高國(guó)日，張　彤，陳道國(guó)，何彩云,2*

(1 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所 國(guó)家林業(yè)局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100091；2 南京林業(yè)大學(xué)南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 210037)

沙棘(Hippophaerhamnoides)是一種多用途、耐寒和耐旱的落葉灌木植物，也是一種理想的防治水土流失的樹(shù)種，能夠有效改良荒漠化土地，增加野生動(dòng)物棲息地和保護(hù)農(nóng)莊等[1]。沙棘的果肉可以被制成沙棘汁，是一種具有很高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的飲料，含有豐富的維生素C～E和胡蘿卜素等生物活性成分。沙棘油提取于沙棘的種子，富含不飽和脂肪酸[2]。沙棘果實(shí)中豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)能夠調(diào)節(jié)人體免疫力、保護(hù)肝臟、抗輻射、預(yù)防動(dòng)脈硬化、抗腫瘤以及促進(jìn)組織再生等。因其生態(tài)價(jià)值、藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，沙棘被認(rèn)為是一種重要的植物[3]。近年來(lái)，對(duì)沙棘分子生物學(xué)的研究，不僅獲得了可用于沙棘基因組分析、分子繁殖和群體遺傳分析的大量簡(jiǎn)單重復(fù)序列(SSR)[4]及表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)[5]，還獲得了響應(yīng)冷凍[6-7]和干旱脅迫[8]的大量基因和蛋白質(zhì)表達(dá)[9]信息，確定了其在響應(yīng)低溫和干旱中的生物學(xué)功能，在沙棘發(fā)育不同時(shí)期代謝組和蛋白組聯(lián)合分析中，深入了解了沙棘果實(shí)獨(dú)特營(yíng)養(yǎng)成分形成機(jī)理[10-11]。雖然不同沙棘果色的lncRNA研究[12]為研究表觀遺傳對(duì)沙棘基因的表達(dá)調(diào)控提供了思路，但是表觀遺傳學(xué)中組蛋白修飾因其修飾類型和位點(diǎn)的復(fù)雜性，對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控同樣具有重要的作用[13]。許多研究已經(jīng)表明組蛋白乙?；揎棌V泛參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程[14]及應(yīng)對(duì)外界環(huán)境變化[15]。染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)(ChIP)是研究生物體內(nèi)蛋白質(zhì)與DNA相互作用的有效方法，通常用于組蛋白修飾類型和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的研究，與二代測(cè)序相結(jié)合的ChIP-seq技術(shù)，能夠高效準(zhǔn)確的在全基因組范圍內(nèi)檢測(cè)組蛋白修飾與轉(zhuǎn)錄因子所調(diào)控的DNA區(qū)域[16-17]。當(dāng)前對(duì)擬南芥、水稻等組蛋白修飾和轉(zhuǎn)錄因子所調(diào)控的基因進(jìn)行了大量的研究，其中組蛋白H3K9ac修飾在植物逆境脅迫及生長(zhǎng)周期中，具有重要的作用[18]。并且由于組蛋白的保守性和調(diào)控基因的廣泛性，非常適合推廣至其他物種的表觀遺傳研究，2014年Li等[19]優(yōu)化了研究毛果楊表觀遺傳的試驗(yàn)過(guò)程，闡明了木質(zhì)部形成與組蛋白修飾的關(guān)系。

