王若秋，趙　朋，王冬冬，王耀紅，陳　勤

(旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 西北農(nóng)林科技大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，陜西楊陵 712100)

馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)是世界四大糧食作物之一，也是菜、飼和工業(yè)原料兼用作物。由于馬鈴薯營(yíng)養(yǎng)豐富，糧菜兼用，含有豐富的維生素及鈣、鉀等微量元素，且易于消化吸收，老少皆宜，功能齊全，頗受人們稱贊。有的稱譽(yù)它為“第二面包”，有的贊揚(yáng)它是“植物之王”[1]。在歐美國(guó)家特別是北美，馬鈴薯早就成為第二主食。2015年1月中國(guó)農(nóng)業(yè)部發(fā)布消息稱將推動(dòng)馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略[2]。馬鈴薯相比三大主糧的優(yōu)勢(shì)在于，種植周期短、產(chǎn)量高[3]。與普通馬鈴薯相比，彩色馬鈴薯含有較多的花青素、多酚、類黃酮等抗氧化活性物質(zhì)，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健作用[4]。彩色馬鈴薯含有多種花青素，使其抗氧化活性達(dá)到普通馬鈴薯的2～3倍[5]。因此，彩色馬鈴薯的培育及保健作用研究成為當(dāng)前科研熱點(diǎn)。

彩色馬鈴薯培育中，利用親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的彩色馬鈴薯彼此雜交，發(fā)揮雜種優(yōu)勢(shì)，有利于培育色素含量更高的新品種。然而，中國(guó)馬鈴薯品種鑒定一般基于傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)特征，如塊莖性狀、葉型、花色等[6]，這些性狀容易受環(huán)境條件影響,并且對(duì)植物及塊莖成熟度等都有一定的要求[7]。如何快速準(zhǔn)確鑒別彩色馬鈴薯品種，選配優(yōu)良雜交親本組合培育新品種，已成為當(dāng)前馬鈴薯育種工作中急需解決的問題。SSR分子標(biāo)記克服了形態(tài)標(biāo)記的不足，擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定、檢測(cè)手段簡(jiǎn)便易行，與RFLP等其它分子標(biāo)記相比，具有基因組間分布廣、共顯性、多態(tài)性高、重復(fù)性好、擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定及操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于植物親緣關(guān)系分析、指紋圖譜構(gòu)建等方面。王紹鵬等[8]利用4對(duì)引物對(duì)黑龍江省7個(gè)主栽品種進(jìn)行SSR標(biāo)記，通過相似度分析區(qū)分出6個(gè)馬鈴薯品種。段艷鳳等[9]利用SSR標(biāo)記構(gòu)建了中國(guó)在2000～2007年之間審定的88個(gè)馬鈴薯品種的指紋圖譜并進(jìn)行了遺傳多樣性分析，聚類分析結(jié)果與供試材料系譜來源具有較好一致性，同一栽培區(qū)域育成的品種在不同程度上聚在一類。張自強(qiáng)等[10]從90對(duì)SSR引物中篩選出10對(duì)多態(tài)性好、重復(fù)性強(qiáng)的引物將36個(gè)馬鈴薯品種劃分成7類，從DNA分子水平揭示出各供試品種間的親緣關(guān)系。目前，國(guó)內(nèi)彩色馬鈴薯品種并不豐富，因此關(guān)于彩色馬鈴薯種質(zhì)資源遺傳多樣性的報(bào)道仍比較少見。

本研究旨在利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)33份彩色馬鈴薯種質(zhì)材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，構(gòu)建分子標(biāo)記指紋圖譜，為彩色馬鈴薯新品種的選育提供科學(xué)指導(dǎo)并為彩色馬鈴薯種質(zhì)資源的快速鑒定提供技術(shù)依據(jù)。

1　材料和方法

1.1　試驗(yàn)材料

試驗(yàn)選用33份國(guó)外引進(jìn)和西北農(nóng)林科技大學(xué)馬鈴薯課題研究組自主培育的彩色馬鈴薯品種(系)進(jìn)行遺傳多樣性分析，各品種(系)薯皮和薯肉顏色見圖1和表1。

