對(duì)表達(dá)量。【結(jié)果】生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，基因的DNA和cDNA全長序列分別為2 628 bp和1 983 bp，編碼660個(gè)氨基酸。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，基因在立枯絲核菌()不同融合群中具有較近的親緣關(guān)系，在不同真菌之間在進(jìn)化上具有一定保守性。通過qRT-PCR技術(shù)分析了在不同濃度兒茶酚脅迫下水稻紋枯病菌基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況。外源兒茶酚能提高基因的表達(dá)量，在12.5 μg/mL濃度下表達(dá)量最高，極顯著上調(diào)35.7倍，在25 μg/mL和50 μg/mL濃度下表達(dá)量分別上調(diào)19.1倍和28.4倍，但在100 μg/mL濃度下表達(dá)量僅上調(diào)2.1倍?！窘Y(jié)論】獲得了基因全長序列，了解了其基本生物學(xué)信息，明確了其在兒茶酚脅迫下的表達(dá)模式。研究結(jié)果為科學(xué)、系統(tǒng)地闡明水稻紋枯病菌基因調(diào)控黑色素形成機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。

水稻紋枯病菌；苯酚2-單加氧酶基因；基因克隆；表達(dá)分析

由立枯絲核菌(Kühn) AG-1 ⅠA融合亞群引起的水稻紋枯病是世界范圍內(nèi)分布最為廣泛的水稻三大真菌病害之一。立枯絲核菌()是一種經(jīng)濟(jì)上非常重要的土傳性病原真菌，其分布范圍廣泛，寄主類型多種多樣，除為害水稻外，還可為害馬鈴薯、玉米、小麥、大豆和甘藍(lán)等260多種植物[1-4]。

加氧酶指能催化氧分子加入到有機(jī)物質(zhì)中的酶，是芳香化合物降解過程中的重要酶類，它廣泛存在于各種生命活動(dòng)的新陳代謝過程中。加氧酶按照催化氧原子的個(gè)數(shù)可以劃分為兩類：將兩個(gè)氧原子都催化反應(yīng)進(jìn)入底物的雙加氧酶和只催化一個(gè)氧原子進(jìn)入底物的單加氧酶[5]。苯酚2-單加氧酶(phenol 2-monooxygenase，Phm)是一種單加氧的氧化還原酶，能催化苯酚、NADPH和H+在有氧條件生產(chǎn)兒茶酚、NADP+和水[6]。微生物對(duì)芳香族化合物的降解可以分為苯環(huán)的激活以及對(duì)被激活苯環(huán)的開環(huán)兩個(gè)過程，加氧酶參與芳香族化合物、多環(huán)芳烴、農(nóng)藥等多個(gè)種類的污染物(如六六六、甲苯、二甲苯、萘和蒽等)的降解代謝途徑[6-8]。苯酚2-單加氧酶是苯酚降解中的關(guān)鍵芳環(huán)加氧酶。首先，通過苯酚羥基化作用下生成兒茶酚；然后兒茶酚在C12O和C23O作用下分別通過鄰位開環(huán)和間位開環(huán)形式被進(jìn)一步降解[9]。

黑色素是植物病原真菌的主要毒力因子和抗逆因子。許多植物病原真菌的菌絲、分生孢子和菌核都能產(chǎn)生黑色素，從而以多種方式增強(qiáng)真菌的毒力和抗逆性[10-11]。大多數(shù)致病真菌可通過內(nèi)源性前體物質(zhì)代謝合成黑色素，但新生隱球菌()需要添加外源性左旋多巴(-DOPA)才能形成黑色素[12]。兒茶酚是合成黑色素的前體物質(zhì)，已經(jīng)在玉蜀黍黑粉菌()的厚垣孢子內(nèi)發(fā)現(xiàn)[13]。本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加兒茶酚有利于促進(jìn)水稻紋枯病菌黑色素的生物合成和積累，從而加快細(xì)胞壁的黑化和增厚[14]。目前，尚未見到關(guān)于水稻紋枯病菌苯酚2-單加氧酶()基因的研究報(bào)道。本研究通過對(duì)基因的克隆及其在兒茶酚誘導(dǎo)下的表達(dá)分析，為深入研究基因調(diào)控水稻紋枯病菌黑色素形成機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株和培養(yǎng)基配制

