徐倩南，李成濤 ，劉希玲

（1.溫州醫(yī)科大學法醫(yī)學系，浙江 溫州 325035；2.司法鑒定科學研究院 上海市法醫(yī)學重點實驗室 上海市司法鑒定專業(yè)技術服務平臺，上海 200063）

同卵雙生子是受精卵在卵裂時，由于自身或外界某些隨機因素導致其一分為二從而形成兩個相同的胚胎發(fā)育而成的，因此，同卵雙生子理論上具有相同的遺傳信息，運用傳統(tǒng)的遺傳標記，包括短串聯(lián)重復（short tandem repeat，STR）序列、單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）、插入/缺 失（insertion/deletion，InDel），均不能將其區(qū)分。盡管同卵雙生子在理論上應該具有完全相同的遺傳信息，但是兩者即使在成長環(huán)境大致相同的情況下常顯示出明顯的表型差異，這些差異是由環(huán)境或其他因素綜合造成的。同卵雙生子在表觀遺傳水平以及基因組序列等方面存在一定差異，這為同卵雙生子的甄別提供了堅實的理論基礎。本文就這些方面的進展進行詳細介紹。

1 表觀遺傳學差異

表觀遺傳學是與遺傳學相對立的概念，是指基于非基因序列改變所致的基因表達水平變化，包括DNA甲基化、組蛋白修飾、X染色體失活等。早在十幾年前，F(xiàn)RAGA等[1]觀察了DNA甲基化和組蛋白修飾在同卵雙生子中的改變，指出同卵雙生子在這兩種表觀遺傳標志中均存在差異，而且這種差異隨著個體年齡的增長越來越明顯，這可能是由于同卵雙生子共同生活的時間較短、生活方式不同以及其他環(huán)境因素的影響造成。之后，諸多科學家以同卵雙生子為研究對象就表觀遺傳如何影響個體表型的分子機制進行了詳細探討。

1.1 DNA甲基化

DNA甲基化是一種常見的表觀遺傳修飾，是指在DNA甲基化轉移酶的催化下，將甲基選擇性地添加在DNA分子中的G、C兩個核苷酸上[2]。DNA甲基化將導致DNA構象變化，從而影響蛋白質與DNA的相互作用，其甲基化程度與基因表達水平呈負相關，是基因表達的調節(jié)方式之一，也是造成個體表型差異的重要原因之一[1]。已有多項研究證實了同卵雙生子間存在明顯的DNA甲基化水平差異。

2005年，F(xiàn)RAGA等[1]為了探索同卵雙生子表型差異的潛在分子機制，從DNA甲基化、X染色體失活以及組蛋白乙?；矫姹容^了40對同卵雙生子之間的差異，使用甲基化間區(qū)位點擴增（amplification of inter-methylated sites，AIMS）技術研究DNA甲基化差異時，發(fā)現(xiàn)0.5%～35%的AIMS條帶（3～210條）在同卵雙生子對中存在條帶缺失不一致的現(xiàn)象，其差異位點覆蓋了從染色體終端到單拷貝基因啟動子區(qū)域的CpG島等區(qū)域。2008年，KURATOMI等[3]利用甲基化敏感性代表性差異分析（methylation sensitive-representational difference analysis，MS-RDA）策略對一方患雙相情感障礙（bipolar disorder，又稱躁郁癥）、一方正常的同卵雙生子對中的淋巴細胞進行DNA甲基化掃描，結果顯示，四個區(qū)域存在DNA甲基化異常，分別為PPIEL、PIP5KL1、SMS和ARMC3。2011年，COOLEN等[4]采用MassCLEAVE檢測方法調查了128對同卵雙生子和128對異卵雙生子印記控制區(qū)域（imprint control region，ICR）中IGF2、H19、KCNQ1、GNAS基因以及非印跡基因RUNX1/AML1的甲基化信息，發(fā)現(xiàn)在兩種類型雙生子中H19和IGF2甲基化水平均存在顯著差異。MIYAZAKI等[5-7]在一方正常、一方患其他疾病的同卵雙生子對中研究DNA甲基化水平的差異，也發(fā)現(xiàn)了DNA甲基化修飾在具有不同類型表型差異的同卵雙生子之間普遍存在的現(xiàn)象。2013年，LI等[8]在全基因組水平上，通過Illumina公司的Human-Methylation27 BeadChip芯片對22對成年健康同卵雙生子血液樣本中的DNA甲基化水平進行了全基因范圍內的掃描，篩選出近百個差異明顯的CpG位點，進一步提示了DNA甲基化在甄別同卵雙生子方面的價值。此后，針對同卵雙生子DNA甲基化差異所在位置也展開了深入探討。2014年，van DONGEN等[9]通過對同卵雙生子口腔上皮細胞進行全基因組DNA甲基化分析后發(fā)現(xiàn)，同卵雙生子在CpG島外的CpG位點甲基化水平更趨向于有差異。而ZHANG等[10]在2015年采用Infinium HumanMethylation450 BeadChips芯片技術對10對成年健康同卵雙生子個體進行分析后發(fā)現(xiàn)，位于CpG島上的甲基化位點其甲基化水平在同卵雙生子之間也存在明顯差異。

