李繼慧 覃運(yùn)榮 梁毅

地中海貧血（簡(jiǎn)稱地貧）是世界上最常見(jiàn)的血紅蛋白病之一，主要是由于遺傳性珠蛋白基因缺失或點(diǎn)突變導(dǎo)致血紅蛋白中一種或一種以上珠蛋白鏈合成缺失和/或不足而引起的貧血，也稱為珠蛋白生成障礙性貧血［1］。按照存在缺陷的珠蛋白基因的種類，地中海貧血一般可以分為α?、β?、δβ?和εγδβ?等類型，其中α?和β?地貧是最為常見(jiàn)的2種地貧類型［1］。地中海貧血好發(fā)于地中海、中東、南亞次大陸和東南亞等地區(qū)，在我國(guó)四川、云南、廣西、貴州、廣東等南部地區(qū)也較為常見(jiàn)［2］。地貧患者具有廣泛的臨床表現(xiàn)，可從幾乎無(wú)癥狀到需要終身輸血并伴隨多器官系統(tǒng)并發(fā)癥的重度貧血，并會(huì)遺傳給下一代，給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)［3］。目前對(duì)于地貧的治療一般是根據(jù)其類型采用相應(yīng)的治療方案，而α?重型地貧（通常是指Hb?Bart's胎兒水腫綜合征）及β?重型地貧尚無(wú)有效、經(jīng)濟(jì)的治療方法［4?5］。因此使用經(jīng)濟(jì)、高效、準(zhǔn)確的診斷方法及早對(duì)地貧進(jìn)行篩查和判斷其類型，不僅有利于臨床對(duì)該病的治療，還能夠引導(dǎo)患者及時(shí)進(jìn)行產(chǎn)前診斷，以避免重型地貧患兒的出生，對(duì)減緩家庭和社會(huì)壓力以及實(shí)現(xiàn)優(yōu)生優(yōu)育具有重要的意義。本文將就目前地貧的實(shí)驗(yàn)室分子診斷技術(shù)的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 地中海貧血的分子診斷技術(shù)

根據(jù)地中海貧血的分子學(xué)機(jī)制，越來(lái)越多的分子診斷技術(shù)相繼被應(yīng)用于臨床。據(jù)報(bào)道，多數(shù)α?地貧（約95%）及部分β地貧（約5%）是由于基因缺失引起的，這些缺失的傳統(tǒng)檢測(cè)方法是印記雜交技術(shù)（Southern blot），然而該技術(shù)操作繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，已被基于基因擴(kuò)增的方法所代替［6］。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)是檢測(cè)缺失型地貧最常用的方法［7］。此外，多種以PCR為基礎(chǔ)的分子檢測(cè)技術(shù)可用于已知珠蛋白基因突變的地中海貧血的基因診斷，以及多種其他方法可用于未知突變的地中海貧血基因診斷［8］。

1.1 以PCR為基礎(chǔ)的分子診斷技術(shù)

1.1.1 裂隙聚合酶鏈反應(yīng)

近年來(lái)，裂隙聚合酶鏈反應(yīng)（gap polymerase chain reaction，Gap?PCR）技術(shù)已成為普遍應(yīng)用于已知的、常見(jiàn)的缺失型α?地貧的檢測(cè)手段［9］。其原理是于缺失序列的兩端設(shè)計(jì)一對(duì)引物，在正常序列中這對(duì)上下游引物間距過(guò)遠(yuǎn)，以至超出有效擴(kuò)增范圍而不能生成擴(kuò)增產(chǎn)物。大片段缺失的存在會(huì)使斷端連接，上下游引物靠近，可以生成特定長(zhǎng)度的擴(kuò)增產(chǎn)物［10］。α?地貧主要是由于不同長(zhǎng)度的基因缺失導(dǎo)致的，可以優(yōu)先選擇Gap?PCR進(jìn)行檢測(cè)［8］。唐笑等人［11］采用Gap?PCR法對(duì)湖南地區(qū)的7 914 例外周靜脈血標(biāo)本進(jìn)行α?地貧基因缺失檢測(cè)，檢出α地貧1 380例，檢出率為17.44%。戴慶福等人［12］對(duì)823例血常規(guī)指標(biāo)異常的病人進(jìn)行地貧基因檢測(cè)7，采用 Gap?PCR 檢測(cè) 3 種（??SEA、?α3.7、?α4.2）缺失型α?地中海貧血，結(jié)果1 225例為缺失型α?地中海貧血。Gilad等［9］也選擇Gap?PCR法檢測(cè)常見(jiàn)的缺失型α?地貧，并獲得較高的檢出率。上述研究團(tuán)隊(duì)的結(jié)果都顯示了Gap?PCR法對(duì)于常見(jiàn)的缺失型α?地貧的檢測(cè)具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值，是實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)常見(jiàn)的缺失型α?地貧的常用方法。