水稻紋枯病菌(AG-1ⅠA) GD-118菌株是本實(shí)驗(yàn)室分離和保存的強(qiáng)致病力菌株[15]。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar，PDA)：馬鈴薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂粉18.0 g，雙蒸水1 000.0 mL。馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(potato dextrose broth，PDB)：馬鈴薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，雙蒸水1 000.0 mL。

LBA固體培養(yǎng)基(luria-bertani agar，LBA)：胰蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，NaCl 10.0 g，調(diào)pH至7.4，瓊脂粉15.0 g，雙蒸水1 000.0 mL。LBB液體培養(yǎng)基(luria-bertani broth，LBB)：胰蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，NaCl 10.0 g，調(diào)pH值至7.4，雙蒸水1 000.0 mL。

1.2 主要試劑

真菌DNA提取試劑盒、RNA提取試劑盒、克隆載體-T1、-T1感受態(tài)細(xì)胞、RT-PCR試劑盒、普通酶和高保真酶均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。兒茶酚、氨芐青霉素鈉、IPTG和X-Gal購自Sigma公司。引物(表1)合成和測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.3 菌絲體培養(yǎng)與收集

水稻紋枯病菌GD-118菌株在PDA平板上培養(yǎng)2 d后，用內(nèi)徑5.0 mm的打孔器在菌落邊沿打取菌絲塊，在每個(gè)裝有150 mL PDB培養(yǎng)液（分別含0，12.5，25，50，100 μg/mL兒茶酚）的三角瓶中接入10塊菌絲塊，28℃恒溫下?lián)u床振蕩培養(yǎng)3 d后，用無菌濾紙過濾收集菌絲體，無菌水將菌絲體洗滌2~3次，菌絲體用多層滅菌濾紙吸干表面水分后，放入―20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 DNA和RNA的提取

水稻紋枯病菌GD-118 DNA和RNA的提取按照真菌DNA提取試劑盒和RNA提取試劑盒的說明書進(jìn)行。在采用瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性、紫外分光光度測定其純度和含量，提純后的DNA和RNA樣品分別保存于―20℃冰箱和―80℃超低溫冰箱中，備用。

1.5 RsPhm基因DNA和cDNA克隆

根據(jù)水稻紋枯病菌基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫[16]，用Vector NTI 軟件設(shè)計(jì)一對(duì)水稻紋枯病菌基因特異性引物，引物序列為DF01905和DR01905(表1)。以總RNA為模板，利用RT-PCR試劑盒進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增得到cDNA。以基因組DNA和cDNA為模板，分別采用北京全式金生物技術(shù)有限公司的普通酶和高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系如下：PCR混合液25 μL，10 μmol/L DF01905和DR01905引物各1 μL，模板1 μL，普通酶或高保真酶1 μL，再加雙蒸水22 μL。PCR程序如下：94℃下預(yù)變性3 min；94℃下變性30 s，55℃下退火30 s，72℃下延伸3 min，35個(gè)循環(huán)后72℃下延伸10 min。PCR產(chǎn)物保存于4℃冰箱。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收、連接，化學(xué)法轉(zhuǎn)入到-T1感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過藍(lán)白斑篩選及菌液PCR電泳鑒定，篩選陽性克隆。取5 μL PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，加入1 μL 6×上樣緩沖液，在5~8 V/cm電壓條件下電泳30 min，于凝膠成像系統(tǒng)下觀察分析并拍照留存。陽性克隆的測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。測序結(jié)果利用Conting Express軟件進(jìn)行拼接，并利用NCBI在線工具對(duì)水稻紋枯病菌基因進(jìn)行序列基本結(jié)構(gòu)和特征分析。