值得注意的是，基于位點DNA甲基化程度，使用智能神經(jīng)網(wǎng)絡模型以及新一代測序技術對人類年齡進行預測具有可行性。VIDAKI等[11]基于Illumina公司的甲基化芯片對1 156名2～90歲的個體進行DNA甲基化水平分析，使用逐步回歸法從45個與年齡相關的CpG位點中選取了23個與年齡顯著相關的位點，并通過廣義回歸神經(jīng)網(wǎng)絡模型（generalized regression neural network model）對這些位點預測年齡的模型進行優(yōu)化，采用優(yōu)化后的模型對51對同卵雙生子和1011個無關個體年齡進行預測，誤差分別為7.1歲和7.2歲。與前期研究結果[10]一致，上述這些研究顯示了DNA甲基化會隨著人體年齡的改變而變化，這在DNA甲基化實際應用于同卵雙生子甄別時應引起注意。

總體來說，DNA甲基化已被證實在同卵雙生子之間存在明顯差異，因而對甄別同卵雙生子具有重大應用價值，但發(fā)生DNA甲基化修飾變化的熱點區(qū)域和DNA甲基化修飾水平在不同組織、人群、時間中的穩(wěn)定性以及成熟的DNA甲基化位點檢測系統(tǒng)仍有待研究和開發(fā)。

1.2 X染色體失活

X染色體失活是指在胚胎發(fā)育早期，雌性哺乳動物細胞中兩條X染色體之一失去活性的現(xiàn)象，是哺乳動物X染色體基因劑量補償作用的實現(xiàn)方式，這一過程被認為是由長非編碼RNA Xist誘導產生[12]。失活的X染色體伴隨著一系列的表觀遺傳修飾，其中包括組蛋白和DNA甲基化以及組蛋白去乙?；龋@對失活起始和失活狀態(tài)維持起著必不可少的作用[13]。X染色體失活通常可以通過X染色體上DNA甲基化修飾狀態(tài)差異[14]或者基因表達活性差異[15]來推測。

