張慶顏 董小玉 臧乃亮 徐偉文

規(guī)律成簇的短回文重復(fù)序列（clustered regular?ly intespaced short palindromic repeats，CRISPR）/（CRISPR associated 9，Cas9）系統(tǒng)是在原核生物中發(fā)現(xiàn)的一種適應(yīng)性免疫機(jī)制，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)的相關(guān)領(lǐng)域，成為繼鋅指核酸酶（Zinc finger nuclease，ZFN）和轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（transcription activator?like effector nucleases，TALEN）技術(shù)后的第三代基因編輯工具。該系統(tǒng)靶向精確、價(jià)格低廉、構(gòu)建簡單并可同時(shí)操作多個(gè)基因，自2013年首次應(yīng)用以來［1］，迅速發(fā)展并被廣泛應(yīng)用于微生物研究、植物科學(xué)研究、動(dòng)物科學(xué)研究和人類疾病治療中，一躍成為當(dāng)今生物科學(xué)領(lǐng)域最具影響力的生物技術(shù)之一。本文主要介紹了CRISPR/Cas9系統(tǒng)在疾病模型的建立及在遺傳疾病治療、病毒感染性疾病治療、癌癥研究等方面的進(jìn)展。

1 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的原理

CRISPR由一段高度保守的正向重復(fù)序列和長度相似的間隔序列交替排列組成。Cas基因編碼的Cas蛋白能與核酶、核酸酶、聚合酶、解旋酶等結(jié)合。CRISPR/Cas9系統(tǒng)根據(jù)Cas基因的不同分為Ⅰ～Ⅲ3種類型，其中被廣泛應(yīng)用的是Ⅱ型。Ⅱ型CRISPR/Cas9在gRNA（guide RNA）的引導(dǎo)下實(shí)現(xiàn)對DNA的定點(diǎn)切割。其中Cas9功能的實(shí)現(xiàn)需要CRISPR轉(zhuǎn)錄而來的crRNA與CRISPR重復(fù)區(qū)互補(bǔ)的tracrRNA（trans?activating crRNA，tracrRNA）形成的復(fù)合物參與［2］。crRNA和tracrRNA融合進(jìn)一條單鏈引導(dǎo)RNA（single guide RNA，sgRNA）的設(shè)計(jì)發(fā)明簡化了Cas9蛋白對特定DNA的體外定點(diǎn)切割，并將CRIS?PR/Cas9技術(shù)應(yīng)用于編碼細(xì)胞系和模式生物中。

由CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯中，sgRNA通過互補(bǔ)配對識別基因組中的靶向序列（proto?spacer），Cas9酶在剪切基因組時(shí)于3′端的PAM（protospacer?adjacent motif）序列前產(chǎn)生一個(gè)雙鏈的切口（圖1）。由于細(xì)胞內(nèi)存在非同源末端連接和同源重組2種修復(fù)方式，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)生物基因組任意位點(diǎn)的序列編輯。

2 CRISPR/Cas9在人類疾病研究中的應(yīng)用

CRISPR/Cas9最引人注目的應(yīng)用是用于對人類疾病的基因治療。其中利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對遺傳性疾病［3］、病毒感染性疾?。?］及癌癥［5］等疾病的基因治療已有報(bào)道。

圖1 CRISPR/Cas9的工作原理Figure 1 Mechanism of the CRISPR/Cas9 system

2.1 在疾病模型中的應(yīng)用

CRISPR/Cas9技術(shù)與干細(xì)胞結(jié)合可快速建立對目標(biāo)基因修飾的各種生物模型［6］。目前，CRIS?PR/Cas9 技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于細(xì)菌［7］、細(xì)胞系［8］、斑馬魚［9］、小鼠［10］和豬［11］等模型的建立，成為研究基因功能和人類疾病的重要工具（表1）。

表1 CRISPR/Cas9在疾病模型中的應(yīng)用Table 1 The applications of the CRISPR/Cas9 in disease models

