蔣力云 狄飚 楊智聰

登革熱（dengue fever，DF）是由登革病毒（den?gue virus）引起的急性傳染病，廣泛流行于熱帶和亞熱帶地區(qū)，臨床表現(xiàn)以高熱、頭痛、肌肉關(guān)節(jié)疼痛為主，有時伴有皮疹、淋巴腺腫大和白細(xì)胞減少等癥狀，重癥患者會出現(xiàn)登革出血熱（dengue hem?orrhagic，DHF），甚至登革休克綜合征（dengue shock syndrome，DSS）。在我國，登革熱自1978年在廣東佛山暴發(fā)流行以來，主要流行于廣東、廣西、福建、浙江及海南等省［1?2］，已經(jīng)成為我國面臨的嚴(yán)峻的公共衛(wèi)生問題。由于半數(shù)以上的登革熱病例無癥狀或者僅出現(xiàn)普通的發(fā)熱癥狀［3?4］，因此僅從臨床癥狀上來判斷登革熱比較困難，實驗室的輔助診斷顯得尤為重要。只有盡早快速準(zhǔn)確地診斷疾病，才能對急性期患者進行早報告、早隔離、早就地治療，并且及時開展蚊媒的滅殺工作，才有利于登革熱疫情的控制。這也促使登革熱檢測技術(shù)不斷進步和提高，檢測方法更加簡便、快速、準(zhǔn)確。近年來在免疫學(xué)檢測、病原檢測、病毒分離培養(yǎng)技術(shù)等方面取得了一定進展，為臨床檢測不同發(fā)病階段的登革熱提供了更多的選擇和有效的檢測方法，有效地提高了登革熱檢測的靈敏度和準(zhǔn)確度。

1 登革病毒檢測程序新進展

登革病毒感染后，患者除了出現(xiàn)白細(xì)胞降低、血小板減少、血液濃縮和低蛋白血癥等非特異性的血象改變外［5］，還能從相關(guān)臨床標(biāo)本中檢測到特異性抗體、病毒抗原、病毒核酸甚至分離到病毒。登革熱檢測所采集的臨床病例標(biāo)本可以包含血液、腦脊液、腦組織和肝［6］。因為在標(biāo)本采集過程中，血液的采集和處理最方便，對患者造成的創(chuàng)傷和損害最小，幾乎在整個感染期間血液都能用于檢測，因此登革熱檢測中采集的病例標(biāo)本普遍以血液為主。腦組織和肝主要是在尸檢或動物實驗時采集，通常需要在研磨破碎后用于病毒分離或者核酸檢測，或者冰凍切片后進行免疫熒光檢測。在國內(nèi)外一些相關(guān)研究中，也有采集唾液和尿液進行檢測，但是由于受到排毒量少和排毒時間短的限制，很少在日常檢測中采用［7］。在臨床檢測中，采用血清檢測登革病毒及抗體的步驟如圖1所示。根據(jù)血清采集時對應(yīng)的發(fā)病時間，選擇靈敏度較高的檢測方法，有利于提高登革熱檢測效率。如在發(fā)病早期，通常是7天內(nèi)，特別是出現(xiàn)發(fā)熱癥狀的5天內(nèi)［8］，使用NS1檢測、核酸檢測或者病毒分離的方法相較于通過抗體檢測的方法檢測更有優(yōu)勢。而在發(fā)病后期，我們更傾向于通過檢測血清中抗體滴度的變化，特別是IgG的4倍增高來判斷登革病毒的感染。

圖1 血清中檢測登革病毒及抗體流程圖［9］Figure 1 Procedure of dengue virus and antibody detection in serum［9］

2 登革病毒快速檢測技術(shù)的運用

2.1 抗體檢測

由于抗體檢測技術(shù)操作簡便，所需儀器設(shè)備簡單，商品化試劑易于購買，是目前診斷登革熱的重要手段。但是登革病毒抗體與其他黃病毒抗體存在交叉反應(yīng)，加之我國將乙型腦炎預(yù)防接種作為計劃免疫的一部分，因此在檢測過程中需要注意非特異性反應(yīng)，同時結(jié)合患者臨床癥狀和流行病學(xué)史對抗體陽性結(jié)果加以區(qū)分。