雖然研究沙棘組蛋白修飾對(duì)沙棘基因的表達(dá)調(diào)控方式，能夠闡明沙棘在生長(zhǎng)周期和逆境脅迫下基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制[20]，但是使用商業(yè)抗體研究沙棘組蛋白修飾尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)驗(yàn)證H3K9ac抗體與沙棘組蛋白的結(jié)合能力，并使用抗體進(jìn)行后續(xù)的ChIP試驗(yàn)。對(duì)富集到的沙棘DNA片段進(jìn)行高通量測(cè)序，從而繪制沙棘H3K9乙酰化修飾圖譜并鑒定出沙棘H3K9乙酰化修飾調(diào)控基因，為后續(xù)研究組蛋白修飾對(duì)沙棘基因表達(dá)的調(diào)控方式奠定基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1　試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)使用的材料為中國(guó)沙棘(Hippophaerhamnoidessubsp.sinensis)，采自中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院科研溫室大棚，生長(zhǎng)條件為自然光照，晝/夜溫度為20～30 ℃/10～15 ℃，相對(duì)濕度在60%～70%。所使用的H3K9ac(ab10812)抗體購(gòu)買于美國(guó)Abcam公司。

1.2　試驗(yàn)方法

1.2.1染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)DNA片段富集和蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)取沙棘葉片2 g，剪碎并浸沒(méi)在甲醛交聯(lián)緩沖液中，抽真空處理。加入甘氨酸后，終止交聯(lián)，取出樣品，洗滌并吸干表明水分。液氮研磨至粉末狀，多次抽提、過(guò)濾去除雜質(zhì)，最終重新懸浮。預(yù)留出部分樣品后，加入核酸裂解緩沖液，置冰上裂解。對(duì)交聯(lián)成的DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物超聲波片段化。取一部分進(jìn)行Western blot試驗(yàn)，具體步驟為：配制分離膠和濃縮膠，加樣前將梳子拔出，每個(gè)點(diǎn)樣孔上樣不超過(guò)7.5 μL。濃縮膠在80 V，分離膠在160 V下電泳，在電泳過(guò)程中裁剪PVDF膜并進(jìn)行處理。電泳結(jié)束，撬去玻璃板，將濃縮膠輕輕刮去，將分離膠卸下。將分離膠鋪在電轉(zhuǎn)架上，再鋪上浸好的PVDF膜，裝好板，加入電轉(zhuǎn)液和冰塊，100 V轉(zhuǎn)膜80 min。電轉(zhuǎn)后的膜用1×TBST漂洗5 min，置于封閉液中，4 ℃過(guò)夜。分別加入一抗(H3K9ac)，用封閉液稀釋，室溫震蕩混勻2 h。1×TBST洗膜4×5 min，孵二抗(HRP-羊抗兔)，室溫?fù)u床孵育2 h。用1×TBST洗膜3×10 min，用吸紙吸去多余水分，將ELC顯色反應(yīng)液加在膜上，使反應(yīng)液分布均勻后，吸去邊緣多余反應(yīng)液，放到顯色器中，觀察顯色效果并拍照保存。

取另一部分進(jìn)行解交聯(lián)純化及瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。加入目的蛋白抗體，形成抗體-組蛋白-DNA復(fù)合物，利用Protein A beads沉淀該復(fù)合物，特異性富集與目的組蛋白結(jié)合的DNA片段，多次洗滌，去除非特異性DNA片段，純化復(fù)合體，解交聯(lián)，利用DNA純化試劑盒純化DNA片段[21,22]。用Qubit檢測(cè)DNA片段的濃度，并保存于-80 ℃。

1.2.2高通量測(cè)序及數(shù)據(jù)分析將ChIP試驗(yàn)所得DNA片段利用Ovation Ultralow Library kit (NuGEN, Part No. 0330) 建立ChIP文庫(kù)，然后使用HiSeq 2000(Illumina)對(duì)DNA片段進(jìn)行測(cè)序。通過(guò)trim方式對(duì)原始數(shù)據(jù)的質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)，去掉低質(zhì)量的數(shù)據(jù)，獲得clean reads 用于后續(xù)分析。利用Burrows Wheeler Aligner(BWA) 將樣本的clean reads 匹配到參考基因組上以及進(jìn)行定位質(zhì)量分析和mapping效率的分析。將mapping后唯一匹配的unique reads 通過(guò)MACS2(q-value≤0.05)[23]完成峰檢分析，預(yù)測(cè)富集區(qū)域的峰即為組蛋白修飾的區(qū)域。然后與基因組上基因的位置進(jìn)行重疊分析，包含有峰的基因就確定為該基因具有組蛋白修飾。通過(guò)GOseq R數(shù)據(jù)包和KOBAS軟件對(duì)基因進(jìn)行GO功能分析和KEGG通路分析。