圖1　部分彩色馬鈴薯原原種塊莖Fig.1　Tuber traits of some pigmented potato varieties

編號(hào)Number材料Material薯皮顏色Potatoskincolor薯肉顏色Fleshcolor編號(hào)Number材料Material薯皮顏色Potatoskincolor薯肉顏色Fleshcolor1CQP46白White白White18CPW19紅Red紅Red2CQP67紫Purple淺紫Lightpurple19CPW199紫Purple紫Purple3CQP69紅Red紅Red20CPW2紫Purple花紫Whiteandpurple4CQP70紫Purple紫Purple21CPW29紅Red紅Red5CQP71淺紅Lightred黃Yellow22CPW35淺紫Lightpurple淡紅Aarnation6CQP72紫Purple紫Purple23CPW36淺紫Lightpurple淡紅Aarnation7CQP75紅Red白White24CPW37紅紫Reddishviolet紅紫Reddishviolet8CQP77紫Purple紫Purple25CPW38淺紫Lightpurple淡紅Aarnation9CQP82黃Yellow黃Yellow26CPW45紅Red紅Red10CQP85紅紫Reddishviolet紅Red27CPW47紫Purple紫Purple11CPW10紫Purple紫Purple28CPW48紫Purple紫Purple12CPW100紫Purple花紫Whiteandpurple29CPW55紫Purple紫Purple13CPW11紫Purple紫Purple30CPW6紅紫Reddishviolet紅紫Reddishviolet14CPW12紅Red紅Red31CPW8紫Purple紫Purple15CPW14紅Red紅Red32CPW84淺紫Lightpurple淺紫Lightpurple16CPW15紅Red紅Red33CPW99紫Purple紫Purple17CPW16紅Red紅Red

1.2　馬鈴薯DNA提取

取苗期馬鈴薯植株幼嫩、健壯且新鮮的葉片，置于保鮮袋中在液氮中速凍，于-80℃低溫冰箱保存，用于基因組DNA的提取。采用CTAB小量法[11]提取基因組DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量，微量分光光度計(jì)NanoDrop 2000測(cè)定提取DNA濃度，然后將樣品稀釋為100 ng/μL，置于-20 ℃冰箱中保存。

1.3　SSR 標(biāo)記分析

本試驗(yàn)參考其他相關(guān)研究文獻(xiàn)[12]，選擇了馬鈴薯染色體組上的22個(gè)SSR標(biāo)記，引物序列等相關(guān)信息見表2。引物均由武漢金開瑞生物工程有限公司合成。

擴(kuò)增反應(yīng)體系為15 μL：ddH2O為4.50 μL，2×Es Taq MasterMix(Dye)為7.50 μL，10 μmol/L正向引物為0.75 μL，10 μmol/L反向引物為0.75 μL，DNA模板為1.50 μL。

擴(kuò)增反應(yīng)程序：94 ℃模板預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，重復(fù)30個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸2 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，電泳結(jié)束后用硝酸銀染色觀察結(jié)果[13]。

1.4　數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及聚類分析

根據(jù) SSR位點(diǎn)上銀染帶型的有無，轉(zhuǎn)換為二進(jìn)制數(shù)據(jù)，有條帶的賦值為“1”，無條帶的賦值為“0”。利用NTSYS-pc 2.10軟件分析試驗(yàn)材料的遺傳多樣性。其中，以Qualitiative data模塊計(jì)算試驗(yàn)材料間的遺傳相似系數(shù)，SAHN模塊采用非加權(quán)類平均法(UPGMA)進(jìn)行聚類分析，Tree plot模塊用于繪制樹狀聚類圖。

多態(tài)信息量(Polymorphism information content，PIC)的計(jì)算依照公式[14]PIC= 1-∑Pi2，表征SSR標(biāo)記多態(tài)性信息含量(遺傳多樣性指數(shù))。對(duì)某一特定SSR標(biāo)記引物擴(kuò)增出的多態(tài)性片段，Pi為第 i 個(gè)等位基因在所有品種中出現(xiàn)的頻率。

2　結(jié)果與分析

2.1　DNA提取結(jié)果

將33份彩色馬鈴薯品種(系)提取的DNA各取5 μL，分別與1 μL Loading buffer混勻，用 1%瓊脂糖凝膠，120 V電壓，電泳30 min，用紫外凝膠成像儀觀察電泳結(jié)果。從電泳結(jié)果(圖2)可以看出，本試驗(yàn)所提取的馬鈴薯DNA，電泳條帶清晰無拖尾，只有1條帶，片段大亮度高，說明提取的基因組DNA沒有降解，濃度較高。經(jīng)微量分光光度計(jì)測(cè)定，DNA濃度多在800～1 000 ng/μL之間，在質(zhì)量與數(shù)量上均滿足后續(xù)試驗(yàn)要求。

表2　SSR標(biāo)記引物名稱及序列

M. DL500圖2　馬鈴薯基因組DNA瓊脂糖電泳Fig.2　Agarose electrophoresis of potato genome DNA

2.2　SSR標(biāo)記多態(tài)性分析

試驗(yàn)采用22對(duì)SSR標(biāo)記引物(表2)，對(duì)33份彩色馬鈴薯材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如表3所示。