除了應(yīng)用于缺失型α?地中海貧血基因檢測(cè)外，Gap?PCR法還能診斷一些大片段的β?地貧基因缺失［13］。然而，Gap?PCR 的結(jié)果判讀需進(jìn)行瓊脂糖電泳，不但會(huì)造成實(shí)驗(yàn)室核酸染料污染，而且電泳檢測(cè)通量非常低并難以自動(dòng)化，難以應(yīng)用于大樣本量檢測(cè)［14］。

1.1.2 反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)

目前，已知的β?地中海貧血突變有200種以上，其中以單堿基替換、插入或缺失為主。一些大片段的β?基因缺失已經(jīng)被人們發(fā)現(xiàn)，這些大片段的缺失多數(shù)可用Gap?PCR法進(jìn)行診斷［13］。而反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)（reverse?dot?blotting，RBD），被廣泛應(yīng)用于突變型β?地中海貧血的檢測(cè)，其原理是將擴(kuò)增的DNA與固定在尼龍?jiān)鷰系耐蛔兲禺愋蕴结橂s交［8］。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和探針通過(guò)分子雜交反應(yīng)及顯色反應(yīng)，觀察檢測(cè)膜條上各位點(diǎn)信號(hào)的有無(wú)，判斷該探針是否與PCR產(chǎn)物雜交，從而確定待檢樣品的基因型［12］。

1.1.3 其他PCR方法

除了Gap?PCR、反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)外，多種以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的方法也得到了臨床應(yīng)用。其中，高分辨熔解曲線分析系統(tǒng)是一種高通量的突變篩選方法，是一種全新β?地中海貧血突變掃描和基因分析的遺傳分析方法，其特點(diǎn)是高特異性和高靈敏度，在大樣本、多突變位點(diǎn)篩查上比傳統(tǒng)非均一性方法更方便、性價(jià)比更高，相比定量探針?lè)ㄍ蛔兎治龊推渌愋涂焖偻蛔兎治龇?，?yīng)用面更廣，成本更低［15］。擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)（amplification refracto?ry mutation system，ARMS）在一些實(shí)驗(yàn)室中也得到應(yīng)用，它快速、經(jīng)濟(jì)、方便地同時(shí)檢測(cè)多個(gè)突變［8］。

目前，基于PCR法的Gap?PCR和反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)在臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用成熟，準(zhǔn)確度高，且檢測(cè)成本相對(duì)較低，故已作為主流技術(shù)得到普及。但其也存在一些缺點(diǎn)，例如實(shí)驗(yàn)過(guò)程產(chǎn)生污染，操作繁瑣，自動(dòng)化程度低等，尤其是Gap?PCR和反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)目前主要是針對(duì)已知的常見(jiàn)地貧類型的檢測(cè)，對(duì)于罕見(jiàn)型地貧等地貧類型檢出率低，對(duì)于未知類型地貧容易導(dǎo)致漏檢。

1.2 多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)（multiplex ligation?dependent probe amplification，MLPA）

MLPA是一種探針依賴擴(kuò)增技術(shù)，僅需20～200 ng的DNA量，單管即可檢測(cè)多達(dá)50個(gè)位點(diǎn)的拷貝數(shù)變異［16］?；驹硎前涯康幕驈?fù)制到依賴探針上，再用一對(duì)通用引物擴(kuò)增捕獲到的目的片段，通過(guò)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳分析得出目的片段異常的結(jié)果。MLPA可快速的定量分析所檢測(cè)范圍內(nèi)的缺失或重復(fù)，且已被證明可以找到經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)診斷儀器檢測(cè)尚不能找到的已知或者未知的缺失［17］。

