張麗鵬，榮春書，谷一鳴，傅耀文，高寶山

(1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院泌尿系統(tǒng)疾病診治中心，吉林 長春 130021；2.長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院腦病科，吉林 長春 130021)

B淋巴細(xì)胞在器官移植領(lǐng)域具有重要作用。近年來B淋巴細(xì)胞在移植免疫耐受中所發(fā)揮的作用越來越受到關(guān)注。諸多研究[1-12]顯示在免疫耐受移植患者中存在獨(dú)特的B淋巴細(xì)胞標(biāo)志。有研究[4,6]顯示：免疫耐受的移植患者部分免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)的基因表達(dá)量明顯上升。既往多數(shù)針對腎移植免疫耐受的研究[1,4,7]顯示：其研究對象往往是因免疫抑制劑出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥而被迫停用或免疫抑制劑不耐受的患者，故免疫耐受的準(zhǔn)確時間窗很難捕捉，影響了相關(guān)研究的準(zhǔn)確性。為進(jìn)一步揭示B淋巴細(xì)胞在器官移植誘導(dǎo)免疫耐受中的重構(gòu)動態(tài)及分布特點(diǎn)，本文作者以5例腎-骨髓聯(lián)合移植患者為研究對象，其中有3例患者成功達(dá)到免疫耐受，并完成免疫抑制劑的撤除[13-14]。此類患者由于是操控性免疫耐受，臨床治療的時點(diǎn)、預(yù)處理方案的應(yīng)用、免疫抑制劑撤除的時點(diǎn)及免疫耐受建立的時點(diǎn)均有準(zhǔn)確的記錄，為研究的一致性及準(zhǔn)確性提供了保障。利用這些患者的標(biāo)本，從細(xì)胞表型及基因序列分析方面研究腎-骨髓聯(lián)合移植患者外周血B淋巴細(xì)胞重構(gòu)的特點(diǎn)，找出不同時點(diǎn)外周血優(yōu)勢B淋巴細(xì)胞亞群。為進(jìn)一步研究B淋巴細(xì)胞在器官移植免疫耐受建立中發(fā)揮的作用提供依據(jù)。

1　資料與方法

1.1研究對象診斷標(biāo)準(zhǔn)：各種腎臟疾病導(dǎo)致的不可逆的慢性腎臟功能衰竭。入選標(biāo)準(zhǔn)：年齡>18周歲，首次腎臟移植。排除標(biāo)準(zhǔn)：存在嚴(yán)重的心、肺疾病，存在活動性感染，嚴(yán)重的消化系統(tǒng)潰瘍，明顯的凝血功能異常，并發(fā)惡性腫瘤，需多器官移植，對免疫抑制劑不耐受。研究所用標(biāo)本來自5例接受腎-骨髓聯(lián)合移植手術(shù)的患者?；颊呓邮芰巳肆馨图?xì)胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)半相合的腎-骨髓聯(lián)合移植，患者編碼分別為Pt.A、Pt.B、Pt.C、Pt.D和Pt.E?；颊咭话阗Y料見表1。

1.2免疫誘導(dǎo)和免疫抑制方案術(shù)前7 d、2 d及術(shù)后5 d和12 d分別給予利妥昔單抗，375 mg·m-2；術(shù)前5 d及4 d環(huán)磷酰胺60 mg·kg-1靜脈注射；術(shù)前2 d抗CD2單克隆抗體0.1 mg·kg-1，移植當(dāng)日(0 d)及術(shù)后1 d給予0.6 mg·kg-1；術(shù)前1 d胸腺放射線照射，700 cGy；手術(shù)當(dāng)日(0 d)，行同種異體腎移植手術(shù)，輸供者骨髓細(xì)胞(2～8)×108kg-1；術(shù)前1 d開始他克莫司0.1 mg·kg-1·d-1口服，術(shù)后逐漸減量應(yīng)用，至術(shù)后8個月時停用；醋酸潑尼松片自手術(shù)當(dāng)日起2 mg·kg-1·d-1口服，至術(shù)后20 d停用。

1.3患者隨訪患者術(shù)后依據(jù)隨訪計(jì)劃定期隨訪，如少尿、發(fā)熱、移植腎區(qū)疼痛時隨時就診。因Pt.C術(shù)后6個月時移植腎功能喪夫終止隨訪外，其余患者隨訪時間為3.0～5.0年，平均隨訪時間為4.3年。

表1　5例患者的一般資料

FSGS：Focal segmental glomerular sclerosis; MPGN：Mesangial proliferative glomerular nephritis; “-”:No data..

1.4實(shí)驗(yàn)方法外周血B淋巴細(xì)胞表型鑒定：外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell， PBMC)加入APC耦聯(lián)的抗CD19抗體(英國Becton Dickinson公司)、FITC耦聯(lián)的抗CD24抗體(美國BD Biosciences公司)、APC/Cy7耦聯(lián)的抗CD27抗體(美國Biolegend公司)、PE耦聯(lián)的抗CD38抗體(英國Becton Dickinson公司)，混勻細(xì)胞，于4℃避光靜置30 min，4℃ PBS洗滌2次后，應(yīng)用FACSVerse流式細(xì)胞儀(美國BD Biosciences公司)檢測細(xì)胞表面標(biāo)志。B淋巴細(xì)胞數(shù)量以絕對值表示(個/μL)，B淋巴細(xì)胞所占比例以百分比(%)表示。重組免疫球蛋白重鏈可變區(qū)(immunoglobulin heavy chain variable region，IGHV)基因分析：從PBMC提取RNA，以RNA為模板合成cDNA，再以合成的cNDA作為模板，用6種分別針對IGHV 6個家族基因(VH1～VH6)的正向引物及共同的恒定反向引物(JH)行PCR。將各時點(diǎn)DNA產(chǎn)物充分混勻，DNA的濃度為10 mg·L-1，取100 μL樣本，干冰冷凍包裝，寄往Beckman-coulter Genomics Services行DNA序列檢測。

