盧培剛 董元 李博 王奎重 郝振強(qiáng) 仇冠中 曹敬正

近年來，離子通道在膠質(zhì)瘤基礎(chǔ)生物學(xué)中的作用日益受到關(guān)注[1]。ClC-3屬于電壓門控氯通道家族（votage-gated chloride channels，ClCs），是容積敏感性外向整流性氯通道的主要成員，參與介導(dǎo)細(xì)胞氯離子外流，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲性生長過程中發(fā)揮重要作用[2-3]。BK通道又稱大電導(dǎo)鈣激活鉀通道或KCa1.1通道，受細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度以及細(xì)胞去極化的雙重調(diào)控，對細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化尤為敏感，參與包括膠質(zhì)瘤細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞的行為學(xué)改變[4]。本研究旨在進(jìn)一步驗(yàn)證ClC-3以及BK通道在膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型中的表達(dá)情況，并探討其在膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲性生長過程中的重要作用，以期獲得直接的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性成年Wistar大鼠（6周，體質(zhì)量約180 g）70只，購于山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證編號 SCXK(魯)2013-0009。

二、主要試劑及用品

C6大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞株（中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫）；HPIAS-1000高清晰病理圖文分析系統(tǒng)(OLYMPUS公司，日本)；動(dòng)物立體定向儀(上海江灣Ⅱ型)；ClC-3特異性阻斷劑 Chlorotoxin（CLTX，AnaSpec公司，美國），BK特異性阻斷劑Iberiotoxin（IBTX，Alomone Labs公司， 以色列）；10%胎牛血清(Gibco公司，美國)；一抗：ClC-3兔多克隆抗體1∶300，BK 兔單克隆抗體 1∶100。

三、實(shí)驗(yàn)方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：將70只Wistar大鼠隨機(jī)分為5組。A組：實(shí)驗(yàn)組20只，常規(guī)制備荷瘤動(dòng)物模型，5只用于腫瘤大體病理變化觀察，另外15只用于免疫組織化學(xué)觀察ClC-3以及BK通道在C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的表達(dá)情況，并計(jì)算成瘤體積作為陽性對照；B組：荷瘤模型組15只，在移植腫瘤細(xì)胞同時(shí)加入ClC-3特異性阻斷劑CLTX；C組：荷瘤模型組15只，在移植腫瘤細(xì)胞同時(shí)加入BK特異性阻斷劑IBTX；D組：假手術(shù)組15只，手術(shù)時(shí)使用DMEM替代腫瘤細(xì)胞液注入成瘤區(qū)作為陰性對照；E組：空白對照組5只，常規(guī)飼養(yǎng)，不做任何處理，用于正常腦組織的免疫組織化學(xué)檢測。

2.荷瘤動(dòng)物模型制備：C6大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞株培養(yǎng)后，消化收集生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，離心（78 g，5 min）棄上清，PBS緩沖液重懸；計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞密度，調(diào)整細(xì)胞密度為5×107/mL；10%水合氯醛（4 mL/kg）腹腔注射麻醉Wistar大鼠，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物固定于大鼠腦立體定向儀，根據(jù)大鼠頭部立體定向解剖圖譜確定對應(yīng)于右側(cè)尾狀核的鉆孔位置：向右旁開3.0mm，冠狀縫前0.5 mm。切開頭皮，鉆頭打磨顱骨，微量注射器刺穿硬腦膜。微量注射器抽取C6細(xì)胞懸液10 μL（5×105細(xì)胞），深6 mm回退1 mm處注射，注射完畢后針頭靜置10 min后緩慢拔出，骨蠟封閉骨孔，縫合頭皮，術(shù)畢清潔級常規(guī)飼養(yǎng)。B和C組在注射的C6細(xì)胞懸液中分別加入50 pmol ClC-3特異性阻斷劑ClTX及BK特異性阻斷劑IBTX。

3.標(biāo)本處理：A、B、C 組于接種后 7、14、21 d 隨機(jī)選取5只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物斷頭處死，取出全腦，分別觀察各組動(dòng)物膠質(zhì)瘤細(xì)胞的病理形態(tài)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及侵襲性生長的變化情況，同時(shí)檢測ClC-3、BK型離子通道在各組模型動(dòng)物中的表達(dá)分布情況；假手術(shù)D組亦于術(shù)后7、14、21 d隨機(jī)選取5只動(dòng)物處死。