斑馬魚和小鼠是生命科學(xué)研究中重要的模式生物。小鼠模型是研究遺傳病血友病乙的重要工具，傳統(tǒng)血友病乙小鼠模型構(gòu)建的方法是用顯微注射的方法將凝血因子Ⅸ（factorⅨ，F(xiàn)Ⅸ）大片段敲除的質(zhì)粒注入小鼠的受精卵中，經(jīng)過同源重組后篩選基因敲除小鼠，該方法存在過程繁瑣、效率低下和用時(shí)較長的弊端。CRISPR/Cas9技術(shù)提供了一種構(gòu)建小鼠模型快捷高效的手段。汪啟翰等［18］將小鼠FⅨ基因第8外顯子靶位點(diǎn)的sgRNA和特異的Cas9 mRNA顯微注射到小鼠受精卵中，獲得基因修飾的小鼠。通過精確基因分型和測序驗(yàn)證，小鼠突變率高達(dá)85%，突變小鼠的凝血活性缺失。Platt等［16］利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)在小鼠體內(nèi)同時(shí)實(shí)現(xiàn)了p53、Kras、Lkb1基因的突變，成功建立了小鼠肺腺癌動(dòng)物模型，并由此證實(shí)p53、Kras、Lkb1是肺腺癌發(fā)生發(fā)展中的重要基因。這種基于CRISPR/Cas9技術(shù)快速構(gòu)建多個(gè)基因突變的動(dòng)物模型，對研究腫瘤相關(guān)基因的相互作用具有重大意義。斑馬魚模型系統(tǒng)已經(jīng)處于使用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)發(fā)展的最前沿，Varshney 等［14］利用CRISPR/Cas9對斑馬魚進(jìn)行多基因打靶，這種高效高通量打靶方法能快速建立多種疾病模型，可用于篩選致病基因，研究人類基因功能。

CRISPR/Cas9編輯技術(shù)與動(dòng)物克隆技術(shù)相結(jié)合可減少模式動(dòng)物的飼養(yǎng)周期，所構(gòu)建的大型動(dòng)物模型有助于更好地用于農(nóng)業(yè)和生物醫(yī)學(xué)研究。Zhou 等［17］將靶向特定基因的 Cas/sgRNAs直接導(dǎo)入豬胚胎成纖維細(xì)胞，選取純合突變細(xì)胞進(jìn)行體細(xì)胞核移植，通過這種方法成功建立了PARK2?/?PINK?/?雙等位基因突變帕金森氏病豬模型?？茖W(xué)家們在動(dòng)物模型中，通過CRISPR/Cas9技術(shù)編輯受精卵或早期胚胎中的基因組，或者對生殖干細(xì)胞進(jìn)行基因編輯，從而構(gòu)建能穩(wěn)定遺傳的基因修飾的新個(gè)體［15］。也有科學(xué)家將CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)用于構(gòu)建改良物種模型以防治人類疾病［19］。瘧疾是威脅人類健康的重大傳染病，阻斷蚊蟲傳播是控制瘧疾的關(guān)鍵步驟。美國科學(xué)家利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)將抗瘧原蟲基因插入斯氏按蚊胚胎細(xì)胞基因組的特定區(qū)域，結(jié)果表明99.5%的轉(zhuǎn)基因斯氏按蚊后代有抗瘧原蟲基因的表達(dá)，與其他轉(zhuǎn)基因技術(shù)相比有更高的效率，并能穩(wěn)定遺傳，這種抗瘧原蟲斯氏按蚊的成功構(gòu)建，有助于瘧疾傳播機(jī)制的研究，并有望于改造出用于消滅瘧疾的抗瘧蚊［19］。

2.2 在遺傳病治療中的應(yīng)用研究

CRISPR/Cas9技術(shù)已應(yīng)用于基因治療遺傳病研究，修復(fù)突變的基因或使基因組中突變的基因失活，有望于從根本上治愈由基因突變引起的遺傳病。

隱性營養(yǎng)不良性大皰性表皮松解癥（recessive dystrophic epidermolysis bullosa，RDEB）是Col7a1基因發(fā)生突變及VII型膠原（collagen VII）蛋白功能異常導(dǎo)致的隱性皮膚遺傳病。利用體外成熟的Cas9/sgRNA核糖蛋白復(fù)合物在病人特異性的RDEB小鼠表皮干細(xì)胞進(jìn)行成體基因修復(fù)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)。Wu等［3］利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)從病人特異性的RDEB小鼠模型中篩選出能夠特異、高效地介導(dǎo)第80位外顯子切除的sgRNAs，然后將Cas9/sgRNA核糖蛋白復(fù)合物電擊導(dǎo)入皮內(nèi)并介導(dǎo)體內(nèi)Col7a1基因的編輯，從而恢復(fù)Colla?gen VII蛋白功能，并且修復(fù)RDEB表型，這為治愈此類遺傳性皮膚疾病提供了全新思路。

