張麗麗，張　冀，張富春

(新疆大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆生物資源基因工程重點實驗室，烏魯木齊 830046)

鹽穗木(Halostachyscaspica)隸屬藜科(Chenopodiaceae)鹽穗木屬，廣泛分布于新疆干旱荒漠鹽堿地，耐鹽能力強(qiáng)，可在野外含鹽量高達(dá)27%的重度鹽漬化環(huán)境中生長，并且形成優(yōu)勢群落[1-2]。因此選取鹽穗木作為耐鹽堿基因挖掘及相關(guān)功能驗證的理想材料，對于抗逆研究具有重要意義。

隨著基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)的快速發(fā)展，許多鹽脅迫相關(guān)蛋白質(zhì)、轉(zhuǎn)錄因子、激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和脅迫響應(yīng)通路相關(guān)基因相繼被發(fā)現(xiàn)，其中有一部分基序和結(jié)構(gòu)域未知，且功能模糊的蛋白質(zhì)(POFs)，它們在非生物脅迫時呈現(xiàn)了高表達(dá)，并且過表達(dá)該蛋白的植物都獲得了更強(qiáng)的非生物脅迫耐受性[3-5]。本實驗室在前期研究中發(fā)現(xiàn)，在600 mmol/L NaCl 處理條件下，采用RACE技術(shù)從鹽穗木中擴(kuò)增獲得了1個功能未知多肽基因HcUKPP，并隨著脅迫處理時間的增加，該基因表達(dá)顯著升高，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其定位于細(xì)胞質(zhì)膜上，為細(xì)胞質(zhì)膜相關(guān)蛋白(plasma membrane protein, PMP)，猜測它可能參與調(diào)節(jié)細(xì)胞膜通透性和維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)而增強(qiáng)鹽脅迫耐受性[6-7]。當(dāng)鹽敏感型植物長期暴露在高鹽環(huán)境中時，不利因素所誘發(fā)的氧化脅迫和離子損傷會導(dǎo)致質(zhì)膜過氧化并破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，進(jìn)而改變細(xì)胞的滲透勢，對植物造成不可逆的傷害。研究表明，當(dāng)耐鹽植物暴露于鹽環(huán)境中時，會激活維持膜組分和離子穩(wěn)態(tài)的信號通路以及相應(yīng)基因，并通過穩(wěn)定細(xì)胞結(jié)構(gòu)、抗脂質(zhì)過氧化和維持細(xì)胞滲透勢等方式增強(qiáng)植物對鹽脅迫的耐受性[8-11]。

本研究通過構(gòu)建原核表達(dá)載體pET30a-HcUKPP，并轉(zhuǎn)化EscherichiacoliBL21(DE3)表達(dá)菌株，利用IPTG誘導(dǎo)重組菌株過表達(dá)HcUKPP蛋白質(zhì)，然后用不同濃度NaCl(100、300、500、700和900 mmol/L)、PEG 6000(2.5%、5%、10%、15%和20%)和甲基紫精(25、50、75、100、150和200 μmol/L)分別模擬鹽、干旱和氧化脅迫，初步證明HcUKPP蛋白對宿主菌大腸桿菌應(yīng)對非生物脅迫的顯著促進(jìn)作用，為研究HcUKPP應(yīng)對非生物脅迫的功能機(jī)理以及抗逆經(jīng)濟(jì)作物的培育奠定基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1　試驗材料

鹽穗木種子采自新疆五家渠103團(tuán)(E87.31°，N44.29°)，并種植于本實驗室植物培養(yǎng)室。載體質(zhì)粒pET30a為本實驗室保存。

1.2　方　法

1.2.1HcUKPP基因的克隆和原核表達(dá)載體的構(gòu)建取適量鹽穗木同化枝，利用植物總RNA提取試劑盒(OMEGA公司)提取總RNA，參照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模版，再以上游引物P1(5′-CCGGAATTCTATTATATGCGTACTAGGTGGCT -3′，EcoR Ⅰ和下游引物P2(5′-CCCAAGCTTTACCATATGGCTCTTACTCA-3′，HindⅢ)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)程序為95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR產(chǎn)物回收之后連接至pEASY-T5載體(全式金公司)，將測序正確的重組克隆載體pEASY-T5-HcUKPP和pET30a載體同時用EcoRⅠ和HindⅢ (TaKaRa公司)雙酶切，用膠回收和PCR產(chǎn)物回收試劑盒(OMEGA公司)分別回收目的基因和載體后，用SolutionⅠ快速連接酶(TaKaRa公司)16 ℃連接4 h，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至EscherichiacoliDH5(全式金公司)中，經(jīng) PCR和雙酶切鑒定正確后，轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株E.coliBL21(全式金公司)中，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定。