作為一種X連鎖隱性遺傳疾病，紅綠色盲的發(fā)生機制受到了眾多科學家的關注。早在1992年，J?RGENSEN等[16]對同卵雙生子是否患紅綠色盲與X染色體失活的關系進行探討，通過采集一方患紅綠色盲、一方健康的同卵雙生子以及其家屬樣本，利用Southern blot技術分析了色素基因（pigment genes）在樣本中的基因型，并使用M27β探針推測X染色體甲基化狀態(tài)，結果發(fā)現(xiàn)，在女性同卵雙生子中，患紅綠色盲個體的父源X染色體存在活性（其父親也是紅綠色盲患者），健康個體母源X染色體存在活性。同樣的，在1996年，REDONNET-VERNHET等[17]研究同卵雙生子中法布里?。‵abry disease）的發(fā)生情況時，也發(fā)現(xiàn)了患病個體中父源X染色體存在活性，正常個體母源X染色體存在活性的現(xiàn)象，并指出此種差異可能是由內細胞團的不均等分裂導致的。2000年，WILLEMSEN等[18]研究了女性同卵雙生子X染色體FMR1基因突變與一種精神發(fā)育遲滯疾病[脆性X綜合征（fragile X syndrome）]發(fā)病情況的聯(lián)系。通過對發(fā)根中脆性X精神發(fā)育遲緩蛋白（fragile X mental retardation protein，F(xiàn)MRP）基因表達情況進行檢測，發(fā)現(xiàn)在患有精神發(fā)育遲滯的男性同卵雙生子中FMR1基因存在序列突變，從而導致FMRP表達增高。對女性而言，只有60%攜帶有突變FMR1基因的同卵雙生子表現(xiàn)為智力低下，這與突變FMR1基因所在X染色體是否失活相關，并且指出X染色體失活發(fā)生在受精卵分裂之后。為了檢測X染色體失活對其他類型精神疾病的影響，2008年ROSA等[19]評估了X染色體失活對雙相情感障礙和精神分裂癥的影響。通過對表型不一致的女性同卵雙生子個體口腔黏膜細胞和外周血中人雄激素受體甲基化差異研究發(fā)現(xiàn)，在雙相情感障礙中，表型不一致的同卵雙生子在父源或母源X染色體上DNA甲基化水平的差異更大，這提示X染色體失活或許與同卵雙生子表型不一致相關。除了上述研究外，硬皮病（scleroderma）[20]、原發(fā)性膽汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis，PBC）[21]等疾病也被發(fā)現(xiàn)與X染色體失活密切相關。

以上研究不僅為某些復雜疾病的發(fā)病機制、病因和早期干預治療指明了方向，其在同卵雙生子對間發(fā)現(xiàn)的明顯差異也為甄別女性同卵雙生子提供了一種新思路。上述研究均在疾病表型不一致的同卵雙生子對之間開展，然而不管其表型是否一致，女性同卵雙生子擁有的相同父源X染色體和母源X染色體在受精卵早期分裂發(fā)育成兩個胚胎后就會發(fā)生X染色體隨機失活的現(xiàn)象[17，22-24]。這一過程將有可能導致女性同卵雙生子對間失活的X染色體存在差異，即一方父源X染色體失活，另一方母源X染色體失活。目前與X染色體失活相關的檢測位點十分有限，其檢測效率也有待考驗，大規(guī)?；瘷z測系統(tǒng)也有待完善。值得注意的是，在男性個體中，X染色體不存在失活現(xiàn)象（除生殖細胞外）[25]，因此該方法無法對男性同卵雙生子個體進行區(qū)分，這也使得這一方法用于甄別同卵雙生子的使用范圍十分有限。此外，X染色體失活在一些組織間的異質性也將影響這一方法在同卵雙生子之間的應用[15]。

2 拷貝數(shù)變異

拷貝數(shù)變異（copy number variation，CNV）是一種長度從1kb到數(shù)Mb的DNA片段拷貝數(shù)變異，主要包括DNA片段的擴增、缺失、插入、倒置等[26]。CNV是基因組結構變異的一種重要形式。在人類基因組中，發(fā)生CNV的區(qū)域約占基因組總長度的12%[26]。CNV可導致不同程度的基因表達差異，對正常表型的構成及疾病的發(fā)生發(fā)展具有一定影響[27-29]。

2008年，BRUDER等[28]以19對同卵雙生子（包括10對健康同卵雙生子）作為研究對象，使用32K BAC Array和Illumina HumanHap300 Duo BeadChip兩大芯片對外周靜脈血中DNA的CNV進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)，無論表型是否一致，同卵雙生子中均存在CNV。2012年，VEENMA等[30]檢測了在先天性膈疝和食管閉鎖兩種疾病中具有表型差異的同卵雙生子中的CNV，結果在食管閉鎖組發(fā)現(xiàn)10個生殖細胞系（germ-line）CNV。2015 年，ABDELLAOUI等[29]使用Affymetrix 6.0芯片對1 097對0～79歲同卵雙生子的血液或口腔拭子進行分析，共發(fā)現(xiàn)556個CNV，其中超過10%的同卵雙生子共同擁有的CNV有153個。這項研究也評估了不同組織來源的DNA中檢測到的CNV的一致性，結果發(fā)現(xiàn)，來源不同的DNA中CNV的一致性存在顯著的差異。