抗體檢測樣品以血液為主，主要是針對IgM和IgG進行檢測。在首次感染時，出現(xiàn)發(fā)熱后大概5天，IgM就能被檢測到并且能在體內(nèi)持續(xù)2～3個月；而IgG則出現(xiàn)在發(fā)熱后的8～10天，并能在體內(nèi)持續(xù)存在4個月。而在二次感染時，IgG在發(fā)熱后快速升高，某些病例中甚至無法檢出IgM，而IgG在10 個月后仍然能檢測到，甚至持續(xù)終身［3，8］。有報道通過IgM/IgG的比值來判定病例是首次感染或是二次感染，但該比值無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，并且受采樣時間的影響較大，因此在判定時需謹(jǐn)慎，以免造成誤判［10?11］。也有文獻研究通過檢測血液、唾液和尿液中IgM、IgG、IgE和IgA，以此來診斷登革病毒感染［7］。但是總體來說，多數(shù)實驗室仍然是以檢測血清中IgM和IgG為主要方法。并且我國《登革熱診斷標(biāo)準(zhǔn)》（WS216?2008）也包括以血清中特異性IgM或IgG陽性或雙份血清特異性IgG的4倍增高為診斷依據(jù)。

抗體檢測方法包括血凝抑制試驗（hemaggluti?nation?inhibition test，HI）、補體結(jié)合試驗（comple?ment fixation test，CFT）、中和試驗（neutralization test，NT）、酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immu?nosorbent assay，ELISA）、膠體金免疫層析快速試驗 （immunochromatographiccolloidalgold test，ICT）、免疫斑點法（dot immunobinding assay，DI?BA）和間接免疫熒光試驗（indirect immunofluores?cence assay，IFA）等。

其中，HI和CFT是較古老的血清學(xué)檢測方法。前者是根據(jù)登革病毒能使鵝的紅細(xì)胞發(fā)生凝集，但在特異性抗體存在的情況下凝集現(xiàn)象會被抑制的原理來檢測樣本中登革病毒抗體。用HI試驗檢測抗體時，登革病毒和其他黃病毒之間存在較高的交叉反應(yīng)。用CFT檢測抗體的時間，較用HI檢測抗體的時間晚，且持續(xù)時間不長。在初次感染時，CFT有較好的特異性，而二次感染時的特異性不好。CFT參與反應(yīng)的成分較多，影響因素比較復(fù)雜，較難操作，操作者需要經(jīng)過嚴(yán)格培訓(xùn)和具備豐富的經(jīng)驗。因此，現(xiàn)在大多數(shù)實驗室已經(jīng)放棄將HI和CFT作為登革熱的診斷試驗。NT能檢測出樣品中保護性抗體的水平，是抗體檢測中的一種敏感方法。但是，標(biāo)準(zhǔn)病毒顆粒的完整性、宿主細(xì)胞的敏感性等各因素的變化都會影響其結(jié)果的準(zhǔn)確性，判斷實驗結(jié)果所需時間也較長，故不適用于快速診斷。同時，NT操作技術(shù)要求較高、操作繁瑣、耗時長，因此多在研究性工作中使用，不適用于臨床大規(guī)模檢測。IFA是先將病毒感染的細(xì)胞固定在玻片上，制備成抗原片，然后加入患者血清，再加上熒光素標(biāo)記的二抗，作用一定時間后在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。該方法可區(qū)分感染病毒的血清型，但由于需要使用熒光顯微鏡，且在結(jié)果的判定上對檢測人員的經(jīng)驗有一定依賴，因此難以在基層醫(yī)療機構(gòu)建立。

ELISA、ICT和DIBA是目前臨床檢測登革病毒抗體最常用的方法［12］，在檢測過程中需要注意類風(fēng)濕因子的影響和其他黃病毒的交叉反應(yīng)。ICT操作簡單，人員只需簡單培訓(xùn)即可使用，反應(yīng)所需時間短，不需酶標(biāo)儀等試驗設(shè)備，因此特別適合現(xiàn)場快速檢測［13］。ICT法檢測登革病毒IgM抗體適合在登革熱暴發(fā)流行期間用作疫區(qū)基層醫(yī)療單位的早期初篩試驗。而ICT法檢測登革病毒IgG抗體的靈敏度偏低，可以通過對有持續(xù)臨床癥狀的患者再次采樣來提高檢出率。ELISA由于操作簡便，所需儀器設(shè)備簡單，可同時檢測大量標(biāo)本，并且有多種品牌的商品化試劑提供，因而得到了廣泛的推廣和應(yīng)用。ELISA法檢測登革病毒IgM/IgG抗體適合在普查及大批量標(biāo)本檢測時使用。在登革熱散發(fā)期間，ELISA法檢測登革病毒抗體會與其他黃病毒抗體產(chǎn)生廣泛的交叉反應(yīng)，出現(xiàn)假陽性結(jié)果，需要結(jié)合臨床癥狀或其他實驗結(jié)果做出判斷。DIBA法操作費時，成本比較昂貴，檢測IgM抗體不適合作為初篩試驗，但DIBA法檢測IgG抗體敏感性和特異性好，與其他黃病毒交叉反應(yīng)少，適合在登革熱散發(fā)期間使用，可作為登革病毒感染的確證實驗。

