李陽友，黃靜，郭洋，項(xiàng)濤，吳大鵬，陳丹，楊正偉

(川北醫(yī)學(xué)院，1.動(dòng)物發(fā)育研究室；2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；3.形態(tài)定量研究室，四川 南充 637000)

對(duì)大鼠重要免疫器官脾臟的發(fā)育情況的研究不多。筆者最近采用1日、1月和3～12月齡的同群動(dòng)物，根據(jù)體視學(xué)方法定量研究了大鼠脾內(nèi)各種主要組織結(jié)構(gòu)的總體積，結(jié)果表明，3月齡大鼠脾臟已形成各種主要結(jié)構(gòu)，3至12月齡脾臟各種結(jié)構(gòu)的總體積變化較小，脾內(nèi)紅髓、白髓所占體積比例穩(wěn)定，因此我們得出結(jié)論：3月齡前大鼠脾臟生長(zhǎng)快速并發(fā)育成熟，之后只有一定程度的繼續(xù)生長(zhǎng)[1]。但是，關(guān)于2月齡大鼠(相當(dāng)于大鼠成年前[2])脾臟是否已發(fā)育成熟和2～3年齡大鼠(相當(dāng)于老年后[2])脾臟是否會(huì)萎縮的重要問題，我們?nèi)詻]有答案。為回答這2個(gè)問題，我們進(jìn)行了這項(xiàng)補(bǔ)充完善研究：采用從同一群動(dòng)物所取的脾臟——以前已取的2月齡大鼠脾臟以及后來所取的2年和3年齡大鼠脾臟，并用同樣的體視學(xué)方法定量研究這些大鼠脾臟。

1 材料和方法

本文所用動(dòng)物與方法，基本同筆者以前所述[1]。簡(jiǎn)要地講，從一群正常雄性Sprague-Dawley大鼠，分別隨機(jī)抽選2月齡(59～61 d齡)和24月齡大鼠各9只，36月齡時(shí)取實(shí)驗(yàn)最后所剩8只大鼠。2月齡動(dòng)物經(jīng)腹取脾并用Bouin液浸潤固定[1]。2～3年齡動(dòng)物經(jīng)心臟先后用250 mL生理鹽水和250 mL Bouin液灌注(固定)之后，再進(jìn)一步浸潤固定處理。沿垂直于脾臟長(zhǎng)軸的大致方向，從每個(gè)脾臟等距隨機(jī)橫向切取2個(gè)組織塊，用甲基丙烯酸樹脂包埋后從每塊切取1張10 μm厚的切片，經(jīng)HE染色后用體視學(xué)圖像系統(tǒng)觀測(cè)切片。在切片上等距隨機(jī)抽選測(cè)試視野(視野間距1 000 μm)，視野上疊加2排共4個(gè)等距排列的測(cè)點(diǎn)，根據(jù)測(cè)點(diǎn)計(jì)數(shù)估計(jì)各種組織結(jié)構(gòu)(圖1)脾內(nèi)所占體積比例，結(jié)合脾臟體積進(jìn)一步估計(jì)脾內(nèi)結(jié)構(gòu)的總體積。每個(gè)脾臟的2張切片上，總共計(jì)數(shù)了平均218個(gè)測(cè)點(diǎn)。

2 結(jié)果

2月齡大鼠脾臟切片上，仍可見巨核細(xì)胞(圖1)，但2～3年齡大鼠脾臟里，已沒有巨核細(xì)胞。

與2月齡大鼠相比，2年齡大鼠脾臟體積的平均增加46%；與2年齡相比，3年齡大鼠脾臟體積有減少(9%)的趨勢(shì)(表1)。紅髓或白髓在脾內(nèi)所占體積比例(分別為70%～76%、17%～21%)，3個(gè)年齡組間無顯著差異(單因素方差分析)。

與2月齡大鼠相比：2年齡大鼠脾血竇總體積的平均減少36%，而脾索總體積的平均增加107%；脾小結(jié)總體積的平均只增加4%，而動(dòng)脈周圍淋巴鞘和邊緣區(qū)總體積的平均分別增加62%和92%(表1)。

表1 大鼠脾臟體積和脾內(nèi)結(jié)構(gòu)總體積(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，mm3)

2月齡組(n=9)2年齡組(n=9)3年齡組(n=8)脾臟 871±301?1275±3041160±308紅髓667±242931±287818±274 脾血竇腔314±152#200±94176±113 脾索353±212?#731±221643±171白髓149±68231±91239±129 脾小結(jié)48±3450±3669±42 動(dòng)脈周圍淋巴鞘47±3776±3184±44 邊緣區(qū)55±28105±4886±54間質(zhì)54±16?#113±44103±33

