蔡雨蒙 ，何崇單 ，李 萌 ，董金金 ，劉 偉 ，王俊燚 ，王義強(qiáng)

（中南林業(yè)科技大學(xué) a.林業(yè)生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；b.經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410004）

銀杏Ginkgo BilobaL.，又名公孫樹(shù)，屬裸子植物門(mén)Gymnospemae，銀杏科Ginkgoaceae銀杏屬GinkgoL.，單屬單種，是原產(chǎn)于我國(guó)的一種古老的木本裸子植物。銀杏是一種非常重要的經(jīng)濟(jì)林樹(shù)種，具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和研究?jī)r(jià)值[1]。銀杏果實(shí)具有十分重要的藥用和食用價(jià)值，其提取物對(duì)預(yù)防和治療心腦血管疾病等多種疾病具有顯著的作用，有望在保健和醫(yī)藥等領(lǐng)域形成新的產(chǎn)業(yè)[2-5]。但是，銀杏的童期很長(zhǎng)，實(shí)生樹(shù)開(kāi)花需要20年以上的時(shí)間。作為經(jīng)濟(jì)林木，其投資、育種、成林、果實(shí)收獲等周期非常長(zhǎng)，這種特性嚴(yán)重制約了目前銀杏產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

隨著遺傳育種技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步和發(fā)展，植物開(kāi)花調(diào)控的分子機(jī)制正在逐步被闡明，現(xiàn)已證明植物的開(kāi)花時(shí)間是由內(nèi)在因素和外在因素共同調(diào)控的[6-7]。內(nèi)在因素是指激素[8]及控制植物發(fā)育階段的各種調(diào)控基因[9-11]，而外在因素包括光周期[12-13]、溫度[14]和營(yíng)養(yǎng)條件[15]等。目前已經(jīng)確定的植物開(kāi)花的調(diào)控途徑包括光周期途徑[16]、自主途徑[17]、赤霉素途徑[18-19]和春化途徑[20-21]等4種途徑，不同途徑組成一個(gè)復(fù)雜的基因網(wǎng)絡(luò)共同決定植物開(kāi)花的啟動(dòng)和維持時(shí)間。

開(kāi)花調(diào)控基因CONSTANS（以下簡(jiǎn)稱(chēng)CO）是光周期途徑下游重要的調(diào)控基因[12]。在植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段，CO基因在植物的葉片中開(kāi)始表達(dá)。當(dāng)其轉(zhuǎn)錄的mRNA達(dá)到一定階段時(shí)，CO基因會(huì)激活其下游的成花基因，如FT基因、SOC1基因等，使植物由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變，從而開(kāi)始植物的花發(fā)育過(guò)程[22]。CO基因參與調(diào)控植物成花的早晚，并且對(duì)花發(fā)育有重要的促進(jìn)作用[23]。

本研究根據(jù)轉(zhuǎn)錄組信息克隆得到了一個(gè)與銀杏開(kāi)花調(diào)控相關(guān)的CO基因。對(duì)該基因序列以及編碼的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，將為銀杏基因工程育種提供候選基因，并為進(jìn)一步探索研究銀杏開(kāi)花的分子調(diào)控機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

銀杏葉材料采自種植于中南林業(yè)科技大學(xué)（湖南長(zhǎng)沙）、處于同等培養(yǎng)條件下的銀杏成年樹(shù)和幼年樹(shù)，成年銀杏為30年生，樹(shù)高15 m，胸徑30 cm左右；幼年銀杏為10年生，樹(shù)高5 m，胸徑15 cm左右；樹(shù)勢(shì)良好，生長(zhǎng)正常。采集4月（花芽未分化期）、5月（花芽分化初期）、9月（花芽分化盛期）的成年銀杏葉片以及4月、9月的幼年銀杏樹(shù)葉片，經(jīng)液氮處理后凍存于-80 ℃冰箱中用于RNA提取和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。載體pMD18-T、大腸桿菌DH5α均購(gòu)自TAKARA公司。

1.2 方 法

1.2.1 CO基因表達(dá)量分析

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期獲得的銀杏轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選到12個(gè)CO家族相關(guān)基因，除去基因序列結(jié)構(gòu)不完整、表達(dá)量過(guò)低的基因，對(duì)剩下的7個(gè)基 因 使 用 FPKM[24]（Fragments Per Kilobase of transcript per Million fragments mapped）分析各CO基因的表達(dá)水平，然后對(duì)銀杏CO基因的表達(dá)情況進(jìn)行聚類(lèi)分析。