4.觀察與檢測：（1）接種后動(dòng)物處理及一般情況觀察：大鼠接種后置籠自然蘇醒，常規(guī)飼養(yǎng)，連續(xù)7 d皮下注射青霉素；每天觀察動(dòng)物的進(jìn)食、飲水、運(yùn)動(dòng)及精神等狀態(tài)，測量體質(zhì)量1次/2 d，記錄死亡時(shí)間；（2）組織病理學(xué)檢查：大鼠用10%水合氯醛麻醉后，經(jīng)左心室快速灌注0.9%NaCl，再灌注4℃的4%多聚甲醛。取出全腦后，按大鼠腦表面的接種穿刺點(diǎn)為中心做冠狀切口，觀察腫瘤生長情況。取出后置于4%多聚甲醛在4℃狀態(tài)下后固定3～4 d。組織標(biāo)本經(jīng)脫水、包埋后取 3 μm 切片，HE 染色；（3）免疫組織化學(xué)檢查：腫瘤石蠟切片經(jīng)脫蠟后，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，ClC-3兔多克隆抗體1∶100，BK兔單克隆抗體1∶100。觀察建模14 d后ClC-3通道、BK通道在大鼠C6腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況；（4）普通光學(xué)顯微鏡下觀察腫瘤的體積，以400×光鏡隨機(jī)選擇視野進(jìn)行檢測：A、B、C組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)選取5只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)本，每個(gè)標(biāo)本選取腫瘤最大截面，病例切片使用Visual Basic 6.0軟件測量腫瘤的長度與寬度[5-6]。腫瘤體積計(jì)算公式V=長×寬×寬/2[7-8]。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，各組荷瘤動(dòng)物不同時(shí)間點(diǎn)成瘤體積采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示組間差異，兩兩比較應(yīng)用成組t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、一般情況觀察

Wistar大鼠接種C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的成功率均為100%。A組動(dòng)物于接種細(xì)胞后第2天自行覓食，飲水較E組動(dòng)物減少，體質(zhì)量及警覺性有所下降；約14 d出現(xiàn)毛發(fā)紊亂、行動(dòng)遲緩、體質(zhì)量下降、活動(dòng)減少、接觸反應(yīng)減弱，偶有抽搐、肢體偏癱，運(yùn)動(dòng)時(shí)身體向一側(cè)偏斜、雙眼突起等，體質(zhì)量增長緩慢。B組接種細(xì)胞后10 d內(nèi)，大鼠活動(dòng)進(jìn)食均無明顯異常，體質(zhì)量均有所增加，反應(yīng)較A組好；C組接種細(xì)胞后與A組無明顯差別；D組未見腫瘤形成。

二、組織病理學(xué)檢查

如圖1所示，大鼠建模成功后14 d，A組大鼠腫瘤標(biāo)本無包膜，邊界輪廓稍模糊，顯微鏡下觀察腫瘤細(xì)胞呈圓形，梭形或多角形，腫瘤細(xì)胞排列紊亂，可見生長活躍的膠質(zhì)瘤細(xì)胞密集成群，并向正常腦組織浸潤生長，腦組織與腫瘤交界處可見腫瘤細(xì)胞侵入腦實(shí)質(zhì)，邊界較模糊，細(xì)胞核呈圓形或不規(guī)則形，染色質(zhì)深染，核分裂相較多，中心部位由于腫瘤生長過快可見壞死。B組大鼠成瘤體積小，瘤細(xì)胞密度低，腦組織有腫瘤細(xì)胞浸潤，仍可見一個(gè)較明顯的界限，血供一般，瘤中心壞死細(xì)胞較少。C組大鼠成瘤體積同A組無明顯變化，腫瘤細(xì)胞生長活躍的膠質(zhì)瘤細(xì)胞密集成群，并向正常腦組織浸潤生長，腦組織與腫瘤交界處可見腫瘤細(xì)胞侵入腦實(shí)質(zhì)，邊界較模糊。D組動(dòng)物注射區(qū)周圍未見腫瘤細(xì)胞生長。E組為正常腦組織形態(tài)。

三、免疫組織化學(xué)檢查

ClC-3以及BK通道在正常腦組織中均有表達(dá)。ClC-3離子通道蛋白在C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞系呈高度表達(dá)；而BK離子通道蛋白表達(dá)相對較低，如圖2所示。

四、各組荷瘤動(dòng)物成瘤體積的比較

B組應(yīng)用Chlorotoxin后，荷瘤動(dòng)物的成瘤體積在各個(gè)觀察期與A組比較均顯著降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而 C組應(yīng)用 Iberiotoxin后，荷瘤動(dòng)物的成瘤體積在各個(gè)觀察期與A組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。具體內(nèi)容見表1。