CRISPR/Cas9技術(shù)在鐮狀細(xì)胞性貧血［20］、地中海貧血［21?22］、囊性纖維化［23］、杜氏肌營養(yǎng)不良［24］、Crygc基因突變引發(fā)的白內(nèi)障［25?26］、遺傳酪氨酸血癥Ⅰ型、α1?抗胰蛋白酶缺乏癥等遺傳性疾病的應(yīng)用研究均已有報(bào)道?；诟咄繙y序的發(fā)展和精準(zhǔn)醫(yī)療理念的提出，CRISPR/Cas9技術(shù)與人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞技術(shù)相結(jié)合是臨床應(yīng)用的一大趨勢［24］。Song 等［21］將地中海貧血患者的皮膚細(xì)胞誘導(dǎo)分化為多功能干細(xì)胞，再利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功修復(fù)了其中的血紅蛋白β?球蛋白基因。該多能干細(xì)胞分化為造血細(xì)胞，生成各類造血祖細(xì)胞，最終表達(dá)功能正常的β?球蛋白。

其他器官系統(tǒng)的成體干細(xì)胞或體細(xì)胞，同樣可利用CRISRP/Cas9技術(shù)加以改造，從而實(shí)現(xiàn)部分或全部的功能修復(fù)。例如，DMD基因突變使肌細(xì)胞中的抗肌萎縮蛋白（dystrophin）表達(dá)缺失從而導(dǎo)致杜氏肌營養(yǎng)不良綜合征（duchenne muscular dystrophy，DMD）。目前CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用于DMD的治療研究已有多項(xiàng)研究報(bào)道。例如，Oust?erout等［27］利用設(shè)計(jì)的 sgRNAs靶向外顯子 45?55的突變熱點(diǎn)以恢復(fù)肌營養(yǎng)不良蛋白的開放閱讀框，并對外顯子進(jìn)行移動(dòng)或刪除操作，成功地糾正了成肌細(xì)胞中DMD基因的突變，正常的抗肌萎縮蛋白得以表達(dá)。CRISRP/Cas9系統(tǒng)也可應(yīng)用于某些終末分化的體細(xì)胞，Long等［28］利用腺病毒相關(guān)病毒在新生DMD小鼠模型的心肌或骨骼肌細(xì)胞中特異性表達(dá)CRISRP/Cas9系統(tǒng)組分，雖然只有部分抗肌萎縮蛋白表達(dá)，心肌和骨骼肌功能卻明顯改善，從而成功阻斷了DMD的進(jìn)展，這種方法可單獨(dú)或聯(lián)合其他療法治療DMD，對DMD和其他單基因遺傳病有潛在的應(yīng)用價(jià)值。CRISRP/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用于體細(xì)胞大大拓展了該技術(shù)的臨床應(yīng)用前景。

2.3 在病毒感染性疾病治療中的應(yīng)用研究

近年來，基因治療技術(shù)逐漸應(yīng)用于病毒感染性疾病的治療中［4］。改造宿主細(xì)胞以免受病毒感染或改造病毒使其不能增殖和傳播是基因治療病毒感染性疾病的2種主要思路。艾滋病是人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）引起的傳染性疾病，高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法是傳統(tǒng)治療艾滋病的方法，雖然這種治療方法能顯著改善患者的病發(fā)癥狀，但仍存在諸多弊端。

長末端重復(fù)序列（long terminal repeat，LTR）是HIV病毒核酸的整合和RNA合成必不可少的元件，研究發(fā)現(xiàn)針對HIV?1感染的T細(xì)胞的LTRs利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行打靶，能有效降低細(xì)胞內(nèi)的前病毒水平［29］。這種基因編輯方法也可以阻止隨后的艾滋病毒感染。另外，改造后的CRISPR/Cas9能與潛伏于細(xì)胞中的HIV原病毒基因直接結(jié)合并使其活化，并同時(shí)聯(lián)合抗病毒藥物殺滅活化的HIV病毒。CRISPR/Cas9能夠直接作用于細(xì)胞表面共受體 CCR5［Chemokine（C?C motif）receptor 5］，使細(xì)胞免受HIV侵襲，這或許也表明該技術(shù)可以在預(yù)防HIV病毒感染方面起到貢獻(xiàn)。目前，CRIS?PR/Cas9基因編輯技術(shù)的安全性與穩(wěn)定性還需進(jìn)一步鑒定，sgRNAs的脫靶率及原因仍需深入分析，載體的選擇也仍需優(yōu)化，CRISPR/Cas9用于HIV?1的真正的臨床治療還有漫長的路要走。