表1 本研究使用的引物序列

1.6 RsPhm基因生物信息學(xué)分析

通過在線程序和軟件對(duì)水稻紋枯病菌基因所編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測和分析，預(yù)測和分析參數(shù)有RsPhm蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三維結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，具體分析軟件如下：

1)蛋白質(zhì)理化性質(zhì)預(yù)測

http://web.expasy.org/protparam/；

2)信號(hào)肽的預(yù)測

http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/；

3)跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測與分析

http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html；

4)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

http://imtech.res.in/raghava/apssp/；

5)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的預(yù)測

https://swissmodel.expasy.org/interactive；

6)系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

采用MEGA 4對(duì)水稻紋枯病菌RsPhm蛋白質(zhì)與其他真菌RsPhm蛋白質(zhì)的進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行分析。

1.7 RsPhm基因定量表達(dá)分析

以水稻紋枯病菌甘油醛3-磷酸()基因作為內(nèi)參基因，檢測水稻紋枯病菌在不同濃度兒茶酚處理下基因在轉(zhuǎn)錄水平上的相對(duì)表達(dá)量。RNA樣品用DNaseⅠ進(jìn)行預(yù)處理后，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成單鏈cDNA作為模板?；谝芽寺〉乃炯y枯病菌基因的cDNA序列，設(shè)計(jì)的一對(duì)引物為F01905和R01905；以基因?yàn)閮?nèi)參，引物為GAPDH和GAPDHR(表1)。qRT-PCR體系如下：SYBR Green PCR Master Mix為10 μL、10 μmol/L F01905和R01905引物各1 μL、不同樣本的cDNA（稀釋5倍）為2.0 μL，再加雙蒸水6 μL，包括不加cDNA模板為陰性對(duì)照。在Bio-Rad CFX儀器上進(jìn)行實(shí)時(shí)定量(qRT)PCR，反應(yīng)程序如下：預(yù)變性95℃ 2 min；95℃變性15 s；60℃退火15 s，72℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)收集熒光。內(nèi)參基因qRT-PCR體系，除引物不同外，其余參數(shù)同基因。數(shù)據(jù)收集和分析采用Bio-Rad CFX Manager Sofware 2.0進(jìn)行分析，每個(gè)樣品3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 RsPhm基因核苷酸和氨基酸序列分析

將PCR產(chǎn)物純化回收、連接轉(zhuǎn)化、測序，對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行拼接并去掉載體序列，得到DNA和cDNA全長序列分別為2 628 bp和1 983 bp，與瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果一致（圖1）。用DNAStar軟件分析篩選獲得的基因cDNA序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列，以ATG為起始密碼子，TAA為終止密碼子，共編碼660個(gè)氨基酸（圖2）。經(jīng)生物信息學(xué)分析，基因編碼蛋白質(zhì)分子式為C3226H5056N908O970S23；相對(duì)分子質(zhì)量為72 818.51 ku，理論等電點(diǎn)為5.94，含堿性氨基酸74個(gè)，酸性氨基酸83個(gè)，疏水性氨基酸230個(gè)，極性氨基酸149個(gè)，屬于酸性親水性蛋白。RsPhm蛋白不含信號(hào)肽，預(yù)測其為非分泌蛋白。RsPhm蛋白存在5個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域，由3個(gè)內(nèi)到外和2個(gè)外到內(nèi)的雙向跨膜區(qū)域組成，屬于跨膜蛋白。利用SWISS-MODEL網(wǎng)站對(duì)基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測，發(fā)現(xiàn)RsPhm蛋白的三維結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋、β-折疊和不規(guī)則卷曲組成，并呈較均勻分布(圖3)。

M―250 bp DNA標(biāo)記; 1―以DNA為模板的RsPhm基因PCR產(chǎn)物; 2―以cDNA為模板的RsPhm基因PCR產(chǎn)物。

Fig. 1. PCR products ofgene in.