2　結(jié)果和分析

2.1　DNA片段化、H3K9ac抗體與復(fù)合物的結(jié)合特性以及片段富集

將交聯(lián)后的DNA片段化，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，3個(gè)沙棘片段化DNA與片段化前各樣本主帶明顯，片段化DNA明顯分布于100～500 bp之間，效果較好，可進(jìn)行下一步純化、富集實(shí)驗(yàn)。經(jīng)Western blot檢測(cè)， H3K9ac抗體與復(fù)合物的結(jié)合特性如圖2所示，該抗體與復(fù)合物結(jié)合能力較強(qiáng)，在15～17kDa處有明顯的陽(yáng)性條帶出現(xiàn)。用H3K9ac抗體對(duì)沙棘片段化DNA進(jìn)行富集，解交聯(lián)，最終獲得的DNA濃度為0.845 ng/μL，是陽(yáng)性對(duì)照input DNA濃度的13.63%(表1)。陰性對(duì)照IgG富集的DNA濃度太低，沒(méi)有檢測(cè)到數(shù)值(表1)。

2.2　沙棘H3K9ac修飾的全基因組分析

2.2.1ChIP-seq測(cè)序數(shù)據(jù)及基因組分布將構(gòu)建的IP和Input文庫(kù)進(jìn)行高通量測(cè)序，最終分別得到6G和10G的數(shù)據(jù)量，分別包含約2.2×107條和3.6×107條原始序列(圖3)。將原始序列經(jīng)過(guò)質(zhì)量檢測(cè)去除低質(zhì)量序列后得到分析序列，其中分析序列占原始序列的99%以上。將分析序列與自測(cè)沙棘參考基因組進(jìn)行比對(duì)，2個(gè)樣本分析序列定位到基因組上序列的百分比均在35%以上。唯一定位的測(cè)序序列占定位到基因組上序列的80%左右。對(duì)唯一比對(duì)序列比對(duì)到基因組的各條染色體上的密度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如圖4所示，序列在各條染色體上均有分布，并且在染色體上的不同區(qū)域富集程度不同。序列相對(duì)于基因位置分布表明序列在結(jié)構(gòu)基因中的分布要高于基因上下游部分，并且在結(jié)構(gòu)基因中的兩端具有明顯的富集(圖5)。

M. DNA分子標(biāo)量；CK-1、CK-2、CK-3.3個(gè)生物學(xué)重復(fù)圖1　沙棘DNA片段化結(jié)果M.DNA Marker；CK-1，CK-2,CK-3.Three biological repeats Fig.1　The results of DNA fragment of H. rhamnoides

圖2　H3K9ac與復(fù)合物結(jié)合特性Fig.2　The binding specificity of histone with H3K9ac antibody

樣品名稱Samplename試驗(yàn)用量Dosage/μL濃度Content/(ng/μL)溶解體積Volume/μLInputCK206.2012IPCK-1(H3K9ac)200.8914IPCK-2(H3K9ac)200.8014IPCK-3(IgG)20low13

圖3　測(cè)序數(shù)據(jù)及與參考基因組序列的比對(duì)統(tǒng)計(jì)Fig.3　The statistics of sequencing data and mapping with reference genome

