楊 柳，李志輝，林立彬

（中南林業(yè)科技大學(xué) 林學(xué)院，湖南 長沙 410004）

體胚發(fā)生一直都是植物組織培養(yǎng)中的重要環(huán)節(jié)，我國雖然開展木本植物體胚發(fā)生研究較晚，但也取得了不錯的成績，研究的樹種包括龍眼[1]、鵝掌楸[2]、荔枝[3]、馬尾松[4]、橡膠樹[5]、水曲柳[6]、麻櫟[7]、杉木[8]、枇杷[9]、香榧[10]等。樟樹作為“江南四大名木”，國內(nèi)對于樟樹體細(xì)胞胚胎發(fā)生的研究卻不多，僅有杜麗[11]利用香樟未成熟合子胚初步建立了香樟體胚發(fā)生途徑的植株再生體系，在此研究基礎(chǔ)上，施雪萍[12]、陳甘明[13]對香樟體胚發(fā)生體系進(jìn)行優(yōu)化，完善了植株再生體系，提高了遺傳轉(zhuǎn)化效率。

近些年來，基因工程的快速發(fā)展，為不結(jié)實、不耐寒和被害蟲危害嚴(yán)重的樟樹提供了新的培育方法，這種方法不但可以保留樟樹的優(yōu)良性狀，還可以創(chuàng)造更為豐富的性狀類型，就樟樹而言，目前尚未建立起高效穩(wěn)定的再生體系，體細(xì)胞胚胎方面研究較少，從而在很大程度上限制了樟樹改良的進(jìn)程。

研究了湖南省不同種源樟樹，對其體胚發(fā)生過程中的激素配比及相應(yīng)表現(xiàn)進(jìn)行了分析，旨在為湖南省不同種源樟樹體胚發(fā)生建立良好的基礎(chǔ)，完善樟樹再生植株體系，同時為樟樹的遺傳改良和新品種培育提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與外植體處理

選擇樹干飽滿、生長健壯、無病蟲害的樟樹植株為供試母體，材料于2016年7月采自湖南省長沙、岳陽、婁底、醴陵、郴州、懷化的樟樹未成熟種子。

將不同種源的樟樹種子在自來水下沖洗干凈，置于無菌超凈工作臺上，用70%的酒精浸泡45 s，無菌水沖洗2次，轉(zhuǎn)入0.1%升汞溶液浸泡8 min，無菌水沖洗3次。外植體按以上步驟消毒后，在無菌操作臺上切開果實，取出合子胚接種于誘導(dǎo)樟樹體胚發(fā)生的培養(yǎng)基上，每個處理接種30瓶，每瓶一個外植體，3次重復(fù)。

1.2 實驗方法

1.2.1 不同種源樟樹體胚的誘導(dǎo)

采用MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加激素為6-BA（1、3、5 mg·L-1）、2，4-D（0.1、0.3、0.5 mg·L-1）、NAA（0.1、0.3、0.5 mg·L-1），水解酪蛋白（CH）700 mg，蔗糖30 g，瓊脂粉7.5 g，pH值5.8～6.0，培養(yǎng)條件為暗培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為23±2 ℃。

1.2.2 不同種源樟樹芽的分化

將誘導(dǎo)產(chǎn)生的體胚培養(yǎng)至成熟，接種到芽分化培養(yǎng)基上，7 d后觀察芽的誘導(dǎo)情況，采用MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加激素為6-BA（1、3、5 mg·L-1）、2，4-D（0.1、0.3、0.5 mg·L-1）、NAA（0.1、0.3、0.5 mg·L-1），水解酪蛋白（CH）700 mg，蔗糖30 g，瓊脂粉7.5 g，pH值5.8～6.0，培養(yǎng)條件為光照培養(yǎng)16 h，黑暗培養(yǎng)8 h，光照強度為1 000 Lx左右。培養(yǎng)溫度為23±2 ℃。

1.2.3 不同種源樟樹根的誘導(dǎo)

將誘導(dǎo)產(chǎn)生的芽經(jīng)過進(jìn)一步生長后從基部剪斷，轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基，20 d后觀察生根率，采用MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加激素為IBA（1 mg·L-1）、NAA（0、0.1、0.3、0.5 mg·L-1），水解酪蛋白（CH）700 mg，蔗糖30 g，瓊脂粉7.5 g，pH值5.8～6.0，培養(yǎng)條件為光照培養(yǎng)16 h，黑暗培養(yǎng)8 h，光照強度為1 000 Lx左右。培養(yǎng)溫度為23±2 ℃。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