RsPhm為本研究結(jié)果，R. solani AG-1ⅠA、R. solani AG-1ⅠB、R. solani AG 22ⅢB、R. solani AG-3、R. solani AG-1ⅠB和R. solani 123E的NCBI GenBank注冊號(hào)分別為ELU44059.1、CEL56393.1、CUA74266.1、EUC54794.1、CCO31161.1和KEP48781.1。

Fig. 2. Comparison of amino acid sequences of RsPhm proteins in different anastomosis groups of

圖3 水稻紋枯病菌RsPhm蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測

Fig. 3. Three-dimensional structure prediction of RsPhm protein inAG-1 IA.

2.2 RsPhm蛋白氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

通過NCBI網(wǎng)站分析工具，對(duì)立枯絲核菌與其他近緣真菌之間的RsPhm蛋白氨基酸序列同源性進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，本研究的水稻紋枯病菌(AG-1ⅠA)與立枯絲核菌()其他融合群或亞群的氨基酸同源性最高，均達(dá)到91%以上；其中與同一融合亞群(AG-1ⅠA, ELU44059.1)另一個(gè)菌株的同源性達(dá)94 %，與其他菌株或融合群的(123E、AG-1ⅠB、AG22ⅢB和AG-3)的同源性分別為93%、93%、91%和91%。而與離心射脈革菌()、多葉奇果菌()、白腐菌()、白環(huán)菇(sp. SymC. cos)、真姬菇()的氨基酸同源性分別為54%～59%、57%、55%，56%和54%，同源性較低。

為比較立枯絲核菌RsPhm蛋白氨基酸序列與其他近緣真菌RsPhm蛋白氨基酸序列的親緣關(guān)系，本研究從GeneBank中查詢得到立枯絲核菌不同融合群菌株與離心射脈革菌、多葉奇果菌、白腐菌、白環(huán)菇和真姬菇的RsPhm蛋白氨基酸序列，與本研究克隆出來的RsPhm蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，隨后利用MEGA 4軟件N-J法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，Bootstrap自舉值取1 000 次，顯示不同種屬真菌的進(jìn)化及親緣關(guān)系(圖4)。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果表明本研究克隆的RsPhm蛋白氨基酸序列和水稻紋枯病菌AG-1ⅠA其他菌株RsPhm蛋白氨基酸的序列同源性最高，同屬擔(dān)子菌門(Basidiomycota)，同時(shí)立枯絲核菌不同的融合群菌株獨(dú)立進(jìn)化為一支，表現(xiàn)出的親緣關(guān)系較其他真菌門的真菌更近，而與親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的其他真菌同源性則較低，與分類學(xué)地位及傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類結(jié)果一致，因而推測不同真菌種類的基因在進(jìn)化上具有一定的保守性。

2.2 兒茶酚誘導(dǎo)下RsPhm基因相對(duì)定量表達(dá)分析

對(duì)水稻紋枯病菌基因在不同濃度兒茶酚誘導(dǎo)下的轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況進(jìn)行了qRT-PCR分析，結(jié)果表明，在12.5~100 μg/mL濃度范圍內(nèi)的兒茶酚普遍能誘導(dǎo)基因上調(diào)表達(dá)。與對(duì)照相比，在12.5 μg/mL兒茶酚誘導(dǎo)下表達(dá)量相對(duì)最高，極顯著上調(diào)35.7倍；在25 μg/mL和50 μg/mL兒茶酚處理下上調(diào)表達(dá)量分別為19.1倍和28.4倍；但在100 μg/mL兒茶酚處理下上調(diào)表達(dá)量僅2.1倍。究其原因，可能是高濃度兒茶酚抑制水稻紋枯病菌生長，進(jìn)而負(fù)調(diào)控基因的表達(dá)(圖5)。兒茶酚是水稻紋枯病菌黑色素形成的前體合成物質(zhì)，推測基因表達(dá)水平與黑色素形成關(guān)系密切。

圖4 立枯絲核菌與其他近緣真菌的RsPhm蛋白氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹

Fig. 4. Phylogenetic tree of amino acid sequences of RsPhm proteins fromand other related fungi.