1.2.2 銀杏總RNA的提取

從-80 ℃冷凍冰箱中提取保存的銀杏成年葉片樣品，采用E.Z.N.A（Omega）Plant RNA Kit試劑盒提取銀杏葉片總RNA，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的純度。

1.2.3 GbCOL 基因CDS的克隆

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組序列信息設(shè)計(jì)引物（下劃線(xiàn)為酶切位點(diǎn)），上游引物為GbCOL-F：5′-GCGGGAT CCATGGTGAAGGAAGAGGACCGTAGTG-3′， 下游引物為GbCOL-R：5′-GCCAAGCTTCTAAAAA GTTGGAACGAGACCAAAC-3′。cDNA 第 1鏈合成采用FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒（天根，北京），按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其反應(yīng)條件和反應(yīng)體系如表1和表2所示。擴(kuò)增完成后，采用PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行產(chǎn)物純化（天根，北京）。將回收產(chǎn)物與pMD18-T連接后轉(zhuǎn)化DH5α，通過(guò)藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性菌斑，將陽(yáng)性克隆送至上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序。

表2 PCR反應(yīng)條件Table2 PCR reaction program

1.2.4 生物信息學(xué)分析

利 用 NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi）查找目標(biāo)基因cDNA序列的開(kāi)放閱讀框（ORF）；使用DNAMAN軟件預(yù)測(cè)目標(biāo)基因核苷酸序列編碼的氨基酸序列；運(yùn)用NCBI上的BLAST程 序（http://www.ncbi.nlm.nih.Gov/BLAST/）完成蛋白質(zhì)和DNA同源性分析。在NCBI上 的 Conserved Domains（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）程序上完成保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)；然后通過(guò)MEGA 7.0軟件構(gòu)建CO基因的聚類(lèi)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 銀杏CO基因的表達(dá)分析

將7個(gè)CO家族基因的4月（花芽未分化期）成年銀杏葉（1）、5月（花芽分化初期）成年銀杏葉（2）、9月（花芽分化盛期）成年銀杏葉（3）、4月幼年銀杏葉（4）和9月幼年銀杏葉（5）表達(dá)量數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，繪制成表達(dá)模式聚類(lèi)熱圖（見(jiàn)圖1）。圖1中可以看出，在這7個(gè)CO家族基因中，Gb.41704在不同時(shí)期的表達(dá)量均高于其他CO基因。

圖1 銀杏CO基因表達(dá)模式聚類(lèi)熱Fig.1 Expression patterns of CO genes in Ginkgo biloba

將Gb.41704不同時(shí)期的表達(dá)量通過(guò)FPKM（Fragments Per Kilobase of transcript per Million fragments mapped）作為衡量轉(zhuǎn)錄本或基因表達(dá)水平的指標(biāo)（見(jiàn)表3），F(xiàn)PKM值越高則表示該基因在銀杏組織中的表達(dá)量越高。將不同時(shí)期FPKM值繪制成Gb.41704基因在銀杏不同時(shí)期葉片表達(dá)量圖（圖2），可以看出該基因表達(dá)量隨著花芽的分化而顯著上調(diào)；同時(shí)，該基因在成年期的表達(dá)量相對(duì)未開(kāi)花的幼年期表達(dá)量有明顯升高。因此篩選Gb.41704作為本研究的目標(biāo)基因。

2.2 目標(biāo)基因CDS的克隆及序列分析

以從9月成年銀杏葉中提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄銀杏cDNA第1條鏈，再以合成的銀杏cDNA第1條鏈為模板，利用設(shè)計(jì)的特異性引物GbCOL-F和GbCOL-R， 通過(guò)RT-PCR法（圖3）克隆得到Gb.41704的完整CDS（圖4）。測(cè)序表明，該片段長(zhǎng)度為1 239 bp，GC含量為52%，編碼412個(gè)氨基酸，將其命名為GbCOL。

表3 Gb.41704基因在銀杏發(fā)育不同時(shí)期葉片中表達(dá)量Table3 Expression levels of Gb.41704 in different leave samples of developmental stages

圖2 Gb.41704基因不同時(shí)期表達(dá)量Fig.2 Expression levels of Gb.41704 in different leave samples of developmental stages

根據(jù)核苷酸序列比對(duì)，該基因片段與其他植物CO基因序列很高。例如與甜菜Beta vulgaris COL1基因的同源性為87%，與洋蔥Allium cepa COL3基因的同源性為86%，樟子松Pinus sylvestrisL.COL1基因的同源性為85%，與火炬松Pinus taedaCOL1的同源性為85%，與歐洲冷杉Abies alba COL1的基因部分序列的同源性為82%。由此表明，可以初步推測(cè)該片段為一個(gè)銀杏的CO基因的cDNA片段。