接種后的外植體培養(yǎng)4周后統(tǒng)計各個處理的體胚誘導(dǎo)率，成熟體胚接種4周后統(tǒng)計芽的分化率，芽接種4周后統(tǒng)計生根率，用SPSS軟件進(jìn)行方差分析和多重比較，最小顯著性差異水平P=0.05。

體胚誘導(dǎo)率=(誘導(dǎo)出體胚的外植體總數(shù)／接種合子胚總數(shù))×100%；

芽的分化率=(誘導(dǎo)出芽的外植體總數(shù)/接種的成熟體胚總數(shù))×100%；

植株生根率=(誘導(dǎo)出根的外植體總數(shù)/接種的芽總數(shù))×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種源樟樹在不同激素組合上體胚的誘導(dǎo)

將幼胚接種到不同激素組合的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行體胚誘導(dǎo)，培養(yǎng)3～5 d，幼胚開始膨大，7～10 d觀察到有兩種形態(tài)的愈傷組織形成，一般分為非胚性愈傷和胚性愈傷，非胚性愈傷是灰色疏松性，胚性愈傷是白、綠色緊密型，經(jīng)過后期培養(yǎng)，灰色疏松性少部分可誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽，此種非胚性愈傷組織后期產(chǎn)生的芽玻璃化程度嚴(yán)重或者直接褐化死亡，無法培育成正常植株，白、綠色緊密型的胚性愈傷組織在合適的條件下經(jīng)培養(yǎng)可產(chǎn)生不定芽及再生植株。除形成愈傷組織外，培養(yǎng)10～15 d，子葉膨大處邊緣顏色加深出現(xiàn)微小透明組織，經(jīng)過培養(yǎng)可直接發(fā)育成形態(tài)各異的子葉期體胚，誘導(dǎo)的體胚大多聚集在一起，可能是起源于同一細(xì)胞團，外植體基部隨著體胚的發(fā)生顏色逐漸加深直至褐色，誘導(dǎo)不定芽的過程中同時會有不定根的產(chǎn)生，這是體胚兩極性的表現(xiàn)，若先產(chǎn)生不定根則無法觀察到不定芽的產(chǎn)生，一定程度上不定根的先發(fā)生機制抑制了不定芽的發(fā)生（見圖1）。

圖1 樟樹體細(xì)胞胚胎發(fā)生Fig.1 Somatic embryogenesis of Cinnamomum camphora L.

在誘導(dǎo)不同種源樟樹體胚發(fā)生過程中，6-BA、2，4-D、NAA 3個因素均設(shè)置3個水平，6-BA為1、3、5 mg·L-1、2，4-D 和 NAA 均 為 0.1、0.3、0.5 mg·L-1。從表1可以發(fā)現(xiàn)，并不是每個激素質(zhì)量濃度都能成功誘導(dǎo)出體胚，其中郴州種源樟樹不能誘導(dǎo)產(chǎn)生體胚數(shù)較多，不能誘導(dǎo)產(chǎn)生體胚的原因大多是產(chǎn)生了非胚性愈傷組織，另外發(fā)現(xiàn)郴州種源樟樹體胚在同樣的處理下有較高污染率，體胚易死亡。長沙種源樟樹合子胚污染率低，誘導(dǎo)率高，胚性愈傷組織呈乳白色緊密型，表面光澤度明顯。不同種源樟樹在不同激素組合上體胚誘導(dǎo)結(jié)果（表1）表明，不同種源樟樹體胚誘導(dǎo)率隨著激素質(zhì)量濃度的變化而變化。大體上呈現(xiàn)體胚誘導(dǎo)率隨著6-BA質(zhì)量濃度的升高而下降的趨勢，在 5 mg·L-1的 6-BA 與 0.3、0.5 mg·L-1的 NAA激素組合中，各種源沒有觀察到體胚及胚性愈傷組織發(fā)生。當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度一定時，體胚誘導(dǎo)率大體上隨著2，4-D或NAA質(zhì)量濃度的升高而降低，在6-BA質(zhì)量濃度為1 mg·L-1時，各種源樟樹有最大體胚誘導(dǎo)率；當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度一樣時，2，4-D的體胚誘導(dǎo)率高于NAA。表1結(jié)果顯示，適合岳陽、懷化樟樹誘導(dǎo)體胚發(fā)生的最適培養(yǎng)基為MS+1 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-12，4-D，最大體胚誘導(dǎo)率分別為77.8%、73.3%，郴州、醴陵、長沙、婁底樟樹最適培養(yǎng)基均為 MS+1 mg·L-16-BA+0.3 mg·L-12，4-D，最大體胚誘導(dǎo)率分別為60%、64.4%、82.2%、66.7%。