2.2 抗原檢測

登革抗原檢測方法有HI、CFT、NT、免疫熒光（immunofluorescence，IF）、ELISA 和 ICT 等，主要是針對樣品中病毒蛋白或病毒進行檢測。登革病毒的基因組結(jié)構(gòu)可以分為5′末端非編碼區(qū)、結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)、非結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)和3′末端非編碼區(qū)。

目前，對病毒蛋白的檢測主要是針對非結(jié)構(gòu)蛋白NS1檢測。血清中的NS1在發(fā)病第一天出現(xiàn)，第3天達到峰值，4天內(nèi)的敏感性為88%～95%，并可持續(xù)到第9天［14］。NS1產(chǎn)生于感染早期甚至早于IgM的出現(xiàn)，但是在抗NS1?IgG出現(xiàn)后就無法檢測。因此，NS1的檢測主要是在登革病毒感染早期使用。在發(fā)病早期檢測NS1和用PCR檢測核酸的一致性高達 95%以上［15?16］，而 NS1 檢測的成本和技術(shù)要求都低于PCR檢測。因此，在無法開展PCR檢測的基層單位開展NS1檢測，有利于患者的早期發(fā)現(xiàn)和診斷。然而在二次感染時，由于IgG的存在，NS1很快與抗體形成抗原?抗體免疫復(fù)合物，使得NS1難以檢出。不過，通過37℃孵育1 h的方法，使抗原?抗體復(fù)合物分離開來，可以提高NS1的檢出率［17］。主要的商品化檢測試劑有酶聯(lián)免疫吸附試劑和膠體金快速試劑，都有較高的敏感性和特異性［18?20］。在廣州市，NS1 膠體金快速試劑已經(jīng)在各大醫(yī)院推廣開展，針對發(fā)病早期的檢測效果良好［21］。同時我們也發(fā)現(xiàn)，進口試劑的準(zhǔn)確率明顯高于國產(chǎn)試劑［22］。所以，在資金充足的情況下，優(yōu)先推薦使用進口試劑。

FA是目前實驗室鑒定登革病毒的另一種常用方法。FA是將待測樣品與登革病毒型特異性單克隆抗體反應(yīng)，隨后加入熒光素標(biāo)記的抗體，通過熒光顯微鏡觀察結(jié)果。研究人員用免疫熒光檢測外周血單核細(xì)胞登革抗原，發(fā)現(xiàn)在退熱前陽性率較高［23］。該技術(shù)最大優(yōu)點為敏感性和特異性高，特別是單克隆抗體的問世大大提高了免疫熒光測定的效果，主要應(yīng)用于快速診斷。

2.3 核酸檢測

在登革熱發(fā)病后2～7天時，登革病毒能在患者血液、血細(xì)胞甚至組織，特別是免疫系統(tǒng)組織中檢測到，這個時期基本與患者的發(fā)熱期相吻合。最適宜使用這段時期采集的標(biāo)本進行登革病毒核酸檢測、病毒分離。核酸檢測主要是根據(jù)登革病毒的基因序列設(shè)計特異性引物，在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)體系和條件下進行擴增，最后用儀器設(shè)備檢測判斷。由于不同血清型的登革病毒有不同的基因序列，因此通過核酸檢測可以區(qū)分登革病毒的血清型。相較于病毒分離，核酸檢測的反應(yīng)時間短、特異性強、敏感性高。但是，由于對儀器設(shè)備和操作人員的要求較高，花費大，不適用于大批量的調(diào)查監(jiān)測［24］。特別是核酸檢測敏感度較高，因此在操作中需要小心避免因污染造成假陽性。將實驗室正確分區(qū)，注意陽性對照和陽性樣品的妥善保存，以及謹(jǐn)慎地處理核酸擴增產(chǎn)物可以有效降低污染的可能性。又由于登革病毒是RNA病毒，需要避免實驗中核酸降解造成假陰性。使用去除RNA降解酶和DNA降解酶的實驗器材可以有效地避免RNA降解。這些要求都限制了核酸檢測方法在基層工作中的開展和運用。

核酸檢測常用的方法包括，核酸雜交檢測（hy?bridization）、逆轉(zhuǎn)錄?聚合酶鏈反應(yīng)檢測（reverse transcription?polymerase chain reaction，RT?PCR）、實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄?聚合酶鏈反應(yīng)檢測（real?time fluorescence quantitative reverse transcription?polymerase chain reaction，RT?qPCR）、基因芯片（gene chip）和核酸等溫擴增技術(shù)（nucleic acid se?quence?based amplification，NASBA）等。