對(duì)于未知突變的α?地貧，仍有部分實(shí)驗(yàn)室在使用印記雜交技術(shù)；然而MLPA逐漸取代了Southern印記雜交技術(shù)，原因是其高靈敏度、高可靠性，且無(wú)需使用放射性方法等優(yōu)點(diǎn)［18］。Yuregir等人［19］對(duì) 30名血液學(xué)參數(shù)提示為α?地貧而傳統(tǒng)的反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)（RDB）檢測(cè)結(jié)果為陰性的病人使用MLPA技術(shù)檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，30名病人中有3人（10%）存在α?珠蛋白基因缺失。Gilad等［9］的研究也發(fā)現(xiàn)采用Gap?PCR法檢測(cè)常見(jiàn)缺失型α?地貧，聯(lián)合使用MLPA技術(shù)檢測(cè)罕見(jiàn)地貧可提高地貧檢出率。由此可見(jiàn)，與常規(guī)的基于PCR的技術(shù)相比，MLPA對(duì)于罕見(jiàn)或未知類型的缺失型α?地貧有著更高的檢出率。雖然MLPA技術(shù)對(duì)于突變型地貧的應(yīng)用有較大的局限性，但如果將常規(guī)檢測(cè)方法與MLPA技術(shù)聯(lián)合使用，就能在一定程度上彌補(bǔ)常規(guī)檢測(cè)方法在罕見(jiàn)或未知缺失型α?地貧類型上的空缺，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確率，減少漏檢的可能。

1.3 基因芯片技術(shù)

基因芯片技術(shù)的原理是將大量的寡核苷酸片段或DNA片段有序排列在固相載體上，稱之為基因芯片或DNA陣列，同時(shí)提取待測(cè)樣品DNA，與芯片雜交，然后掃描芯片的熒光強(qiáng)度，應(yīng)用生物信息學(xué)分析結(jié)果，最后得到樣品中基因序列和表達(dá)水平的相關(guān)信息。王沙燕等［20］采用基因芯片技術(shù)對(duì)40例標(biāo)本進(jìn)行β?地貧基因檢測(cè)，結(jié)果29例檢測(cè)出為β?地貧的患者，7例為雙重雜合子或純合子。陳林興等［21］對(duì)經(jīng)初篩為β?地貧的32例患者進(jìn)行基因芯片檢測(cè)，并與斑點(diǎn)雜交法進(jìn)行比較分析，結(jié)果基因芯片檢出32例β?地貧，斑點(diǎn)雜交法檢出30例，他們認(rèn)為基因芯片法具有快速、高效、自動(dòng)化程度高且簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，提倡推廣應(yīng)用。區(qū)小冰等［22］應(yīng)用基因芯片技術(shù)對(duì)62例初篩診斷為α?地貧，93例初篩診斷為β?地貧（輕型60例，重型33例）的患兒血樣標(biāo)本進(jìn)行α及β珠蛋白的基因分析，結(jié)果成功檢測(cè)出中國(guó)人中常見(jiàn)的3種缺失型α?地貧，2種非缺失型α?地貧（HbCS，HbQS）的雜合子、純合子及雙重雜合子。在60例輕型β?地貧，33例重型β地貧的126條染色體中共檢測(cè)到8種突變類型；在60例β?地貧雜合子中檢測(cè)到8例（13.3%）及33例重型β?地貧中檢測(cè)到2例（6%）同時(shí)復(fù)合有α?地貧基因，可見(jiàn)，相對(duì)于常規(guī)的基于PCR的技術(shù)來(lái)說(shuō)，基因芯片技術(shù)不僅可以同時(shí)檢測(cè)α?與β?地貧，具有更高的效率，且自動(dòng)化程度高。然而，基因芯片技術(shù)雖然具有較大的優(yōu)勢(shì)，但其作為一種新興技術(shù)應(yīng)用在地中海貧血檢測(cè)方面尚不夠成熟，較高的檢測(cè)成本目前也限制其在臨床上的大規(guī)模推廣應(yīng)用。

1.4 高通量測(cè)序

繼Sanger測(cè)序之后，二代測(cè)序（next?generation sequencing，NGS）將測(cè)序能力從幾百個(gè)堿基對(duì)增加到數(shù)千個(gè)。NGS基于對(duì)克隆擴(kuò)增的DNA分子大規(guī)模并行測(cè)序，再加上足夠的計(jì)算能力和相應(yīng)的軟件進(jìn)行有效的數(shù)據(jù)分析，將基因診斷以可承受的價(jià)格引入臨床實(shí)踐［23］。它可以應(yīng)用于整個(gè)基因組、全外顯子組，以及全基因組的特殊目的范圍［23］。