表1 激素對不同種源樟樹體胚誘導(dǎo)的影響?Table1 The effect of hormone for somatic embryo from different provenances of Cinnamomum camphora

2.2 不同種源樟樹在不同激素組合上芽的分化

將愈傷組織和成熟的體胚接種到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，經(jīng)過7～10 d，在樟樹體胚的基部，開始有芽抽生萌動的跡象，伴隨著體胚上愈傷組織的形成，綠色的芽點也遍布在愈傷組織表層形成突起，培養(yǎng)4周左右，綠色芽點慢慢發(fā)育長大，形成肉眼可辨的不定芽，芽長至2～4 cm可從基部截斷轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基。

不同種源樟樹在不同激素質(zhì)量濃度培養(yǎng)基上芽分化結(jié)果（見表2）顯示，不同種源樟樹在同一質(zhì)量濃度培養(yǎng)基或同一種源樟樹在不同質(zhì)量濃度培養(yǎng)基上表現(xiàn)不同?？傮w來看，隨著6-BA質(zhì)量濃度的增加，各種源表現(xiàn)不一，有的種源表現(xiàn)為誘導(dǎo)率隨著6-BA質(zhì)量濃度的增加而增加，另一部分種源誘導(dǎo)率表現(xiàn)為先升高后降低。6-BA質(zhì)量濃度一定時，NAA誘導(dǎo)率明顯高于2，4-D，2，4-D和NAA質(zhì)量濃度過高時，部分種源芽的誘導(dǎo)率為0。

表2 激素對不同種源樟樹芽分化的影響?Table2 The effect of hormone for bud from different provenances of Cinnamomum camphora

岳陽種源分化率最高為46.7%，激素組合為 5 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA。低質(zhì)量濃度（0.1 mg·L-1）的2，4-D芽的分化率好于高質(zhì)量濃度（0.3 mg·L-1）的2，4-D，當(dāng) 2，4-D質(zhì)量濃度過高為0.5 mg·L-1時，分化率為0。分化率隨著6-BA質(zhì)量濃度的升高而升高，6-BA與NAA激素組合均有芽的出現(xiàn)，誘導(dǎo)結(jié)果明顯好于2，4-D。

郴州種源樟樹整體看來芽的誘導(dǎo)率較差，最高為38.9%，激素組合為5 mg/L 6-BA+0.3 mg·L-1NAA。在2，4-D質(zhì)量濃度為0.3和0.5 mg·L-1時誘導(dǎo)率為0，低質(zhì)量濃度2，4-D誘導(dǎo)率最高也就22.2%。整體看來，當(dāng)NAA質(zhì)量濃度為0.3 mg·L-1時有較高的誘導(dǎo)率，NAA誘導(dǎo)效果明顯好于2，4-D對芽的誘導(dǎo)。

醴陵種源最高分化率44.5%是在3 mg·L-16-BA+0.3 mg·L-1NAA中誘導(dǎo)得到的。誘導(dǎo)率隨著6-BA質(zhì)量濃度的增加而增加，6-BA質(zhì)量濃度一定時，隨著2，4-D和NAA質(zhì)量濃度的增加呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，組合6-BA質(zhì)量濃度為5 mg·L-1和NAA質(zhì)量濃度為0.5 mg·L-1時例外。同樣，高質(zhì)量濃度的2，4-D（0.5 mg·L-1）芽的分化率為0。

長沙種源樟樹整體看來芽分化率效果最好達(dá)51.1%，激素組合為 3 mg·L-16-BA+0.3 mg·L-1NAA。除了2個激素組合沒有觀察到芽的分化，大部分誘導(dǎo)效果不錯，分化率明顯高于其他幾個種源。6-BA質(zhì)量濃度一定時，分化率隨著2，4-D濃度升高而下降，隨著NAA質(zhì)量濃度的升高為先上升后下降。

懷化種源樟樹分化率與醴陵種源相同為44.5%，誘導(dǎo)的激素組合為 5 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA。芽的分化率隨著6-BA質(zhì)量濃度的升高大致為升高的趨勢，6-BA質(zhì)量濃度一定時，分化率隨著2，4-D和NAA質(zhì)量濃度的上升而下降。低質(zhì)量濃度6-BA（1 mg·L-1）和低質(zhì)量濃度NAA（0.1 mg·L-1）的組合中芽的誘導(dǎo)率為0。