表中數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。*和**分別表示相對(duì)于對(duì)照在5%和1%上差異顯著。

Fig. 5. Expression level ofgeneinAG-1 IA at different concentrations of catechol.

3 討論

大多數(shù)的微生物都具有多個(gè)單加氧酶和雙加氧酶。苯酚2-單加氧酶屬于加氧酶家族，它是電子傳遞鏈上最關(guān)鍵的蛋白，通常含有黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)和鐵硫簇[2Fe-2S]，通過輔基負(fù)責(zé)將電子從NAD(P)H傳遞給羥化酶的雙鐵中心。本研究中RsPhm蛋白具有FAD結(jié)構(gòu)域，跟其他立枯絲核菌的二級(jí)結(jié)構(gòu)大致相同(圖2)。在己烷、乙醚和抗壞血酸的存在下，能提高嗜麥芽窄食單胞菌() KB2菌株的苯酚2-單加氧酶的酶活[17]。嗜酸硫化芽孢桿菌()可以將苯酚羥化成低毒的中間物質(zhì)，因此在降解污染物苯酚中發(fā)揮著重要的作用[18]。惡臭假單胞菌菌株DLL-E4(DLL-E4) 的偏三苯酚1, 2-雙加氧酶基因() 能夠?qū)ο趸椒雍蛯?duì)苯二酚進(jìn)行降解，而敲除菌株DLL-Δ仍然具有利用硝基苯酚和對(duì)苯二酚的能力，表明惡臭假單胞菌DLL-E4中除參與PNP降解代謝過程外，還存在另一個(gè)雙加氧酶能夠代謝PNP，進(jìn)而部分恢復(fù)了敲除的的功能[19]。惡臭假單胞菌PaW85(PaW85)的包含兒茶酚1,2-雙加氧酶()和苯酚2-單加氧酶()參與苯酚的降解途徑[20]。惡臭假單胞菌()和假單胞菌()都含有兒茶酚1,2-雙加氧酶基因和鄰苯二酚2,3-雙加氧酶基因，能通過多元苯酚羥化酶和鄰位裂解途徑降解長鏈烷基酚[21]。由此可見，單加氧酶和雙加氧酶對(duì)微生物代謝有機(jī)污染物具有重要作用。水稻紋枯病菌基因在兒茶酚誘導(dǎo)下的表達(dá)模式結(jié)果表明，隨著兒茶酚濃度升高，基因表達(dá)水平提高，同時(shí)兒茶酚是RsPhm酶催化的底物，說明基因起到降解兒茶酚的作用。實(shí)驗(yàn)室前期發(fā)現(xiàn)兒茶酚和硫脲等抗氧化劑顯著減少了菌核質(zhì)量和數(shù)量[22]。兒茶酚作為菌絲和菌核黑色素形成的前體合成物質(zhì)，促進(jìn)黑色素的合成，從而使細(xì)胞壁和細(xì)胞膜黑化和加厚[14]。這些結(jié)果說明基因在水稻紋枯病菌菌核發(fā)育和黑色素形成中起到重要作用。