從以上研究可以看出，同卵雙生子之間存在明顯的CNV差異，這為使用CNV甄別同卵雙生子提供了堅實的理論基礎。此外，CNV的檢測方法也日趨成熟，不管是利用芯片以及高通量測序等技術完成CNV的大規(guī)模篩查，還是對于一些熱點CNV進行低通量檢測，這為后續(xù)的研究提供了一定的技術支持。對于CNV是否可以作為甄別同卵雙生子的有效手段，還有待于深入研究，比如比較不同人群中CNV的分布、CNV在不同組織以及不同環(huán)境下的穩(wěn)定性等。

3 microRNA表達

microRNA（miRNA）是一類內源性的、長度為19～24個堿基的非編碼小分子RNA。miRNA在基因的轉錄后調控等方面發(fā)揮了重要作用。miRNA由于片段、序列比較保守而具有不易降解以及表達具有時空特異性等特點。已有研究證實，miRNA表達水平在同卵雙生子之間存在差異，這提示了miRNA在同卵雙生子的甄別中具有應用價值。

2007年，PERKINS等[31]分析了精神分裂癥與健康個體之間12個miRNA在前額葉皮質中的表達情況，結果顯示，具有表型差異的個體之間miRNA的表達也存在差異。之后，KIM等[32]對精神分裂癥和雙相情感障礙患者前額葉皮質中的miRNA表達進行了研究，運用基于TaqMan低密度芯片（TaqMan low-density array，TLDA）的實時熒光定量PCR對667個miRNA的表達進行定量檢測，發(fā)現(xiàn)在精神分裂癥和雙相情感障礙中分別有7個和15個miRNA表達量存在差異，進一步提示了個體表型差異與miRNA表達之間的關系。2010年，SARACHANA等[33]采用miRNA基因芯片技術在患自閉癥表型不一致的同卵雙生子中分別檢測到miR-23a在患者中呈高表達，而miR-106b呈低表達。利用同樣的技術，在慢性肝衰竭急性發(fā)作表型不一致的同卵雙生子的研究中，也觀察到hsamiR-16和hsa-let-7a的表達會加速病程發(fā)展[34]。

如上所述，miRNA表達檢測方法十分成熟，由于其不易降解以及表達具有時空特異性等特點，使得其在法醫(yī)學上的應用不僅僅局限于同卵雙生子識別。事實上，已有大量研究顯示，miRNA在法醫(yī)學年齡推斷以及體液（斑）來源鑒定上具有廣闊的應用前景[35-37]。但是，miRNA的時空表達特異性也決定了其在同卵雙生子甄別應用中的局限性。