此外，其他病毒感染性疾病的基因治療研究也不斷取得新進(jìn)展。潛伏病毒感染是治愈病毒感染性疾病的一大障礙，目前大多數(shù)抗病毒藥物的研究目標(biāo)是抑制活躍病毒的復(fù)制，基因編輯技術(shù)有望在控制潛伏病毒感染中發(fā)揮作用。Epstein?Barr病毒（EB病毒）是皰疹病毒科嗜淋巴細(xì)胞病毒屬的成員，這種病毒可導(dǎo)致傳染性單核細(xì)胞增多癥，且與我國南方發(fā)病率較高的鼻咽癌以及非洲兒童的淋巴癌有密切關(guān)系，被認(rèn)為可能是人類致癌病毒之一。一項(xiàng)利用CRISPR/Cas9技術(shù)對伯奇氏淋巴瘤細(xì)胞株中整合的EB病毒進(jìn)行靶向基因組編輯的研究發(fā)現(xiàn)，伯奇氏淋巴瘤細(xì)胞出現(xiàn)增殖滯緩現(xiàn)象，且EB病毒載量大大降低了［30］。這提示CRISPR/Cas9在根治病毒感染性疾病方面具有巨大潛力。

2.4 在癌癥研究方面的應(yīng)用研究

CAR?T（chimeric antigen receptor T?cell immu?notherapy，CAR?T）免疫療法通過重新定向和編輯T淋巴細(xì)胞以介導(dǎo)腫瘤免疫排斥并特異性結(jié)合腫瘤細(xì)胞，是治療腫瘤的一種有效方法。目前CAR?T治療并不完善，CAR基因傳遞到T細(xì)胞的過程，存在隨機(jī)插入到受體細(xì)胞基因組的風(fēng)險(xiǎn)。Eyquem等［5］利用CRISPR/Cas9技術(shù)將CAR基因精確地遞送到特異的位置，并且增強(qiáng)了CAR?T細(xì)胞在小鼠中的腫瘤抑制作用，能夠長期殺死癌細(xì)胞。CRISPR/Cas9編輯過的CAR?T細(xì)胞在急性淋巴細(xì)胞白血病的小鼠模型中的治療效果要顯著優(yōu)于常規(guī)生成的CAR?T細(xì)胞。但是經(jīng)CRISPR構(gòu)建CAR?T細(xì)胞的安全性和有效性還有待探究。

CRISPR/Cas9技術(shù)已成功應(yīng)用于miRNA在腫瘤中的功能研究。Huo等［31］將靶向miRNA21以慢病毒為載體的CRISPR/Cas9導(dǎo)入卵巢癌細(xì)胞SKOV3和OVCAR3中，結(jié)果顯示卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲均受到抑制，并且編輯后的卵巢癌細(xì)胞對化療藥的敏感性顯著增加。這表明miR?NA21參與調(diào)控卵巢癌的發(fā)生發(fā)展。這種方法可用于研究miRNA與癌癥之間的關(guān)系并指導(dǎo)癌癥的靶向治療。

此外，利用CRISPR/Cas9技術(shù)研究特定基因在癌癥發(fā)生發(fā)展中的作用，可發(fā)現(xiàn)新的原癌基因或抑癌基因。Feng等［32］利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)有效地敲除了骨肉瘤細(xì)胞系的CDK11基因，發(fā)現(xiàn)敲除后的細(xì)胞活力、細(xì)胞增殖能力以及細(xì)胞遷移性和侵襲性均顯著降低，CDK11基因可能成為骨肉瘤治療的新靶點(diǎn)。Brandon等［33］首次利用慢病毒載體使CRISPR/Cas9系統(tǒng)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)并進(jìn)行高效的編輯，實(shí)現(xiàn)了對淋巴瘤癌基因MCL?1在體內(nèi)外的敲除。MCL?1基因被敲除后，癌細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的死亡，小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示腫瘤生長速度減慢并出現(xiàn)了明顯的退化。利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對癌基因進(jìn)行敲除或修復(fù)，從而實(shí)現(xiàn)腫瘤的基因治療，這為腫瘤治療提供了一種潛在方案。然而，CRISPR/Cas9應(yīng)用于腫瘤治療仍面臨眾多挑戰(zhàn)，例如脫靶效應(yīng)的存在，即sgRNA與靶點(diǎn)之外的DNA序列錯(cuò)配，引起非預(yù)期的基因突變。如何將CRIS?PR/Cas9系統(tǒng)導(dǎo)入靶細(xì)胞中也是腫瘤治療的一大難題。