婁底種源樟樹芽的分化率最高為47.8%，誘導(dǎo)此分化率的激素組合（5 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA）與岳陽、懷化種源一致。分化率隨著6-BA濃度的升高而升高，6-BA質(zhì)量濃度一定時，隨著2，4-D濃度升高而降低，6-BA為低質(zhì)量濃度（1 mg·L-1）時，隨著NAA質(zhì)量濃度的升高表現(xiàn)為先升高后降低，6-BA為高質(zhì)量濃度（3 mg·L-1和5 mg·L-1）時，隨著NAA濃度的升高而下降。

2.3 不同種源樟樹在不同激素組合上根的誘導(dǎo)

切割下來的芽經(jīng)過進(jìn)一步生長后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，從表3中可以看出，不同種源在不同激素組合上生根率差異顯著，長沙種源有最高生根率，達(dá)到84.4%，郴州和醴陵都有最低生根率，為72.2%，總體看來，各種源在各處理下生根率均大于50%，根狀態(tài)良好能發(fā)育成完整植株。得出結(jié)論如下，誘導(dǎo)岳陽、郴州、醴陵、長沙、懷化、婁底樟樹芽生根的最適激素質(zhì)量濃度分別為 1 mg·L-1IBA+0.1 mg·L-1NAA、1 mg·L-1IBA+0.5 mg·L-1NAA、1 mg·L-1IBA+0.3 mg·L-1NAA、1 mg·L-1IBA、1 mg·L-1IBA+0.1 mg·L-1NAA、1 mg·L-1IBA+0.3 mg·L-1NAA。

表3 激素對不同種源樟樹生根的影響?Table3 The effect of hormone for root from different provenances of Cinnamomum camphora

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié) 論

（1）實驗結(jié)果表明，長沙、岳陽樟樹為較易誘導(dǎo)體胚發(fā)生的種源，最高誘導(dǎo)率分別為82.2%、77.8%，郴州種源誘導(dǎo)效果最差，2，4-D較NAA誘導(dǎo)效果好，而低質(zhì)量濃度的2，4-D誘導(dǎo)效果較好，適合岳陽、懷化樟樹誘導(dǎo)體胚發(fā)生的最適培養(yǎng)基為 MS+1 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-12，4-D，郴州、醴陵、長沙、婁底樟樹最適培養(yǎng)基為MS+1 mg·L-16-BA+0.3 mg·L-12，4-D；

（2）在芽誘導(dǎo)試驗中，NAA誘導(dǎo)率明顯高于2，4-D，較高濃度的6-BA和較低質(zhì)量濃度的NAA對芽有更高的誘導(dǎo)率，5 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA激素組合適合岳陽、懷化、婁底種源樟樹芽分化，醴陵和長沙種源樟樹為3 mg·L-16-BA+0.3 mg·L-1NAA，郴 州種 源 為 5 mg·L-16-BA+0.3 mg·L-1NAA；

（3）不同種源在不同激素組合上生根率差異顯著，各種源生根率均大于50%，誘導(dǎo)岳陽、郴州、醴陵、長沙、懷化、婁底樟樹芽生根的最適激素質(zhì)量濃度分別為 1 mg·L-1IBA+0.1 mg·L-1NAA、1 mg·L-1IBA+0.5 mg·L-1NAA、1 mg·L-1IBA+0.3 mg·L-1NAA、1 mg·L-1IBA、1 mg·L-1IBA+0.1 mg·L-1NAA、1 mg·L-1IBA+0.3 mg·L-1NAA。

3.2 討 論

近年來，樟樹組織培養(yǎng)取得了一定的成功，多數(shù)研究者對樟樹組織培養(yǎng)過程中的最佳培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，在激素質(zhì)量濃度組合方面做了眾多研究，但是仍存在很大的分歧，這與外植體、采種時間、生理年齡、基因型等多種因素有關(guān)。到目前為止，對于樟樹的研究主要集中在樟樹莖段組織培養(yǎng)誘導(dǎo)植株再生[14-15]以及樟樹提取物[16]、生長模型[17]等方面，在樟樹體胚發(fā)生方面研究較少，利用樟樹幼胚誘導(dǎo)體胚發(fā)生及再生植株方面就更少。本試驗表明低質(zhì)量濃度的2，4-D對樟樹體胚發(fā)生誘導(dǎo)效果較好，與杜麗[11]誘導(dǎo)香樟體胚發(fā)生結(jié)果類似；在芽誘導(dǎo)階段，較高質(zhì)量濃度的細(xì)胞分裂素和較低質(zhì)量濃度的生長素對愈傷組織有更高的分化率，這與青錢柳[18]在組織培養(yǎng)過程中激素使用原則是一樣的；樟樹組培苗是易誘導(dǎo)生根的材料，張椿芳[18]以香樟莖段為外植體，組培苗生根率可達(dá)100%，辛全偉[19]的研究中樟樹生根率達(dá)95%，且各家系生根率均在50%以上，本研究取得的成果與前人類似，各種源生根率均大于50%，但并沒有100%生根的情況，這可能是起始外植體及采種時間不同。