2.2.2富集區(qū)域峰的預(yù)測(cè)及基因注釋對(duì)mapping到參考基因組上的unique reads的富集區(qū)進(jìn)行峰(peak)的預(yù)測(cè)，每個(gè)peak代表一個(gè)H3K9ac的修飾位點(diǎn)。共預(yù)測(cè)出1 011個(gè)peak，長(zhǎng)度為147 bp，peak中所包含的reads的個(gè)數(shù)占所有比對(duì)上的reads的20.83%。Peak在染色體上的分布如圖6所示。從圖6可以看出，H3K9ac修飾位點(diǎn)在不同染色體上均勻分布。對(duì)修飾基因進(jìn)行GO功能注釋，包含基因數(shù)最多的前30類結(jié)果如圖7所示，H3K9ac修飾可以調(diào)控的基因功能包括了生物學(xué)過(guò)程(17類)、分子功能(5類)和細(xì)胞組成(8類)，其中，在生物學(xué)過(guò)程分類中，包含基因數(shù)最多的是細(xì)胞生理過(guò)程和細(xì)胞生長(zhǎng)中代謝過(guò)程，在細(xì)胞組成中，膜質(zhì)和細(xì)胞分類中擁有的基因數(shù)最多，分子功能中結(jié)合作用占有最大比例。KEGG通路分析結(jié)果表明，基因在50個(gè)代謝通路中得到注釋，包含基因數(shù)最多的主要有：代謝途徑、氧化磷酸化和次級(jí)代謝物的合成。這些過(guò)程為研究H3K9ac修飾所調(diào)控基因的功能提供了新的信息。

圖4　IP的reads在基因組上的分布Fig.4　The distribution of reads of IP in genome

圖5　IP的reads相對(duì)基因位置的分布Fig.5　The distribution of reads of IP in relative genetic location

圖6　Peak在染色體上的分布Fig.6　The distribution of peak on chromosome

1.細(xì)胞過(guò)程；2.代謝過(guò)程；3.有機(jī)物代謝過(guò)程；4.初級(jí)代謝過(guò)程；5.單個(gè)組織過(guò)程；6.細(xì)胞代謝過(guò)程；7.單個(gè)組織細(xì)胞過(guò)程；8.高分子代謝過(guò)程；9.細(xì)胞高分子代謝過(guò)程；10.氮化合物代謝過(guò)程；11.細(xì)胞氮化合物代謝過(guò)程；12.單生物代謝過(guò)程；13.生物合成過(guò)程；14.雜環(huán)代謝過(guò)程；15.細(xì)胞生物合成過(guò)程；16.有機(jī)環(huán)狀化合物合成代謝過(guò)程；17.有機(jī)物生物合成過(guò)程；18.細(xì)胞膜；19.細(xì)胞；20.細(xì)胞部分；21.胞內(nèi)部分；22.胞內(nèi)；23.結(jié)合；24.催化活性；25.有機(jī)環(huán)狀化合物結(jié)合；26.雜環(huán)化合物結(jié)合；27.離子結(jié)合；28.蛋白結(jié)合；29.核酸結(jié)合；30.水解酶活性圖7　GO功能富集分布圖1.Cellular process；2.Metabolic process；3.Organic substance metabolic process；4.Primary metabolic process；5.Single-organism process；6.Cellular metabolic process；7.Single-organism cellular process；8.Macromolecule metabolic process；9.Cellular macromolecule metabolic process；10.Nitrogen compound metabolic process；11.Cellular nitrogen compound metabolic process；12.Single-organism metabolic process；13.Biosynthetic process；14.Heterocycle metabolic process；15.Cellular biosynthetic process；16.Organic cyclic compound metabolic process；17.Organic substance biosynthetic process；18.Membrane；19.Cell；20.Cell part；21.Intracellular part；22.Intracellular；23.Binding；24.Catalytic activity；25.Organic cyclic compound binding；26.Heterocyclic compound binding；27.Ion binding；28.Protein binding；29.Nucleic acid binding；30.Hydrolase activityFig.7　The distribution of GO function