1.2.2融合蛋白His-HcUKPP的誘導(dǎo)表達(dá)及特異性分析將陽性菌接種于含有50 μg/mL卡那霉素的新鮮 LB培養(yǎng)基中，于37 ℃、220 r/min過夜培養(yǎng)，次日，再按1/100接種于7個含有50 μg/mL卡那霉素的6 mL新鮮 LB培養(yǎng)基中，在37 ℃、220 r/min條件下振蕩培養(yǎng)4 h，待OD600達(dá)到0.6～0.8之后，取1 mL作為誘前，剩余5 mL在不同濃度IPTG(0.1、0.4、0.7、1.0、1.3、1.5和2.0 mmol/L)，37 ℃、220 r/min條件下誘導(dǎo)4 h。離心收集菌體，用PBS緩沖液洗滌菌體3次后，每毫升菌用80 μL PBS緩沖液重懸，并加入20 μL 5×蛋白loading，沸水浴處理15 min，冰浴10 min，10 000 r/min離心10 min。

將處理好的樣品用SDS-PAGE分離后，電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，用5%脫脂奶粉37 ℃封閉2 h后，轉(zhuǎn)入含有5%脫脂奶粉稀釋的抗His一抗中，低速搖床上結(jié)合2 h，TBS-T洗膜3次，每次10 min，再轉(zhuǎn)入2%脫脂奶粉稀釋的抗HRP-標(biāo)記的羊抗鼠二抗中，低速搖床上結(jié)合1 h，TBS-T洗膜3次，每次10 min，最后用DAB顯色至目的條帶清晰。

1.2.3重組菌非生物脅迫耐受性檢測重組菌的非生物脅迫耐受性檢測參照Narayan和程剛等的方法并進(jìn)行適當(dāng)修改[12-13]。將重組菌E.coliBL21∷pET30a-HcUKPP和對照菌E.coliBL21∷pET30a同時進(jìn)行震蕩培養(yǎng)后，為了減輕IPTG對菌體的傷害，用0.1 mmol /L IPTG誘導(dǎo)4 h后將菌液調(diào)整至濃度一致，分別接種于含有100、300、500、700和900 mmol/L NaCl，2.5%、5%、10%、15%和20% PEG6000和25、50、75、100、150和200 μmol/L 甲基紫精的新鮮LB培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)，每2 h檢測1次，讀取OD600，持續(xù)檢測12 h。

1.2.4統(tǒng)計學(xué)分析實驗數(shù)據(jù)的作圖和分析采用GraphPad Prism 7。

2　結(jié)果與分析

2.1　HcUKPP的克隆

以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模版，P1和P2為引物，利用RT-PCR擴(kuò)增獲得了HcUKPP基因，1.5%瓊脂糖凝膠對目的基因進(jìn)行檢測。結(jié)果(圖1)表明，獲得HcUKPP基因開發(fā)閱讀框243 bp，大小與預(yù)期值相符，且測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫的序列比對完全一致。

2.2　pET30a-HcUKPP原核表達(dá)載體的構(gòu)建

將HcUKPP基因與pET30a連接后，轉(zhuǎn)化E.coliBL21，得到重組菌。用工具酶EcoRⅠ和HindⅢ 對構(gòu)建的重組原核表達(dá)載體pET30a-HcUKPP進(jìn)行雙酶切后，用1%瓊脂糖凝膠對酶切產(chǎn)物進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，pET30a-HcUKPP經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ 酶切后出現(xiàn)了2條條帶，1條為5 000 bp左右的載體片段，1條為250 bp左右的目的片段，而未經(jīng)雙酶切的pET30a-HcUKPP僅出現(xiàn)了1條條帶(圖2)。該結(jié)果表明，已成功獲得E.coliBL21::pET30a-HcUKPP原核表達(dá)載體，可用于后續(xù)蛋白表達(dá)。

1. DL500；2～12. HcUKPP基因；13. 陰性對照圖1　HcUKPP基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果1. DL500; 2-12. HcUKPP gene; 13. Negative controlFig.1　Amplification of HcUKPP gene with PCR