圖3 銀杏總RNA提取及GbCOL基因PCR擴(kuò)增Fig.3 Total RNA of Ginkgo Biloba L.and the results of PCR product of GbCOL gene

圖4 GbCOL基因CDS序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.4 CDS sequence and derived amino acid sequence of GbCOL gene

2.3 GbCOL基因蛋白質(zhì)序列分析

利用DNAMAN對(duì)GbCOL 蛋白質(zhì)序列與其他植物CO蛋白質(zhì)序列進(jìn)行多序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)GbCOL蛋白質(zhì)序列與其他植物的CO蛋白的氨基酸序列之間有一定的相似性（圖5）。GbCOL氨基酸序列與麗江云杉Picea likiangensisCO蛋白序列的一致性為62%、與挪威云杉Picea abiesCO蛋白序列的一致性為61%，與日本落葉松Larix kaempferiCO蛋白序列的一致性為60%；與北美云杉Picea sitchensisCO蛋白序列的一致性為55%，與陸地棉Gossypium hirsutum、可可Theobroma cacao、麻風(fēng)樹(shù)Jatropha curcasCO蛋白序列的一致性均為51%。與小立碗蘚Physcomitrella patens、川桑Morus notabilis相應(yīng)CO蛋白序列的一致性均為50%?？梢酝茰y(cè)，GbCOL是CO蛋白質(zhì)家族成員之一；它與其他植物，特別是裸子植物中的CO蛋白質(zhì)的序列較為相似。

圖5 GbCOL與其他植物CO基因氨基酸序列多重比對(duì)Fig.5 Multiple alignment of deduced amino acid sequences of GbCOL and CO of other plants

利用ExPASy程序中的ProtParam工具對(duì)銀杏GbCOL基因蛋白的長(zhǎng)度、分子量、等電點(diǎn)等基本理化參數(shù)進(jìn)行了分析。預(yù)測(cè)顯示GbCOL蛋白質(zhì)分子量大小約45 kDa，等電點(diǎn)（pI）為5.80，分子式為C1958H3090N560O613S26，不穩(wěn)定系數(shù)為46.13，屬于不穩(wěn)定蛋白?？偲骄H水性為-0.286，推測(cè)為親水性蛋白。

2.4 GbCOL基因分子進(jìn)化分析

運(yùn)用 NCBI上的 Conserved Domains（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi） 程序在線(xiàn)預(yù)測(cè)GbCOL基因的蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域（圖6），發(fā)現(xiàn)GbCOL基因編碼的氨基酸序列有2個(gè)高度保守的B-box結(jié)構(gòu)域和CCT結(jié)構(gòu)域，具有典型的植物CO家族結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。

圖6 GbCOL 保守域分析Fig.6 Putative conserved domains analysis of GbCOL gene

CO基因家族根據(jù)保守序列B-box的數(shù)量可分為三類(lèi)[25-26]，第I類(lèi)含有2個(gè)B-box；第II類(lèi)只含有一個(gè)B-box；第III類(lèi)含有一個(gè)類(lèi)似B-box的結(jié)構(gòu)和一個(gè)差異較大的鋅指結(jié)構(gòu)域[27-28]。本研究克隆得到的GbCOL基因推測(cè)蛋白含有2個(gè)完整的B-box，屬于CO基因家族的第I類(lèi)。其具有完整的植物CO蛋白的結(jié)構(gòu)，含有B-box1、B-box2及CCT結(jié)構(gòu)域三個(gè)高度保守的區(qū)域。

從GbCOL和其他物種的CO基因的聚類(lèi)分析可以看出，GbCOL與樟子松Pinus sylvestris CO、挪威云杉Picea abiesCO和火炬松Pinus taedaL.CO等裸子植物CO基因可聚為一類(lèi)，芒果Mangifera indicaCO、馬鈴薯Solanum tuberosum CO、擬南芥Arabidopsis thalianaCO、煙草Nicotiana tabacum CO、可可Theobroma cacao CO、陸地棉Gossypium hirsutumCO、和蘋(píng)果Malus domesticaCO和牡丹Paeonia suffruticosa CO等被子植物CO基因聚為一類(lèi)（圖7）。由此可表明GbCOL與其他裸子植物CO基因同源性更高。

圖7 GbCOL與其他物種CO基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析Fig.7 Phylogenetic analysis of GbCOL and CO gene of other species