3 展望

CRISPR/Cas9是一種簡潔、靈活和精確的基因編輯技術(shù)，CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組編輯在短時(shí)間內(nèi)崛起并取得眾多突破，在生命科學(xué)研究領(lǐng)域尤其是在人類疾病基因治療和作物品質(zhì)改良方面得到高度關(guān)注。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)為不同的生物體的基因組編輯提供了可能，但也存在不容忽視的需克服的困難。首先，CRISPR/Cas9系統(tǒng)的分子結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，目前人們對該系統(tǒng)認(rèn)識還不夠全面，自然界中是否存在更高效率或更精確的變異的Cas9蛋白，有待進(jìn)一步探究。其次，脫靶效應(yīng)是CRISPR/Cas9應(yīng)用于人類疾病治療最主要的安全問題，雖然選取與人類基因同源性低的片段設(shè)計(jì)基因編輯病毒的靶標(biāo)，可一定程度降低脫靶突變率，但脫靶效應(yīng)依然嚴(yán)重制約了CRISPR/Cas9技術(shù)的廣泛應(yīng)用。再次，CRISPR/Cas9能否用于人類生殖細(xì)胞的基因編輯，在倫理方面也存在較大爭議。最后，CRIS?PR/Cas9基因編輯技術(shù)對環(huán)境和生態(tài)平衡也有一定的負(fù)面影響，例如，為了控制發(fā)展中國家瘧疾的傳播，對蚊子基因組進(jìn)行CRISPR/Cas9編輯可能導(dǎo)致短期內(nèi)目標(biāo)蚊種的滅絕。總之，CRISPR/Cas9系統(tǒng)的分子生物學(xué)研究是一把雙刃劍，科研工作者應(yīng)在盡可能避免和控制其不良影響的前提下將其運(yùn)用到多種研究中，為人類的健康造福。

參考文獻(xiàn)

［1］Cong L，Ran FA，Cox D，et al.Multiplex genome en?gineering using CRISPR/Cas systems［J］.Science，2013，339（6121）：819?823.

［2］Karginov FV，Hannon GJ.The CRISPR system：small RNA?guided defense in bacteria and archaea［J］.Molecular Cell，2010，37（1）：7?19.

［3］Wu W，Lu Z，Li F，et al.Efficient in vivo gene edit?ing using ribonucleoproteins in skin stem cells of reces?sive dystrophic epidermolysis bullosa mouse model［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2017，114（7）：1660?1665.

［4］韓英倫，李慶偉.CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)在HIV?1感染治療中的應(yīng)用進(jìn)展［J］.遺傳，2016（1）：9?16.

［5］Eyquem J，Mansilla?Soto J，Giavridis T，et al.Target?ing a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 en?hances tumour rejection［J］.Nature，2017，543（7643）：113?117.

［6］Hwang WY，F(xiàn)u Y，Reyon D，et al.Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR?Cas system［J］.Nat Biotechnol，2013，31（3）：227?229.

［7］Wiktor J，Lesterlin C，Sherratt DJ，et al.CRISPR?me?diated control of the bacterial initiation of replication［J］.Nucleic Acids Res，2016，44（8）：3801?3810.

［8］盧利莎，白楊，劉鑫，等.利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建敲除MEIS2基因的HEK293T人胚腎細(xì)胞系［J］.中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào)，2015（4）：535?541.

［9］Jao LE，Wente SR，Chen W.Efficient multiplex bial?lelic zebrafish genome editing using a CRISPR nucle?ase system［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2013，110（34）：13904?13909.

［10］Rauch I，Tenthorey JL，Nichols RD，et al.NAIP pro?teins are required for cytosolic detection of specific bacterial ligands in vivo［J］.J Exp Med，2016，213（5）：657?665.

［11］Sheets TP，Park CH，Park KE，et al.Somatic cell nu?clear transfer followed by CRIPSR/Cas9 microinjection results in highly efficient genome editing in cloned pigs［J］.Int J Mol Sci，2016，17（12）：E2031.

［12］Choudhary E，Lunge A，Agarwal N.Strategies of ge?nome editing in mycobacteria：Achievements and chal?lenges［J］.Tuberculosis（Edinb），2016，98：132?138.

［13］Chen F，Zhang W，Zhao J，et al.Construction of Rev?erbbeta gene knockout HEK293 cell line with CRISPR/Cas9 system［J］.Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi，2016，32（11）：1446?1452.