核酸雜交檢測的原理是雙鏈的核酸分子在某些理化因素作用下解開，在條件恢復(fù)后又可依堿基配對規(guī)律形成雙鏈結(jié)構(gòu)。雜交通常在一支持膜上進行，因此又稱為核酸印跡雜交。但由于該方法操作繁瑣、費時費力，已基本不用于登革病毒的核酸檢測。在目前臨床檢測中，最常用的是RT?PCR和RT?qPCR。在RT?PCR檢測中，通過對登革病毒不同位點設(shè)計特異性引物進行片段擴增，不僅可以檢測樣品中是否含有登革病毒核酸，還可以判斷病毒的血清型，通過進一步的序列測定可以獲得病毒的核苷酸序列，從分子生物學(xué)角度對病毒的流行和傳播進行分析。而使用RT?qPCR檢測則無法獲得病毒的核苷酸序列。但是，RT?qP?CR相對RT?PCR可以實時地觀察結(jié)果，檢測時間短，有更高的靈敏度，并且可以定量測定，加之反應(yīng)在一個密封的體系里進行，大大地減少了污染的可能性。因此，在對患者的急性期臨床標(biāo)本檢測中應(yīng)用更加廣泛。

NASBA是在恒溫條件下對病毒核酸進行擴增，擴增產(chǎn)物通過電發(fā)光設(shè)備用探針雜交的方法檢測出來。NASBA可以擴增在人血中含量低至1～10 PFU/mL 的登革病毒［25］。相較于 RT?PCR，NASBA在41℃的恒溫下進行，不需要溫度循環(huán)裝置；產(chǎn)物是單鏈RNA，可以直接用于雜交檢測，而且RNA較DNA容易降解，減少了陽性產(chǎn)物可能帶來的污染問題。在NASBA反應(yīng)體系中加入分子信標(biāo)探針，可以實時觀測反應(yīng)結(jié)果。相較于RT?PCR和RT?qPCR，NASBA的簡便和快捷更有利于在基層開展和運用。但是，NASBA需要進一步提高其靈敏度。基因芯片的發(fā)展時間較短，但是它操作簡便、成本低、體積小、高通量，具有廣泛的應(yīng)用前景，并有待進一步研究和推廣［26］。

在臨床檢測中，血清、全血或者血漿是登革病毒核酸檢測的常見標(biāo)本。有研究顯示，組織、尿液或者唾液也可以作為臨床檢測標(biāo)本。在發(fā)病0～5天時，用RT?qPCR檢測尿液中登革病毒核酸的陽性率低于血清中的陽性率。但是，在發(fā)病6～16天，RT?qPCR檢測尿液中登革病毒核酸的陽性率大幅增加，并且高于血清檢測的陽性率。甚至在血清中出現(xiàn)IgM和IgG，在利用血清無法檢測出病毒核酸的情況下，尿液檢測的陽性率依然保持較高水平［27］。還有報道稱，用 RT?qPCR 能從唾液中檢測出登革病毒核酸［28］。這些都為登革病毒核酸檢測提供了更多可能的檢測樣本。

2.4 病毒分離

由于登革病毒分離的時間長，對樣品的要求較高，加之核酸檢測技術(shù)的發(fā)展，在臨床檢測中已經(jīng)逐步被核酸檢測所取代。但是，病毒分離作為判定登革病毒感染的金標(biāo)準(zhǔn)，能獲得毒株進行進一步研究病毒的病原學(xué)、表型特征和抗原漂移等，仍然是登革病毒檢測的一項重要技術(shù)。

登革病毒分離的方法包括乳鼠分離、蚊蟲分離和細(xì)胞分離。乳鼠分離實驗成本較高，對實驗室設(shè)備要求也較高，并且敏感性不高，因此大多實驗室不采用?？梢杂糜谖孟x分離的蚊媒種類有：埃及伊蚊、白紋伊蚊、漢安巨蚊和華麗伊蚊等。登革病毒能在4～5天內(nèi)在蚊體內(nèi)復(fù)制達到高滴度水平。雖然蚊蟲分離是分離登革病毒最敏感的方法，但需要昆蟲實驗室培育大量的蚊蟲用以分離，并且要注意防止感染蚊蟲逃逸，因此也是最少使用的方法［29］。