3 結(jié)論與討論

3.1 討 論

銀杏在我國(guó)擁有悠久的種植歷史，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、觀賞、保健等領(lǐng)域，但由于其童期較長(zhǎng)，一般需要生長(zhǎng)20 a才能開(kāi)花結(jié)果，這一生理特性嚴(yán)重制約了銀杏的推廣和應(yīng)用。近年來(lái)，隨著基因工程的發(fā)展和植物基因組學(xué)的深入研究，通過(guò)基因工程手段縮短植物童期，提前開(kāi)花結(jié)果，已經(jīng)成功的應(yīng)用于白樺Betula platyphyllaSuk.[29]、柑橘Citrus reticulataBlanco.[30]等植物中。因此，有理由相信縮短銀杏童期可以通過(guò)基因工程手段實(shí)現(xiàn)，而實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的關(guān)鍵在于挖掘功能強(qiáng)大的目標(biāo)基因。

銀杏開(kāi)花與其他植物開(kāi)花機(jī)制相似，由多種開(kāi)花相關(guān)基因調(diào)控，一起組成一個(gè)復(fù)雜的開(kāi)花調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[22,31]。光周期途徑是影響植物開(kāi)花調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的重要環(huán)境因子，而CO基因是光周期途徑中重要的開(kāi)花時(shí)間調(diào)控基因[32-37]，CO基因通過(guò)調(diào)控FT基因的表達(dá)來(lái)調(diào)控植物的開(kāi)花時(shí)間[38-39]，許多研究已證明CO基因?qū)τ谥参镩_(kāi)花時(shí)間影響很大?，F(xiàn)階段已經(jīng)從黑麥草Lolium perenne[40]、番茄Solanum lycopersicum[41]、大豆Glycine max[42]、大麥Hordeum vulgare[43]、馬鈴薯[44]、牽牛花Pharbitis nil[45]、水稻Oryza sativa[46]等植物上克隆得到CO同源基因，但由于物種間CO基因的功能和結(jié)構(gòu)差異，在不同物種和不同條件下其功能可能也有不同[47]，如水稻的CO-LIKE基因在短日照條件下促進(jìn)開(kāi)花，而在長(zhǎng)日照條件下反而抑制開(kāi)花[48-51]。目前CO基因在銀杏開(kāi)花過(guò)程中的調(diào)控機(jī)理尚不明確，進(jìn)一步研究不同物種中的CO同源基因功能，有望為闡明CO基因調(diào)控植物開(kāi)花的分子機(jī)理提供新的理論依據(jù)。

在擬南芥中，CO基因在光周期調(diào)控方面發(fā)揮重要的作用，可在特定的光照強(qiáng)度和長(zhǎng)度下，誘導(dǎo)和調(diào)控FT、SOC1等開(kāi)花相關(guān)基因的表達(dá)，從而促進(jìn)擬南芥開(kāi)花[34]。本研究對(duì)銀杏中的COLIKE基因進(jìn)行了基因克隆及生物信息學(xué)分析，推測(cè)GbCOL也具有調(diào)控開(kāi)花的功能，但該基因調(diào)節(jié)銀杏開(kāi)花的具體調(diào)控機(jī)制仍不明確，需要做進(jìn)一步的功能驗(yàn)證。

3.2 結(jié) 論

本研究通過(guò)對(duì)不同時(shí)期銀杏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和差異表達(dá)基因篩選得到7個(gè)CO相關(guān)基因，對(duì)這些CO相關(guān)基因開(kāi)花前后表達(dá)量進(jìn)行分析，篩選出1個(gè)可能與開(kāi)花調(diào)控相關(guān)的CONSTANS-LIKE基因，使用RT-PCR技術(shù)從銀杏葉片cDNA中克隆得到該基因的完整CDS（1 239 bp），將其命名為GbCOL，利用DNAMAN、MEGA7等軟件對(duì)GbCOL的序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。多重比較結(jié)果顯示GbCOL與其他植物中的CO基因，尤其是和裸子植物中的CO基因同源性較高。分子進(jìn)化分析表明GbCOL與裸子植物CO基因親緣關(guān)系較近。蛋白保守性預(yù)測(cè)分析表明，GbCOL具有CO基因家族典型的B-box和CCT結(jié)構(gòu)域，根據(jù)N末端B-box結(jié)構(gòu)特征可將GbCOL歸屬于CO基因家族的第I類(lèi)。

銀杏GbCOL基因完整CDS序列的成功克隆，為銀杏早花品種選育提供了目標(biāo)基因，也為進(jìn)一步研究CO基因家族基因的調(diào)控機(jī)制和銀杏的開(kāi)花機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。