由表3可知，22對(duì)引物組合共檢測(cè)到95個(gè)等位位點(diǎn)，其中82個(gè)為多態(tài)性位點(diǎn)，多態(tài)性比率達(dá)86.31%，并且DNA片段的長(zhǎng)度多在50～400 bp之間，表明供試材料的SSR多態(tài)性豐富。每對(duì)引物擴(kuò)增出的等位位點(diǎn)數(shù)為1～12個(gè)，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出的等位位點(diǎn)數(shù)為4.31個(gè)。其中，引物STI005多態(tài)性條帶最多，為12條；引物STM1053多態(tài)性條帶最少，僅有1條。多態(tài)信息量(PIC)為0.168 7(STM1053)～0.991 9(STI033)，平均為0.841 1。圖3為引物STM2022在部分彩色馬鈴薯材料中的擴(kuò)增結(jié)果。

2.3　彩色馬鈴薯親緣關(guān)系聚類分析

由表4可知，33份彩色馬鈴薯材料之間遺傳相似系數(shù)在0.53～0.91之間。其中，CPW15與CPW16遺傳相似系數(shù)最大，為0.91，CQP75與CPW100遺傳相似系數(shù)最小，為0.53。

按照UPGMA方法進(jìn)行聚類分析[15],得到33份供試材料的遺傳關(guān)系聚類圖(圖4)。通過共表型相關(guān)(cophenetic correlation)分析得出相關(guān)性系數(shù)(r)為0.72，說明聚類結(jié)果較好。在相似系數(shù)0.71處，33份供試材料分為4個(gè)主要聚類群。其中，類群Ⅰ包括7個(gè)材料，4個(gè)材料為紅紫色薯皮紅紫色薯肉，其余3個(gè)都是淺紫色或淡紅色馬鈴薯品種(系)；類群Ⅱ最大，包括17個(gè)材料，除CQP71為淺紅色薯皮黃色薯肉之外，其余材料均為紫色或紅色馬鈴薯品種(系)；類群Ⅲ包括7個(gè)材料，4個(gè)材料為均紫色或淺紫色馬鈴薯品種(系)，CQP46和CQP75為白色薯肉，CQP82薯皮薯肉均為黃色；類群Ⅳ只有CPW2和CPW100，均是花紫色馬鈴薯(花紫色是指薯肉白紫相間)。

表3　SSR標(biāo)記擴(kuò)增結(jié)果

2.4　指紋圖譜分析

依據(jù)22對(duì)引物擴(kuò)增條帶的統(tǒng)計(jì)分析，綜合考慮條帶讀取難易程度[16]、重復(fù)性高低、多態(tài)性信息含量等[17]，篩選出STM0031、STM0030、STI014、STM1029、STI001共5對(duì)引物用于構(gòu)建33份彩色馬鈴薯材料的分子標(biāo)記指紋圖譜。STM0031擴(kuò)增出的條帶大小分別是210、195、175和120 bp；STM0030擴(kuò)增出的條帶大小分別是160、140和133 bp；STI014擴(kuò)增出的條帶大小分別是140、132、120 和113 bp；STM1029擴(kuò)增出的條帶大小分別是170和160 bp；STI001擴(kuò)增出的條帶大小分別是240、230、210、198、194和189 bp。這5對(duì)引物在所有供試材料中可檢測(cè)到19個(gè)等位位點(diǎn)，多態(tài)性等位位點(diǎn)達(dá)18個(gè)，平均每對(duì)引物可以檢測(cè)出3.6個(gè)等位位點(diǎn)。利用這5對(duì)引物，可以完全區(qū)分33份供試彩色馬鈴薯材料(表5)。

相似系數(shù) Similarity coefficient圖4　彩色馬鈴薯遺傳關(guān)系聚類圖Fig.4　Genetic clustering tree map of pigmented potato

M.DL500；1～23分別為馬鈴薯品種CQP46、CQP67、CQP69、CQP70、CQP71、CQP72、CQP75、CQP77、CQP82、CQP85、CPW10、CPW100、CPW11、CPW12、CPW14、CPW15、CPW16、CPW19、CPW199、CPW2、CPW29、CPW35、CPW36 圖3　引物STM2022擴(kuò)增結(jié)果M. DL500; 1 to 23 are CQP46, CQP67, CQP69, CQP70, CQP71, CQP72, CQP75, CQP77, CQP82, CQP85, CPW10, CPW100, CPW11, CPW12, CPW14, CPW15, CPW16, CPW19, CPW199, CPW2, CPW29 , CPW35, CPW36Fig.3　Amplification results of primer STM2022