［14］Varshney GK，Pei W，LaFave MC，et al.High?throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9［J］.Genome Res，2015，25（7）：1030?1042.

［15］Long C，McAnally JR，Shelton JM，et al.Prevention of muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9?medi?ated editing of germline DNA［J］.Science，2014，345（6201）：1184?1188.

［16］Platt RJ，Chen S，Zhou Y，et al.CRISPR?Cas9 knock?in mice for genome editing and cancer modeling［J］.Cell，2014，159（2）：440?455.

［17］Zhou X，Xin J，F(xiàn)an N，et al.Generation of CRISPR/Cas9?mediated gene?targeted pigs via somatic cell nu?clear transfer［J］.Cell Mol Life Sci，2015，72（6）：1175?1184.

［18］汪啟翰，懷聰，孫瑞林，等.利用CRISPR/Cas系統(tǒng)快速高效構(gòu)建血友病乙小鼠模型［J］.遺傳，2015（11）：1143?1148.

［19］Gantz VM，Jasinskiene N，Tatarenkova O，et al.Highly efficient Cas9?mediated gene drive for popula?tion modification ofthemalariavectormosquito Anopheles stephensi［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2015，112（49）：E6736?E6743.

［20］Huang X，Wang Y，Yan W，et al.Production of gene?corrected adult beta globin protein in human erythro?cytes differentiated from patient iPSCs after genome editing of the sickle point mutation［J］.Stem Cells，2015，33（5）：1470?1479.

［21］Song B，F(xiàn)an Y，He W，et al.Improved hematopoietic differentiation efficiency of gene?corrected beta?thalas?semia induced pluripotent stem cells by CRISPR/Cas9 system［J］.Stem Cells and Development，2015，24（9）：1053?1065.

［22］Xie F，Ye L，Chang JC，et al.Seamless gene correc?tion of β ?thalassemia mutations in patient?specific iPSCs using CRISPR/Cas9 andpiggy Bac［J］.Genome Research，2014，24（9）：1526?1533.

［23］Schwank G，Koo BK，Sasselli V，et al.Functional re?pair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients［J］.Cell Stem Cell，2013，13（6）：653?658.

［24］Li HL，F(xiàn)ujimoto N，Sasakawa N，et al.Precise cor?rection of the dystrophin gene in duchenne muscular dystrophy patient induced pluripotent stem cells by TALEN and CRISPR ?Cas9［J］.Stem Cell Reports，2015，4（1）：143?154.

［25］Wu Y，Zhou H，F(xiàn)an X，et al.Correction of a genetic disease by CRISPR?Cas9?mediated gene editing in mouse spermatogonial stem cells［J］.Cell Res，2015，25（1）：67?79.

［26］Wu Y，Liang D，Wang Y，et al.Correction of a genet?ic disease in mouse via use of CRISPR?Cas9［J］.Cell Stem Cell，2013，13（6）：659?662.

［27］Ousterout DG，Kabadi AM，Thakore PI，et al.Multi?plex CRISPR/Cas9 ?based genome editing for correc?tion of dystrophin mutations that cause Duchenne mus?cular dystrophy［J］.Nature Communications，2015，6：6244.

［28］Long C，Amoasii L，Mireault AA，et al.Postnatal ge?nome editing partially restores dystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy［J］.Science，2016，351（6271）：400?403.

［29］Sarkar I，Hauber I，Hauber J，et al.HIV?1 proviral DNA excision using an evolved recombinase［J］.Sci?ence，2007，316（5833）：1912?1915.

［30］Wang J，Quake SR.RNA?guided endonuclease pro?vides a therapeutic strategy to cure latent herpesviridae infection［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2014，111（36）：13157?13162.

［31］Huo W，Zhao G，Yin J，et al.Lentiviral CRISPR/Cas9 vector mediated miR?21 gene editing inhibits the epithelial to mesenchymal transition in ovarian cancer cells［J］.Journal of Cancer，2017，8（1）：57?64.

［32］Feng Y，Sassi S，Shen J K，et al.Targeting Cdk11 in osteosarcoma cells using the CRISPR?cas9 system［J］.J Orthop Res，2015，33（2）：199?207.

［33］Aubrey BJ，Kelly GL，Kueh AJ，et al.An inducible lentiviral guide RNA platform enables the identifica?tion of tumor?essential genes and tumor?promoting mu?tations in vivo［J］.Cell Reports，2015，10（8）：1422?1432.