黑色素的合成和形成過程十分復(fù)雜。近年對(duì)生物體內(nèi)黑色素合成途徑的研究明確了黑色素起源于4種不同的中間產(chǎn)物：γ-谷氨酰胺酰-3，4-對(duì)苯二酚(γ-glutaminyl-3, 4-dihydroxybenzene, GDBH)、多巴(DOPA)、1，8-二羥基萘(DHN)和兒茶酚[23]。核盤菌()能夠不斷產(chǎn)生DHN黑色素，當(dāng)共同培養(yǎng)核盤菌與白腐菌()時(shí)，白腐菌釋放的黑色素降解酶能使核盤菌的黑色素層降解，從而使失去保護(hù)層的核盤菌遭受其他溶菌酶的降解，原因是核盤菌黑色素層的存在能幫助其抵御-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶的降解[24]。白腐菌產(chǎn)生木質(zhì)素降解酶，通過過氧化酶代謝途徑可降解黑酵母()黑色素[25]。人類致病真菌新生隱球菌()合成黑色素與毒力密切相關(guān)，可以控制黑色素的合成從而降低致病力[26, 27]。立枯絲核菌不同融合群菌絲細(xì)胞壁黑色素含量與微生物裂解的敏感性或抗性之間存在相關(guān)性，同時(shí)也跟致病力密切相關(guān)[28, 29]。

本研究結(jié)果表明，添加外源兒茶酚可以提高基因的表達(dá)量，說明水稻紋枯病菌在兒茶酚脅迫下被誘導(dǎo)表達(dá)，但不同的兒茶酚濃度誘導(dǎo)表達(dá)量上調(diào)倍數(shù)不同。因此，水稻紋枯病菌苯酚2-單加氧酶基因表達(dá)水平與黑色素形成和菌核發(fā)育關(guān)系密切。對(duì)RsPhm蛋白氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，立枯絲核菌不同的融合群菌株獨(dú)立進(jìn)化為一支，說明不同的融合群的菌株具有較近的親緣關(guān)系，而與離心射脈革菌、多葉奇果菌、白腐菌、白環(huán)菇、真姬菇的氨基酸同源性較低，親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近和本身的分類學(xué)地位及傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類結(jié)果一致。因此，不同種屬真菌之間基因在進(jìn)化上具有一定的保守性。該結(jié)果為進(jìn)一步深入研究水稻紋枯病菌黑色素形成和菌核發(fā)育機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

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Cloning and Expression Analysis ofGene inAG-1ⅠA of Rice Sheath Blight Pathogen

JIANG Shaofeng, WANG Chenjiaozi, SHU Canwei, ZHOU Erxun*

(Guangdong Province Key Laboratory of Microbial Signals and Disease Control/College of Agriculture, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China;)

【Objective】In order to elucidate the functions of phenol 2-monooxygenase()gene in melanization ofKühn AG-1ⅠA, the causal agent of rice sheath blight,【Method】the gene was cloned by routine PCR andRT-PCR techniques, and the bioinformatics analysis of this gene was conducted; furthermore, therelative expression levelunder catecholstresswas determinedby using fluorescence quantitative real-time PCR (qRT-PCR) technique.【Result】Bioinformatics analysis showed that the full-lengthDNA and cDNA sequences ofgene were 2628 bp and 1983 bp, respectively, which encode660 amino acids. The phylogenetic tree analysis showed thatgene hada close relationship in different anastomosis groups (AGs) of, and a certain evolutionary conservation among different fungal species. Results of qRT-PCR indicated that the exposure to exogenous catecholcould improvethe expression level ofgene, and which peaked at 12.5 μg/mL of catechol,with a significant increase of 35.7 times, 19.1times and 28.4 timesup-regulated at 25 μg/mL and 50 g/mL, respectively, but only 2.1 times up-regulated at 100 g/mL.【Conclusion】The full-length sequence ofgene was obtained, its basic biological information was understood, and its expression pattern under catechol stress was clarified.Thesefindings will lay a basis for the scientific and systematic elucidation of regulatorymechanism of melanin formation bygene ofAG-1ⅠA.

Kühn AG-1ⅠA;gene; gene clone; expression analysis

Corresponding author, E-mail: exzhou@scau.edu.cn

Q785; S435.111.4+2

A

1001-7216(2018)02-0111-08

2017-08-10；

2017-08-25。

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31271994, 31470247)。

通訊聯(lián)系人, E-mail: exzhou@scau.edu.cn

10.16819/j.1001-7216.2018.7094