表5　彩色馬鈴薯基因型指紋圖譜

品種(系)Variety(line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

注：0表示該位點(diǎn)處無條帶，1表示該位點(diǎn)處有條帶

Note: 0 means there is no band at this locus, while 1 means there is a band at this locus

3　討　論

目前，馬鈴薯育種仍以品種間雜交為主，親本的選配顯得尤為重要[18]，既需要親本攜帶目標(biāo)性狀或目的基因，又需要擴(kuò)大親本間的遺傳差異。不同種質(zhì)資源親緣關(guān)系分析和指紋圖譜的構(gòu)建，對(duì)于雜交育種中優(yōu)良親本組合的選配及品種的快速鑒定具有重要的意義。而分子標(biāo)記技術(shù)可以不受組織發(fā)育階段和環(huán)境條件的影響[19]，從DNA水平上區(qū)分不同品種間的遺傳差異，穩(wěn)定可靠。為更好研究彩色馬鈴薯遺傳多樣性、為彩色馬鈴薯資源鑒定和利用提供依據(jù)[20]，本次研究中選用了33個(gè)表型有顯著差異的馬鈴薯,利用22對(duì)引物進(jìn)行親緣關(guān)系的分析。結(jié)果表明33個(gè)馬鈴薯品種的遺傳關(guān)系差異較大，可分為4個(gè)類群。其中，類群Ⅰ的7個(gè)材料均為(紅)紫色薯皮(紅)紫色薯肉；類群Ⅱ的17個(gè)材料，除CQP71為淺紅色薯皮黃色薯肉之外，其余16個(gè)材料均為紫色或紅色馬鈴薯品種(系)；類群Ⅳ只有2個(gè)材料CPW2和CPW100，均是花紫色馬鈴薯。上述結(jié)果說明3個(gè)類群內(nèi)彩色馬鈴薯間的親緣關(guān)系比較接近，遺傳背景差異小，遺傳多樣性水平低，可能與雜交育種的親本單一有關(guān)。因此在選擇雜交親本時(shí)，在滿足育種目標(biāo)的同時(shí)應(yīng)充分考慮其遺傳差異。類群Ⅲ包括7個(gè)材料，其中4個(gè)材料為(淺)紫色馬鈴薯品種(系)，2個(gè)材料為白色薯肉，CQP82薯皮薯肉均為黃色。從親緣關(guān)系來看，它們的遺傳基礎(chǔ)較為相似，可能由于控制色素合成的基因差異較大，所以薯皮薯肉顏色并不一致。

本研究利用22對(duì)引物將33個(gè)供試材料在相似系數(shù)0.71處分為4個(gè)類群。石景等[15]用56對(duì)SSR引物分析了55份彩色馬鈴薯供試材料，在相似系數(shù)0.63處可將全部材料分為三大類。段艷鳳等[9]用10對(duì)SSR引物分析了88個(gè)馬鈴薯審定品種的親緣關(guān)系并構(gòu)建了指紋圖譜，在相似系數(shù)0.652處，81.8%的材料仍聚類在一組，說明供試材料遺傳基礎(chǔ)非常狹窄。李先平等[21]用41個(gè)SSR標(biāo)記檢測(cè)了30份彩色馬鈴薯材料的親緣關(guān)系，供試材料分為兩大類群。上述研究結(jié)果與本研究結(jié)果較為一致，馬鈴薯品種(系)遺傳類群較少，表明中國(guó)目前的馬鈴薯品種及種質(zhì)資源遺傳背景相近，遺傳基礎(chǔ)組成較為狹窄。

本研究所用彩色馬鈴薯材料表現(xiàn)出相對(duì)較大的遺傳基礎(chǔ)差異，這可能得益于部分國(guó)外新引進(jìn)種質(zhì)資源，提高了彩色馬鈴薯的遺傳多樣性。雖然供試材料在4個(gè)主要聚類群之間表現(xiàn)出較大遺傳差異，但是每個(gè)類群之內(nèi)遺傳基礎(chǔ)比較狹窄。因此，在彩色馬鈴薯新品種選育中，應(yīng)選擇遺傳差異豐富的種質(zhì)資源進(jìn)行雜交，以拓寬遺傳基礎(chǔ)，提高彩色馬鈴薯品種營(yíng)養(yǎng)性的同時(shí)增強(qiáng)其對(duì)環(huán)境脅迫的抵御能力[22-23]。通過對(duì)這33份彩色馬鈴薯材料的遺傳多樣性分析及指紋圖譜構(gòu)建，將有助于提高彩色馬鈴薯新品種選育效率。

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