在植物體胚發(fā)生過程中，生長素是非常重要的因素。植物組培中生長素2，4-D對植株再生的影響，一直以來就有不同的觀點。李文靜[20]等人發(fā)現(xiàn)愈傷組織在2，4-D質(zhì)量濃度較高的培養(yǎng)基上，薺菜再生植株能力有所降低；劉福平和陳移亮[22]在只含有2，4-D的培養(yǎng)基上蝴蝶蘭誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織不具有分化能力；而在馬忠華等[22]的實驗中，隨著2，4-D質(zhì)量濃度的增加，早熟禾出愈率不斷增加，植株再生能力提高。在實驗中我們發(fā)現(xiàn)，添加2，4-D的培養(yǎng)基確實能誘導(dǎo)較高頻率的體胚產(chǎn)生，且胚性愈傷組織發(fā)生頻率也高，誘導(dǎo)效果明顯好于NAA，可見2，4-D確實有促進(jìn)體胚發(fā)生的效果，但是繼續(xù)培養(yǎng)，會發(fā)現(xiàn)這種促進(jìn)效果也有抑制體胚發(fā)育的能力，即在含有2，4-D的培養(yǎng)基上次生體胚不斷發(fā)生，體胚難以發(fā)育至成熟、發(fā)芽乃至植株再生，只有在降低2，4-D質(zhì)量濃度或去除2，4-D的條件下能觀察到芽分化，添加2，4-D前期體胚誘導(dǎo)過程中，并不能發(fā)現(xiàn)體胚大量發(fā)生，只有在后期（15 d以后）才能明顯觀察到體胚的大量發(fā)生，可能是在培養(yǎng)的過程中，2，4-D質(zhì)量濃度下降促進(jìn)了體胚的發(fā)育。

NAA體胚誘導(dǎo)率沒有2，4-D高，我們發(fā)現(xiàn)較高質(zhì)量濃度的6-BA與NAA組合幾乎不能誘導(dǎo)體胚發(fā)生，發(fā)生頻率低，誘導(dǎo)效果不好，但在芽分化過程中含有NAA的培養(yǎng)基誘導(dǎo)效果好，這與上面所說的2，4-D抑制體胚往下一階段發(fā)育相符。實驗結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，6-BA質(zhì)量濃度低，利于愈傷組織及體胚發(fā)生，6-BA質(zhì)量濃度高，利于芽分化，這與辜夕容[23]研究結(jié)果相似,而王長憲[24]認(rèn)為2，4-D：6-BA=4時，能提高愈傷誘導(dǎo)率，這在我的實驗中沒有體現(xiàn)出來，以后可設(shè)置更多的質(zhì)量濃度梯度驗證這一結(jié)論。

本研究雖然發(fā)現(xiàn)降低或去除2，4-D質(zhì)量濃度能夠使樟樹再生體系進(jìn)行下去，但是轉(zhuǎn)化效率不高，植株再生仍有困難，生根率也不是百分之百，所以我們可以猜測可能添加某些激素或物質(zhì)可以提高遺傳轉(zhuǎn)化效果，使芽分化更容易或更高頻率發(fā)生，黃健秋等[26]研究發(fā)現(xiàn)附加一定量的肌醇可得到粗壯的后期原胚，ABA和活性炭的同時使用能促進(jìn)體胚形成，肌醇作為一種有效的滲透劑、ABA作為一種催熟劑是不是在樟樹體胚誘導(dǎo)過程中有作用呢？對后期原胚的形成是否有促進(jìn)作用？本次實驗還有很多不足的地方，對于激素比例對體胚發(fā)生過程的作用還需設(shè)置更多梯度，對肌醇、ABA、活性炭等物質(zhì)還需做更多的因素分析試驗，這要在以后的實驗中加以驗證，得出更多準(zhǔn)確的結(jié)論。