宋春林等［24］以1 368例疑似地中海貧血患者為研究對(duì)象，采用二代高通量測(cè)序儀進(jìn)行地中海貧血基因檢測(cè)，同時(shí)以Gap?PCR和RDB?PCR方法檢測(cè)常見(jiàn)地貧突變，以Sanger測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果共檢出523例（38.2%）共25種地貧基因突變，使用常規(guī)基因檢測(cè)方法陰性而NGS測(cè)序陽(yáng)性的標(biāo)本，經(jīng)Sanger測(cè)序驗(yàn)證與NGS結(jié)果一致，他們認(rèn)為高通量測(cè)序在地貧檢測(cè)上值得推廣。

然而也有報(bào)道稱目前文獻(xiàn)中未發(fā)現(xiàn)NGS技術(shù)有可用的珠蛋白基因測(cè)序數(shù)據(jù)［8］?？梢?jiàn)NGS技術(shù)用于地中海貧血的基因診斷還缺少大量的研究驗(yàn)證。

2 小結(jié)

地中海貧血是最常見(jiàn)的具有遺傳性的血紅蛋白病之一，危害著人類健康，也影響了新生人口的素質(zhì)。隨著醫(yī)療水平的不斷提高，地中海貧血的檢測(cè)技術(shù)在不斷的提升。實(shí)驗(yàn)室對(duì)于常見(jiàn)的α?地貧及β?地貧基因檢測(cè)技術(shù)主要是基于PCR法的Gap?PCR和反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)，但這些常規(guī)技術(shù)也存在一定的局限性，影響著地貧的檢出率。隨著科技的發(fā)展，地中海貧血的致病分子機(jī)制不斷被發(fā)現(xiàn)，各種新技術(shù)也隨之發(fā)展起來(lái)，以提高地貧的檢出率，如多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)、基因芯片技術(shù)、高通量測(cè)序等技術(shù)。而每種技術(shù)都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，如MLPA主要是用來(lái)檢測(cè)缺失型的地貧類型，檢測(cè)效率較快，成本相對(duì)較低，但對(duì)于突變型地貧的應(yīng)用則有較大的局限性；基因芯片及高通量測(cè)序的檢測(cè)深度較高，但同時(shí)成本也較高，不適用于大規(guī)模的臨床推廣使用，且基因芯片及高通量測(cè)序技術(shù)在地貧基因檢測(cè)上的應(yīng)用尚不夠成熟，在該方面的應(yīng)用價(jià)值還有待更多考究。目前國(guó)內(nèi)多個(gè)地中海貧血高發(fā)地區(qū)享有政府的地貧基因檢測(cè)補(bǔ)助，尤其是產(chǎn)前診斷，當(dāng)使用常規(guī)的基于PCR法技術(shù)來(lái)檢測(cè)時(shí)，病人自費(fèi)比例可以降到很低，甚至免費(fèi)；而若采用其他方法，特別是基因芯片或高通量測(cè)序技術(shù)，則產(chǎn)生費(fèi)用過(guò)高而增加病人的負(fù)擔(dān)，病人的依從性可能降低，從而降低了病人的檢測(cè)積極性，不利于引導(dǎo)地貧患者的產(chǎn)前診斷遺傳咨詢。此外，是否有必要對(duì)病人進(jìn)行常見(jiàn)的α?地貧及β?地貧基因以外的地貧基因檢測(cè)也仍有待探討。新興的技術(shù)目前或許還不能取代常規(guī)的基于PCR法的檢測(cè)技術(shù)，但可以作為常規(guī)技術(shù)的一種補(bǔ)充，彌補(bǔ)常規(guī)技術(shù)的不足。因此，充分了解每種技術(shù)的應(yīng)用范圍及局限性，結(jié)合各自實(shí)驗(yàn)室的具體情況，尋找到準(zhǔn)確、高效、經(jīng)濟(jì)的診斷方案，對(duì)于各高發(fā)地區(qū)預(yù)防中重型地中海貧血患兒的出生及提高新生人口素質(zhì)具有積極且深遠(yuǎn)的意義。

參考文獻(xiàn)

［1］Martin A，Thompson A A.Thalassemias［J］.Pediatr Clin North Am，2013，60（6）：1383?1391.

［2］杜萌，朱寶生，呂濤.地中海貧血致病機(jī)制及基因治療進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)動(dòng)物防制，2017，33（1）：58?61.

［3］Weatherall DJ.Thalassemias［J］.Brenner's Encyclope?dia of Genetics，2013，7（2）：60?62.