目前最常用的登革病毒分離的方法是細(xì)胞分離，常用細(xì)胞有：恒河猴腎細(xì)胞（Ganges River mon?key kidney cells，LLC?MK2）、非洲綠猴腎細(xì)胞（Af?rican green kidney cells，Vero cells）、金黃地鼠腎細(xì)胞（Baby Hamster Syrian kidney cells，BHK21）、白紋伊蚊細(xì)胞（Aedes albopictus cells，C6/36）和偽盾伊蚊細(xì)胞（Aedes pseudoscutellaris cells，AP61）等。樣品中的病毒載量是影響登革病毒分離率的關(guān)鍵因素；樣品中抗體滴度越低，分離率越高；DHF患者樣本比DF患者樣本的病毒分離率更低；在發(fā)熱期間采集樣本分離病毒能獲得更高的分離率；發(fā)病天數(shù)與病毒分離率也密切相關(guān)，采取發(fā)病5天前的樣本能提高病毒分離率［30］。因此，盡量采集發(fā)病早期的標(biāo)本進行病毒分離，可以有效提高病毒分離率。由于某些毒株不能引起明顯的細(xì)胞病變，因此可以結(jié)合IFA、RT?PCR等方法來鑒定病毒分離結(jié)果。隨著細(xì)胞培養(yǎng)和病毒分離技術(shù)的發(fā)展，有研究通過在同一細(xì)胞瓶中培養(yǎng)不同細(xì)胞，可以同時分離鑒定不同病毒，或者使用基因改造的細(xì)胞來分離病毒［31］。雖然這些方法尚未在病毒分離中推廣運用，但為登革病毒分離提供了借鑒。

3 結(jié)語

登革熱檢測方法多種多樣，商品化的檢測試劑也琳瑯滿目。近年來，使用膠體金免疫層析快速試驗檢測登革病毒抗原和抗體，由于其具有操作簡便、價格相對低廉、無需專用儀器、無需特殊培訓(xùn)、檢測結(jié)果直觀和現(xiàn)場使用方便等優(yōu)點，在基層單位得到了廣泛的應(yīng)用和推廣。同時，隨著對病毒的研究更加深入和細(xì)致，檢測方法和技術(shù)不斷更新，檢測樣品更加多樣化。在患者的不同時期，采用不同的檢測方法，甚至是聯(lián)合使用多種檢測方法，既有助于排除假陽性的檢測結(jié)果，避免交叉反應(yīng)結(jié)果，又有利于提高檢測結(jié)果的靈敏度。同時，從檢測結(jié)果的靈敏度和特異性上對我國市場上存在的登革熱檢測商品化試劑進行比較，不同品牌的試劑存在差異。比如，在實際工作中發(fā)現(xiàn)，進口NS1檢測試劑的特異性高于國產(chǎn)NS1檢測試劑，但是國產(chǎn)試劑的靈敏度高于進口試劑［32?33］。然而，國家缺乏相關(guān)的規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)對試劑的選擇進行指導(dǎo)，這就可能造成采用相同檢測方法卻使用不同試劑的醫(yī)院對臨床標(biāo)本做出不同的判斷。因此，希望國家能制定相關(guān)的工作標(biāo)準(zhǔn)，對檢測工作中試劑的選用進行指導(dǎo)，用以規(guī)范檢測診斷。

通過對各種方法進行比較，筆者認(rèn)為根據(jù)不同時期和實驗?zāi)康倪x擇不同的實驗方法，才能有效地檢測和發(fā)現(xiàn)登革熱。NS1檢測、核酸檢測和病毒分離在發(fā)病早期的敏感度較高，而在血液中抗體存在的時間較長，有利于進行大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查。在患者的早期檢測中，我們傾向于選用敏感性高、快速、簡便、價廉以及能將登革熱與其他具有相似臨床癥狀的疾病區(qū)分開來的實驗方法，如NS1和核酸檢測。而在疫情暴發(fā)和流行中的監(jiān)測，我們則傾向于選擇特異性高，高通量，能在疫情的早期發(fā)現(xiàn)患者以及確定流行毒株血清型的方法。在2014年登革熱流行中，廣州市在基層醫(yī)院使用膠體金快速試劑篩查登革病毒NS1和IgM/IgG，廣州市疾病預(yù)防控制中心進一步對陽性標(biāo)本進行酶聯(lián)免疫吸附法檢測、核酸檢測和病毒分離，都取得較好結(jié)果，有力地支持了全市的疫情防控工作。相信隨著科技的發(fā)展和研究的深入，復(fù)合運用多重手段，準(zhǔn)確、快速地檢測登革病毒，及早發(fā)現(xiàn)登革熱患者，將會極大地提升登革熱防控的成效。

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