4 抗體庫差異

在脊椎動物適應性免疫系統(tǒng)中，個體在發(fā)育過程中根據(jù)接觸的不同抗原會經(jīng)過基因重組產生不同的抗體，形成自己特異的抗體庫基因。盡管理論上認為同卵雙生子的基因組一致，但后天的生活環(huán)境必然會存在差異，也會由于接觸不同抗原而導致抗體庫不一致?？贵w庫基因差異被認為極有可能成為識別同卵雙生子的手段之一。早在1993年，DUNLAP等[38]便以同卵雙生子和異卵雙生子作為研究對象觀察遺傳因素對抗體的影響，取血清為樣本，采用固相酶聯(lián)免疫吸附試驗測定IgG、IgM、IgA抗體水平，抗體的遺傳特性由TWINAN90進行分析，結果顯示，IgM受到基因的獨立調控，而IgG和IgA受基因調控和環(huán)境因素雙重影響，這說明抗體的產生不僅僅與遺傳因素相關，也受到環(huán)境因素的影響，因而理論上遺傳物質相同的同卵雙生子可能擁有不同的抗體。到1995年，MCHUGH等[39]針對硬皮病這一自身免疫性疾病進行了關于同卵雙生子中抗體差異的研究，以血清為樣本，由35S標記的細胞系通過免疫熒光、免疫擴散、免疫沉淀方法對抗體進行檢測，結果在患有硬皮病的個體中發(fā)現(xiàn)抗多發(fā)性肌炎硬皮病抗體、抗蘇氨酰tRNA合成酶抗體和抗拓撲異構酶Ⅰ抗體，而在正常個體中未發(fā)現(xiàn)，研究指出，同卵雙生子之間的抗體差異可能與基因重排、RNA隨機剪接、體細胞突變相關。此后多位學者對同卵雙生子之間的抗體差異進行了進一步探討。如2009年，GOUW等[40]對患有血友病A的同卵雙生子治療過程中表現(xiàn)出的、關于凝血因子Ⅷ的抗體差異進行了分析，以外周血為樣本，采用酶聯(lián)免疫吸附測定抗體滴度，發(fā)現(xiàn)同卵雙生子中凝血因子Ⅷ抗體IgG1和IgG4的含量存在差異。NINFEA等[41]對同卵雙生子抗磷脂抗體導致的血小板減少臨床表現(xiàn)的差異進行了案例報道，在進行靜脈注射免疫球蛋白和后續(xù)的利妥昔單抗治療后，同卵雙生子中的一方未發(fā)現(xiàn)血栓形成，而另一方則出現(xiàn)了肺血栓以及深靜脈血栓形成等需要抗凝治療的癥狀。這些現(xiàn)象均提示同卵雙生子之間抗體在種類和滴度方面存在差異。2013年，SVENDSEN等[42]針對27對同卵雙生子和51對異卵雙生子類風濕性關節(jié)炎發(fā)病具有差異的情況進行了研究，以外周血為樣本，采用酶聯(lián)免疫吸附測定類風濕因子IgM、IgA以及抗環(huán)瓜氨酸肽抗體，采用間接免疫熒光法測定Keratin抗體，并對抗環(huán)瓜氨酸肽抗體進行了多元線性回歸分析，結果顯示，同卵雙生子中抗環(huán)瓜氨酸肽抗體是決定個體是否患病的重要危險因子。HENSVOLD等[43]以12 590對雙生子作為研究對象，其中包括10 002對完整雙生子（28%為同卵雙生子，72%為異卵雙生子）和2588個只有一方參加的雙生子對，以外周血為樣本，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗對抗瓜氨酸抗體進行檢測，采用二項邏輯回歸模型對抗瓜氨酸抗體陽性與性別、年齡、吸煙狀況、吸煙類型、共同表位等位基因的存在及其數(shù)量之間的關系進行了分析，發(fā)現(xiàn)在未患類風濕性關節(jié)炎的情況下，抗瓜氨酸抗體在同卵雙生子中的一致率為3.7%。

綜上所述，抗體庫差異的檢測將很有可能成為甄別同卵雙生子的有效手段。目前關于抗體在同卵雙生子中差異的研究大多與疾病發(fā)生機制相關，對于其在法醫(yī)學中的應用還有待開展。其次，抗體庫種類多、易變化，目前也缺乏系統(tǒng)的檢驗方法，其可行性還有待于進一步研究。

5 展 望

理論上同卵雙生子擁有相同的基因組DNA，使用傳統(tǒng)的生物學檢測方法很難將其區(qū)分，這使得涉及同卵雙生子的案件由于無法區(qū)分犯罪者而常常不能告破，因此開發(fā)同卵雙生子甄別的有效方法是法醫(yī)學領域迫切需要解決的問題。

前期研究發(fā)現(xiàn)DNA甲基化修飾、X染色體失活、CNV、miRNA表達活性、抗體庫均在同卵雙生子對中出現(xiàn)了差異，然而這些研究涉及的雙生子對大多數(shù)為一方患有疾病，而在健康同卵雙生子對中開展的研究較少。作為甄別同卵雙生子的遺傳標記，需要具備較好的穩(wěn)定性、良好的多態(tài)性等，并且具有完備便捷的檢測系統(tǒng)和計算方法。因此，在健康同卵雙生子中的實驗有待進一步開展，對這些遺傳標記在不同條件下的穩(wěn)定性也有待評估，篩選出一種穩(wěn)定的、可區(qū)分同卵雙生子的遺傳標記并開發(fā)出一套完整便捷的計算檢測方法，將成為未來甄別同卵雙生子的主要任務之一。