［4］Piel FB ，Weatherall DJ.The alpha?thalassemias［J］.N Engl J Med，2014，371（20）：1908?1916.

［5］Joly P，Pondarre C，Badens C.Beta?thalassemias：mo?lecular，epidemiological，diagnostical and clinical as?pects［J］.Ann Biol Clin（Paris），2014，72（6）：639?668.

［6］Greene DN，Vaughn CP，Crews BO，et al.Advances in detection of hemoglobinopathies［J］.Clinica Chimi?ca Acta，2015，439（2015）：50?57.

［7］Kho SL，Chua KH，George E，et al.A novel gap?PCR with high resolution melting analysis for the detection of α?thalassaemia Southeast Asian and Filipino β0?thal?assaemia deletion［J］.Scientific Reporpts，2015，5：13937.

［8］Brancaleoni V，di Pierro E，Motta I，et al.Laboratory diagnosis of thalassemia［J］.IntJnlLabHem，2016，38（S1）：32?40.

［9］Gilad O，Shemer OS，Dgany O，et al.Molecular diag?nosis of α ?thalassemia in a multiethnic population［J］.Eur J Haematol，2017，98（6）：553?562.

［10］秦丹卿，何天文，尹愛(ài)華.地中海貧血產(chǎn)前基因診斷技術(shù)的臨床應(yīng)用［J］.分子診斷與治療雜志，2017，9（4）：223?227.

［11］唐笑，劉岱璿，周梅華.湖南地區(qū)地中海貧血基因檢測(cè)結(jié)果及突變類型分析［J］.中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志，2017，25（4）：32?33.

［12］戴慶福，李曉璐，王玉霞，等.中國(guó)福建省龍巖地區(qū)地中海貧血基因突變類型的分析［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2017，25（2）：498?502.

［13］Higgs DR，Engel JD，Stamatoyannopoulos G.Thal?assaemia［J］.Lancet，2012，379（9813）：373?383.

［14］駱明勇，胡聽(tīng)聽(tīng)，王繼成，等.PCR?RDB的地中海貧血基因復(fù)合型檢測(cè)方法的臨床應(yīng)用［J］.中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志，2016，24（4）：22?24.

［15］唐娟，張崇林，蔣群芳，等.地中海貧血基因診斷技術(shù)進(jìn)展及無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷的研究［J］.中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志，2015，23（12）：5?6.

［16］Lescoat D，Jouan H，Loeuillet?Olivio L，et al.Fluores?cent in situ hybridization（FISH）on paraffin?embedded placental tissues as an adjunct for understanding the eti?ology of early spontaneous abortion［J］.Prenat.Diagn，2005，25（4）：314?317.

［17］Harteveld CL，Voskamp A，Phylipsen M，et al.Nine unknown rearrangements in 16p 13.3 and 11p 15.4 caus?ing alpha?and beta?thalassaemia characterised by high resolution multiplex ligation dependent probe amplifica?tion［J］.J Med Genet，2006，42（12）：922?931.

［18］Harteveld CL.State of the art and new developments in molecular diagnostics for haemoglobinopathies in multi?ethnic societies［J］.Int J Lab Hematol，2014，36（1）：1?12.

［19］Yuregir OO，Ayaz A，Yalcintepe S，et al.Detection of a?thalassemia by using multiplex ligation dependent probe amplification as an additional method for rare mu?tations in Southern Turkey［J］.Indian J Hematol Blood Transfus，2016，32（4）：454?459.

［20］王沙燕，蔡佩欣，張阮章，等.基因芯片用于檢測(cè)β地中海貧血［J］.中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志，2015，23（12）：5?6.

［21］陳林興，鄭慶棠，陳澤欽.β地中海貧血的基因芯片檢測(cè)［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué)臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊(cè)，2005，26（7）：409?410.

［22］區(qū)小冰，張力，余一平，等.基因芯片診斷地中海貧血的研究［J］.中華兒科雜志，2005，43（1）：33?34.

［23］Lohmann K，Klein C.Next generation sequencing and the future of genetic diagnosis［J］.Neurotherapeutics，2014，11（4）：699?707.

［24］宋春林，劉正平，陳淑芬，等.二代高通量測(cè)序儀在大規(guī)模地中海貧血基因檢測(cè)的應(yīng)用價(jià)值［J］.中國(guó)醫(yī)療設(shè)備，2016，31（S1）：15.