與2年齡*、3年齡#相比：P≤0.05(秩次單因素方差分析結(jié)合Dunn法多重對(duì)比)。

3 討論

前期研究表明，28～35日齡的Sprague-Dawley大鼠脾臟，仍未完全形成脾小結(jié)[1,3-4]；至42日齡時(shí)，所有脾臟均有脾小結(jié)形成[3]；8周時(shí)，白髓結(jié)構(gòu)典型[4]。本文的研究表明，2月齡大鼠脾臟已形成各種主要結(jié)構(gòu)。與1月齡同群大鼠[1]相比，2月齡大鼠脾臟體積的平均增加了約260%；而從2月齡至2年齡，脾臟體積的平均只增加了46%，且已達(dá)到高峰(從1年齡[1]至2年齡脾臟體積的平均增加了29%)，至3年齡時(shí)有開始減少的趨勢(shì)(3年齡與2年齡相比減少9%)。從2月齡至3年齡，紅髓或白髓在脾內(nèi)所占體積比例的變化不明顯。這說明，總的來講，大鼠脾臟的發(fā)育，在2月齡時(shí)(成年前或幼年末期)就已成熟，但至2～3年齡(老年后)時(shí)仍未見明顯萎縮的跡象。

生成血小板的巨核細(xì)胞(圖1)，是切片上最易辨認(rèn)的造血細(xì)胞。人出生之后脾內(nèi)即沒有巨核細(xì)胞，但某些動(dòng)物(例如嚙齒和貓科動(dòng)物)出生后仍可見[5]。仔細(xì)觀察前期研究[1]和本文研究的切片，筆者見出生時(shí)大鼠脾臟的每張切片上有十來個(gè)巨核細(xì)胞，1月齡時(shí)最多，可見一二十個(gè)，2月齡時(shí)仍可見幾個(gè)，3月及以上就完全沒有了。這提示，成年前(2月齡及以前)的大鼠脾臟仍有明顯的造血功能。

筆者的前期研究[1]和本文的補(bǔ)充研究表明，1月齡大鼠脾血竇腔開始出現(xiàn)紅細(xì)胞，至2月齡時(shí)脾血竇腔的總體積(平均314 mm3)迅速達(dá)到高峰，一直維持到3～12月齡(285～332 mm3)，至2～3年齡時(shí)大幅下降(176～200 mm3)。如果沒有受到固定方法(2～3年齡動(dòng)物所取標(biāo)本事先做了灌注固定)的影響，這個(gè)結(jié)果可能說明2～3年齡動(dòng)物脾內(nèi)血流量減少。就是說，盡管脾臟大小在2～3年齡時(shí)為最大，但其功能其實(shí)可能已減弱。

筆者前期和本文研究也表明，脾小結(jié)(生發(fā)中心)從2月齡開始出現(xiàn)后，其總體積直至2～3年齡也沒有多大增加，且其在脾內(nèi)所占體積比例一直比較小(約5%以內(nèi))。這提示，正常大鼠生長(zhǎng)、生存期間，脾小結(jié)(生發(fā)中心)相關(guān)功能(體液免疫)比較穩(wěn)定，不活躍。

脾臟由非常密集的細(xì)胞(淋巴細(xì)胞等)構(gòu)成，其中主要是穿流血液的、由相對(duì)較稀疏排列的細(xì)胞構(gòu)成的紅髓部分，其在脾內(nèi)所占體積比例約70%以上。紅髓和白髓的辨認(rèn)相對(duì)較易，因此其定量研究結(jié)果相對(duì)較可靠。白髓內(nèi)動(dòng)脈周圍淋巴鞘和脾小結(jié)帽在切片上的準(zhǔn)確區(qū)別有一定難度(圖1)。為增加準(zhǔn)確性，研究中我們實(shí)際上把脾小結(jié)定義為白髓里面的淡染區(qū)域——淋巴小結(jié)的生發(fā)中心。紅髓內(nèi)脾索和脾血竇的區(qū)別難度更大(圖1)，盡管我們定義的脾血竇實(shí)際上是血竇腔[1]。因此，就各種脾臟組織結(jié)構(gòu)的定量研究而言，筆者前期和本文的研究的可靠性問題仍有值得進(jìn)一步思考之處。例如，是否有并應(yīng)采用更好的染色方法。不過，正如筆者已指出的那樣[1]，相對(duì)于個(gè)體差異對(duì)定量研究的影響而言，這個(gè)問題也許并不那么重要。

[1] 李陽友，黃靜，郭洋，等.大鼠脾臟主要結(jié)構(gòu)的發(fā)育——從出生至12月齡的形態(tài)學(xué)定量[J].解剖學(xué)報(bào)，2017，48(3): 348-352.

[2] 施新猷.醫(yī)用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)[M].西安:陜西科學(xué)技術(shù)出版社，1989:388.

[3] Parker GA，Picut CA，Swanson C，etal.Histologic features of postnatal development of immune system organs in the Sprague-Dawley rat[J].Toxicol Pathol，2015，43(6):794-815.

[4] 周宬玥，馮利杰，沈玉君，等.大鼠出生后不同時(shí)期脾臟結(jié)構(gòu)發(fā)育和漿細(xì)胞分化[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，47(7):796799.

[5] Ross MH，Romrell LJ，Kaye GI.Histology:a Text and Atlas[M].Baltimore: Williams & Wilkins，1995.349.