2.3　重組蛋白His-HcUKPP的誘導(dǎo)表達(dá)和特異性檢測

重組菌E.coliBL21::pET30a-HcUKPP經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化之后，確定在37 ℃、4 h ，0.1、0.4、0.7、1.0、1.3、1.5和2.0 mmol/L IPTG條件下均可誘導(dǎo)表達(dá)蛋白，且表達(dá)量差異不顯著。 SDS-PAGE結(jié)果顯示，與誘導(dǎo)前相比，誘導(dǎo)后出現(xiàn)了1條約為15 kDa目的條帶(圖3，A)，Western Blot結(jié)果表明該條帶為特異性的His-HcUKPP(圖3，B)。

2.4　重組菌非生物脅迫下生長曲線的測定

通過測定重組菌E.coliBL21∷pET30a-HcUKPP在NaCl、PEG 6000以及甲基紫精等非生物脅迫的OD600，來檢測其生長狀況(圖4，A～C)。結(jié)果顯示，在上述3種非生物脅迫下，重組菌都表現(xiàn)出了優(yōu)于對照菌的趨勢；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在500 mmol/L NaCl、10% PEG 6000和75 μmol/L甲基紫精脅迫12 h之后，重組菌的生長優(yōu)勢最為顯著，OD600分別是對照菌的1.81、1.47和3.48倍(圖4，D～G)。以上結(jié)果表明，HcUKPP的表達(dá)能提高宿主菌對非生物脅迫的耐受性。

1. DL5000；2～3. 重組質(zhì)粒pET30a-HcUKPP經(jīng)EcoRⅠ和Hind Ⅲ 雙酶切；4. 重組質(zhì)粒pET30a-HcUKPP圖2　重組質(zhì)粒pET30a-HcUKPP的雙酶切鑒定1. DL5000; 2-3. Recombinant plasmid pET30a-HcUKPP digested by EcoRⅠand Hind Ⅲ; 4. Recombinant plasmid pET30a-HcUKPPFig.2　Identification of recombinant plasmid pET30a-HcUKPP with double-enzyme digestion

A.SDS-PAGE 分析pET30a-HcUKPP融合蛋白；B. His-HcUKPP融合蛋白的Western blot鑒定；1. 蛋白Marker; 2. E.coli BL21∷pET30a-HcUKPP誘導(dǎo)前; 3. 0.1 mmol/L IPTG; 4. 0.4 mmol/L IPTG; 5. 0.7 mmol/L IPTG; 6. 1.0 mmol/L IPTG; 7. 1.3 mmol/L IPTG; 8. 1.5 mmol/L IPTG; 9. 2.0 mmol/L IPTG圖3　His-HcUKPP重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及特異性分析A. Expression analysis of recombinant His-HcUKPP protein; B. Identification of recombinant His-HcUKPP protein by Western Blot；1. Protein standard marker; 2. Un-induced E.coli BL21∷pET30a-HcUKPP; 3. 0.1 mmol/L IPTG; 4. 0.4 mmol/L IPTG; 5. 0.7 mmol/L IPTG; 6. 1.0 mmol/L IPTG; 7. 1.3 mmol/L IPTG; 8. 1.5 mmol/L IPTG; 9. 2.0 mmol/L IPTGFig.3　Identification and expression analysis of recombinant His-HcUKPP protein

*. P < 0.05；**. P < 0.01；***. P < 0.001A～C. 非生物脅迫12 h后菌體生長的檢測; D～G. E.coli BL21∷pET30a-HcUKPP在不同非生物脅迫下的生長檢測圖4　重組菌E.coli BL21∷pET30a-HcUKPP在不同非生物脅迫下生長曲線A-C. Strains growth under various abiotic stresses for 12 h; D-G. Growth of the recombinant E.coli BL21∷pET30a-HcUKPP under different abiotic stressesFig.4　Growth curve of recombinant strain E.coli BL21∷pET30a-HcUKPP under different abiotic stresses