通路名稱Pathwayname基因數(shù)Genenumber通路名稱Pathwayname基因數(shù)Genenumber新陳代謝通路Metabolicpathways23核黃素代謝Riboflavinmetabolism1氧化磷酸化Oxidativephosphorylation9丁酸甲酯代謝Butanoatemetabolism1次生代謝物合成Biosynthesisofsecondarymetabo-lites9?；撬岷蛠喤；撬岽xTaurineandhypotaurinemetabolism 1RNA轉(zhuǎn)運(yùn)RNAtransport4錯(cuò)配修復(fù)Mismatchrepair1淀粉和蔗糖代謝Starchandsucrosemetabolism4玉米素合成Zeatinbiosynthesis1果糖和甘露糖代謝Fructoseandmannosemetabo-lism3纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成Valine,leu-cineandisoleucinebiosynthesis1核苷酸切除修復(fù)Nucleotideexcisionrepair3丙胺酸代謝beta-Alaninemetabolism1丙酮酸代謝Pyruvatemetabolism3維生素C代謝Ascorbateandaldaratemetabolism1糖酵解/糖異生途徑Glycolysis/Gluconeogenesis3堿基切除修復(fù)Baseexcisionrepair1氨基糖和核苷酸糖代謝Aminosugarandnucleo-tidesugarmetabolism3丙三酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝Alanine,aspartateandglutamatemetabolism1胞吞作用Endocytosis3DNA復(fù)制DNAreplication1內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工Proteinprocessinginendoplasmicreticulum 3二羧酸代謝Glyoxylateanddicarboxylatemetabo-lism1碳代謝Carbonmetabolism3蛋白質(zhì)運(yùn)輸Proteinexport1磷酸戊糖途徑Pentosephosphatepathway2甘油酯代謝Glycerolipidmetabolism1半乳糖代謝Galactosemetabolism2核糖體Ribosome1同源重組Homologousrecombination22-氧代羧酸代謝2-Oxocarboxylicacidmetabolism1蛋白酶體Proteasome2精氨酸和脯氨酸代謝Arginineandprolinemetabo-lism1光和生物的碳固定Carbonfixationinphotosyn-theticorganisms2戊糖和葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)換Pentoseandglucuronateinterconversions 1光合作用Photosynthesis2半胱氨酸和甲硫氨酸代謝Cysteineandmethioninemetabolism 1谷胱甘肽代謝Glutathionemetabolism2植物病原菌互作Plant-pathogeninteraction1RNA降解RNAdegradation2嘧啶代謝Pyrimidinemetabolism1mRNA監(jiān)測(cè)途徑mRNAsurveillancepathway2嘌呤代謝Purinemetabolism1泛素介導(dǎo)的蛋白水解作用Ubiquitinmediatedpro-teolysis2真核細(xì)胞核小體合成Ribosomebiogenesisineu-karyotes1氨基酸生物合成Biosynthesisofaminoacids2剪接體Spliceosome1植物信號(hào)激素轉(zhuǎn)導(dǎo)Planthormonesignaltransduc-tion2甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝Glycine,serineandthreoninemetabolism1