討 論

惡性膠質(zhì)瘤是一種致死性極高且最為常見的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤，約占33.3%～58.6%[9]。近年來，雖然惡性腦膠質(zhì)瘤的治療效果有一定的提高，但是中位生存期仍僅為9～12個(gè)月，5年的生存期仍不能超過10%[10]。影響患者生存期的主要原因是膠質(zhì)瘤在中樞神經(jīng)系統(tǒng)呈侵襲性生長，腫瘤界限不清，使手術(shù)切除程度受限。因此，腦膠質(zhì)瘤治療的進(jìn)展在很大程度上仍有賴于針對其侵襲性生長的臨床治療研究。

圖1 假手術(shù)組及各載瘤模型動(dòng)物腦C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞團(tuán)的病理學(xué)特點(diǎn)（HE染色，×40）

圖2 ClC-3和BK通道在正常腦組織以及腦C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞團(tuán)中的表達(dá)分布情況（免疫組織化學(xué)染色，×400）

表1 各組荷瘤動(dòng)物不同時(shí)間點(diǎn)成瘤體積比較（mm3，Mean±SD）

建立可靠的動(dòng)物模型是進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)，大鼠C6腦膠質(zhì)瘤同種移植瘤動(dòng)物模型是腦膠質(zhì)瘤實(shí)驗(yàn)研究中應(yīng)用最為廣泛的模型之一[11]。大鼠腦內(nèi)接種后腫瘤形成較快，種植腫瘤成活率較高，而且生長特點(diǎn)與人較為接近，所以廣泛應(yīng)用于腦膠質(zhì)瘤治療的實(shí)驗(yàn)研究[12-13]。Wistar大鼠是人類試驗(yàn)的代替品，該大鼠性情較為溫和，生活習(xí)性繁殖規(guī)律容易受到外界的氣溫、氣壓、濕度及噪聲等方面的影響。Wistar大鼠具有優(yōu)良的抵制傳染病能力和低自發(fā)性腫瘤發(fā)生率，是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)大鼠類最為常用的品種。

目前已知一些重要的離子通道（如gBK、ClC-2、ClC-3等）在惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞中呈特征性分布，直接參與膠質(zhì)瘤細(xì)胞在侵襲性生長過程中的細(xì)胞形變。傳統(tǒng)的治療策略主要針對于膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲微環(huán)境的變化，以瘤細(xì)胞侵襲相關(guān)性離子通道為治療靶點(diǎn)，從直接改變膠質(zhì)瘤細(xì)胞本身侵襲能力的角度出發(fā)，很可能大大提高惡性膠質(zhì)瘤治療的時(shí)效性。針對膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲相關(guān)性離子通道篩選或者開發(fā)出的各種高結(jié)合力特異型試劑，能夠有效地降低其對周圍正常腦細(xì)胞和組織的損害。在體外實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用ClC-3型通道的特異性阻斷肽ClTX，其和膠質(zhì)瘤細(xì)胞結(jié)合后能夠顯著地延緩和縮短瘤細(xì)胞的遷移速度和距離[14]。筆者前期體外Transwell細(xì)胞實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，應(yīng)用ClTX后透過小孔的U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞數(shù)目減少[15]。本實(shí)驗(yàn)在前期體外實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，觀察BK及ClC-3離子通道在正常腦組織細(xì)胞系及C6膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)及分布情況，分別運(yùn)用ClC-3特異性阻滯劑ClTX以及BK通道特異性阻滯劑IBTX觀察荷瘤動(dòng)物成瘤體積的變化情況。研究結(jié)果顯示，C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞系均高度表達(dá)ClC-3離子通道蛋白，BK離子通道蛋則表達(dá)相對較低。成瘤體積的比較進(jìn)一步證實(shí)運(yùn)用ClC-3通道特異性阻滯劑ClTX后，膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲性生長特性顯著降低。上述結(jié)果表明，相對BK通道，ClC-3通道在膠質(zhì)瘤侵襲性生長過程中發(fā)揮更重要的作用，抑制ClC-3通道可有效降低膠質(zhì)瘤侵襲性。就BK通道而言，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其在膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲性生長中的作用有限，這與某些研究報(bào)道結(jié)果并不完全相符。原因可能是在不同的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中，BK通道表達(dá)及功能可能存在差異；ClC-3通道特異性阻滯劑，可能直接影響腫瘤細(xì)胞的活性，其有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，緊緊圍繞上述侵襲相關(guān)性離子通道，探尋以其為靶標(biāo)的新型治療策略將在惡性膠質(zhì)瘤侵襲性治療中具有重要意義。