3　討　論

近年來，由于基因組和轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的快速推廣，在真核生物基因組內(nèi)發(fā)現(xiàn)了大量功能未知基因。研究表明，平均每個物種中就有15%～40%的基因功能是未知的[14]。其中在對包括裂殖酵母、小鼠和擬南芥等10種真核生物蛋白組進(jìn)行Blast比對分析時發(fā)現(xiàn)，有18%～38%(平均26%)的蛋白質(zhì)功能是未知的，并且在對不同真核生物蛋白質(zhì)組中功能已知蛋白(PDFs)和功能未知蛋白(POFs)進(jìn)行多樣性分析時發(fā)現(xiàn)，POFs的物種差異性要顯著高于PDFs[15]。在針對紫花苜蓿共生根瘤菌的研究過程中，發(fā)現(xiàn)了一個非常重要且高度保守的未知功能蛋白SMc01113家族，通過基因工程的方法對該基因進(jìn)行改造突變并接種至植物后，極顯著增加了根瘤菌的數(shù)量，促進(jìn)了根瘤的生長，從而使植物固氮能力顯著提高，且接種SMc01113開放閱讀框中一段基因的突變體植株SMc01113∷mTn5(284～507 bp)在應(yīng)對多種環(huán)境脅迫時，都表現(xiàn)出了顯著優(yōu)勢[16]。將23個POFs在擬南芥中過表達(dá)，結(jié)果顯示，高達(dá)70%轉(zhuǎn)基因擬南芥都顯示出了對氧化脅迫的耐受性[17]。因此，探討植物POFs的功能在研究植物抗逆領(lǐng)域具有重要作用。

本實驗室前期在鹽穗木轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)了1個定位于細(xì)胞質(zhì)膜上的鹽響應(yīng)未知功能基因HcUKPP，表達(dá)特性分析表明，其在600 mmol/L NaCl處理條件下，隨著脅迫時間的延長呈現(xiàn)出上調(diào)趨勢。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在N 端信號肽區(qū)與C 末端分別含有一個跨膜區(qū)，并且擁有1個Thr和1個的Tys的蛋白激酶磷酸化位點[6-7]。其可能在響應(yīng)鹽等非生物脅迫時通過充當(dāng)膜受體或者通過磷酸化修飾調(diào)控等方式參與脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達(dá)和合成代謝等途徑調(diào)控植物的耐受性[18-19]。到目前為止，還沒有任何關(guān)于HcUKPP基因在生物和非生物脅迫中潛在功能的研究。因此開展鹽穗木未知多肽基因HcUKPP后續(xù)的功能驗證研究對于理解其潛在功能和可能參與脅迫響應(yīng)的反應(yīng)機(jī)制具有重要作用。

本研究通過構(gòu)建重組原核表達(dá)載體pET30a-HcUKPP，并以E.coliBL21為宿主菌，研究了重組菌株在不同濃度NaCl、PEG 6000和甲基紫精脅迫下的耐受性。結(jié)果表明，在不同濃度NaCl、PEG 6000和甲基紫精脅迫下，重組菌都顯示出強(qiáng)于對照菌的生長優(yōu)勢，尤其在500 mmol/L NaCl、10% PEG 6000和75 μmol/L甲基紫精脅迫12 h之后，重組菌株的優(yōu)勢最為顯著。值得注意的是，在500、700和900 mmol/L 高濃度NaCl處理12 h之后，重組菌株都表現(xiàn)出了不同程度的鹽耐受性，該結(jié)果表明HcUKPP可能在維持滲透平衡等方面發(fā)揮重要作用[20]。此外，相比于鹽脅迫，75 μmol/L甲基紫精脅迫12 h之后，重組菌株的生長極顯著優(yōu)于對照菌株。可能是在高濃度的甲基紫精脅迫下，產(chǎn)生的大量活性氧使得細(xì)胞質(zhì)膜蛋白發(fā)生過度氧化，導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞而失去功能，從而使細(xì)胞內(nèi)環(huán)境失衡、抗逆信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑終止，最終導(dǎo)致對照菌體生長受限，并發(fā)生死亡[21]。而重組菌由于過表達(dá)了HcUKPP蛋白，阻止了質(zhì)膜蛋白的過度氧化，維持了細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，在保證細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的情況下，高效地傳遞了抗逆信號，從而合成了抗氧化物質(zhì)，維持了活性氧的平衡，從而使得重組菌株獲得了氧化脅迫耐受性。

本研究對鹽穗木未知功能多肽HcUKPP進(jìn)行了原核表達(dá)，且E.coliBL21∷pET30a-HcUKPP重組菌抗非生物脅迫的能力顯著提高。研究結(jié)果為深入探索鹽穗木HcUKPP潛在的生理功能提供了基礎(chǔ)。

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