3　討　論

動(dòng)植物在不同的進(jìn)化中，組蛋白的氨基酸序列非常保守，即使存在較遠(yuǎn)親緣關(guān)系，4種組蛋白(H2A、H2B、H3和H4)氨基酸序列都非常相似[24]。所以，可以使用同一種抗體研究不同物種的組蛋白修飾。但是，不同物種間的組蛋白還是存在微小的空間結(jié)構(gòu)差異，所以同一抗體對(duì)不同物種組蛋白的結(jié)合能力會(huì)有所差別[25]。對(duì)沙棘染色質(zhì)進(jìn)行超聲波破碎后，片段大小集中在100～500 bp，說(shuō)明該試驗(yàn)條件的適用性。通過(guò)Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)H3K9ac抗體與沙棘片段化染色質(zhì)具有較強(qiáng)的結(jié)合能力，可以用于后續(xù)的富集試驗(yàn)。用H3K9ac抗體對(duì)沙棘片段化DNA進(jìn)行富集，最終富集得到的DNA濃度為0.845 ng/μL，僅為陽(yáng)性對(duì)照Input DNA濃度的13.63%，低于對(duì)擬南芥[21]、毛果楊所報(bào)道的濃度[19]，原因可能是抗體與沙棘組蛋白的結(jié)合能力有限。通過(guò)陰性對(duì)照IgG可以確定抗體與組蛋白的特異性良好。DNA片段富集濃度低的原因可能是試驗(yàn)過(guò)程中的試驗(yàn)條件并不是最優(yōu)方案，所選用抗體存在物種差異，或者是沙棘中H3K9ac修飾密度低于擬南芥和毛果楊等，可以通過(guò)改進(jìn)試驗(yàn)方案或定制抗體來(lái)提高富集濃度，進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證。

ChIP-seq獲得的數(shù)據(jù)，在經(jīng)過(guò)一系列的質(zhì)量檢測(cè)和篩選后，clean reads將被用于后續(xù)的分析。由于ChIP獲得的是DNA片段，其所測(cè)定的序列與參考的基因組的mapping率應(yīng)該在70%以上[26-27]，但是，在本研究中2個(gè)樣本的mapping率只有35%，造成該現(xiàn)象的原因可能是因?yàn)樽詼y(cè)基因組中含有大量的重復(fù)序列，確切的結(jié)論還需要在進(jìn)一步完善沙棘基因組后才能獲得。Reads在染色體上分布廣泛，更加證明了組蛋白H3K9ac修飾對(duì)于沙棘基因的表達(dá)具有廣泛的調(diào)控作用[28]，reads相對(duì)基因位置的分析表明，H3K9ac對(duì)于沙棘基因的調(diào)控主要發(fā)生在結(jié)構(gòu)基因的兩端。由于染色體被超聲波隨機(jī)打斷，所以在通過(guò)特異抗體富集后，片段之間的存在大量的重疊區(qū)域，為了更加準(zhǔn)確分析基因功能，將reads富集區(qū)域稱為peak，即為DNA與相應(yīng)組蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。我們利用GO數(shù)據(jù)庫(kù)和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)peak所在區(qū)域的基因進(jìn)行GO功能富集和KEGG通路分析，不僅可以預(yù)測(cè)基因功能，還可以研究基因在不同代謝通路中的位置和作用，通過(guò)注釋，準(zhǔn)確獲得了H3K9ac修飾所能夠調(diào)節(jié)的基因功能，主要涉及到生物學(xué)過(guò)程中的細(xì)胞生理過(guò)程和細(xì)胞生長(zhǎng)中代謝過(guò)程，細(xì)胞組成中的膜質(zhì)和細(xì)胞分類，以及分子功能中小分子間有選擇性、非共價(jià)結(jié)合作用。在代謝途徑、氧化磷酸化和次級(jí)代謝物的合成通路中具有重要的作用。綜上所述，H3K9ac調(diào)控基因?qū)τ谏臣虻恼１磉_(dá)具有重要的作用。

本研究通過(guò)western blot驗(yàn)證了H3K9ac抗體與復(fù)合物具有較強(qiáng)的結(jié)合能力。沙棘片段化DNA的富集以及高通量測(cè)序證明了抗體能夠用于研究沙棘的組蛋白修飾類型，并且繪制了沙棘第一張H3K9ac修飾遺傳圖譜草圖和鑒定出沙棘H3K9ac修飾所調(diào)控基因，為今后研究組蛋白修飾對(duì)沙棘基因表達(dá)的調(diào)控方式奠定基礎(chǔ)。通過(guò)對(duì)試驗(yàn)條件的優(yōu)化，提高抗體對(duì)組蛋白的捕獲效率，將會(huì)獲得更加完整的組蛋白修飾遺傳圖譜。

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