重組IGHV基因序列及體細(xì)胞突變分析：經(jīng)檢測的IGHV應(yīng)用免疫球蛋白分析軟件IgAT分析[15]。利用此軟件，每個基因序列中的框架區(qū)序列(FR1～FR3)以及互補(bǔ)決定區(qū)序列(CDR1～CDR3)均可被鑒別分析。利用基因序列中互補(bǔ)決定區(qū)序列3(complementarity determining region 3，CDR3)序列高度變異性的特性，如果諸多DNA序列中含有相同的CDR3序列，則認(rèn)為這些DNA序列來源于同一個B淋巴細(xì)胞克隆，并據(jù)此分析B淋巴細(xì)胞的基因譜構(gòu)成。同樣，IGHV的高頻體細(xì)胞突變(somatic hypermutation，SHM)也用IgAT分析軟件加以鑒別。計(jì)算體細(xì)胞突變比例以揭示不同時點(diǎn)外周血B淋巴細(xì)胞基因序列突變情況。計(jì)算香農(nóng)指數(shù)(Shannon diversity index，SDI)，用以反映不同時點(diǎn)B淋巴細(xì)胞基因序列的多樣性分布。SDI越高，說明基因多樣性越強(qiáng)。

1.5患者預(yù)后Pt.C移植術(shù)后6個月時因血栓性微血管病移植腎功能喪失，該患者未納入后續(xù)研究。余下的4例患者，免疫抑制劑逐漸減量并于術(shù)后8個月停用。Pt.A、Pt.B和Pt.D移植術(shù)后4～5年時間內(nèi)移植腎功能保持穩(wěn)定。Pt.E停用免疫抑制劑后2個月時出現(xiàn)了急性T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的排異反應(yīng)，重新應(yīng)用免疫抑制劑，但該患者移植腎功能未恢復(fù)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。組間IGHV基因序列的SDI比較采用Studentt檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1腎-骨髓聯(lián)合移植患者外周血B淋巴細(xì)胞的重構(gòu)因入組患者移植術(shù)前及術(shù)后應(yīng)用了利妥昔單抗，因此幾乎清除了外周血中所有B淋巴細(xì)胞。如圖1A所示，B淋巴細(xì)胞重構(gòu)的動態(tài)變化在患者之間變異較大，Pt.A 的B淋巴細(xì)胞重構(gòu)最早，Pt.B和Pt.D外周血B淋巴細(xì)胞重構(gòu)相對較晚，而Pt.E外周血B淋巴細(xì)胞重構(gòu)最晚，術(shù)后1年時外周血B淋巴細(xì)胞數(shù)量仍處于極低水平，此患者術(shù)后10個月時發(fā)生了移植腎排異反應(yīng)。除了Pt.E外周血B淋巴細(xì)胞重構(gòu)延遲外，Pt.A、Pt.B和Pt.D均在術(shù)后1年左右外周血B淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)基本恢復(fù)術(shù)前的水平(30～40 μL-1)。盡管患者術(shù)后早期外周血B淋巴細(xì)胞被完全清除，但術(shù)后182 d時點(diǎn)所有患者外周血中均檢測到少量B淋巴細(xì)胞。本文作者對不同時點(diǎn)每例患者的外周血B淋巴細(xì)胞進(jìn)行了表型鑒定，如圖1B所示，術(shù)后182 d時，以表達(dá)CD19+CD24highCD38high為特征的過渡性B淋巴細(xì)胞總體來說比例非常低：182 d時，過渡性B淋巴細(xì)胞約占Pt.B外周血B淋巴細(xì)胞的5%，而Pt.A、Pt.D和Pt.E在這個時間點(diǎn)幾乎檢測不到過渡性B淋巴細(xì)胞。

相反，所有患者術(shù)后182 d的B淋巴細(xì)胞是以表達(dá)CD20+CD27+ 的記憶性B淋巴細(xì)胞為主，此時點(diǎn)的記憶性B淋巴細(xì)胞占外周血B淋巴細(xì)胞的60%～90%(圖1C)。這些記憶性B淋巴細(xì)胞很可能是逃脫B淋巴細(xì)胞清除劑利妥昔單抗后殘留下來的。此后時間點(diǎn)，記憶性B淋巴細(xì)胞的百分比快速下降至很低水平。

A: Absolute nubmer of B cells; B: Percentage of translational B lymphocytes; C: Percentage of memory B lymphocytes.

2.2腎-骨髓聯(lián)合移植患者外周血B淋巴細(xì)胞IGHV基因譜為了從細(xì)胞克隆水平評價患者外周血B淋巴細(xì)胞的重構(gòu)特點(diǎn)，本文作者利用下一代基因測序手段從具有代表性的時點(diǎn)標(biāo)本中獲得了2 500～28 500個可讀的基因序列，并分析所有基因序列中的CDR3片段，將具有相同CDR3片段的基因序列重新排列，獲得每個時點(diǎn)樣本B淋巴細(xì)胞基因序列的分布圖。如圖2～5(插頁六)所示，基因分布圖顯示了患者移植術(shù)后每個時點(diǎn)外周血B淋巴細(xì)胞的IGHV家族(VH1～VH6)CDR3序列的分布頻數(shù)?；颊咭浦残g(shù)前、術(shù)后364 d及728 d時B淋巴細(xì)胞基因圖譜呈多樣性分布。盡管在移植術(shù)后182 d時B淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)很低，但本文作者仍依靠此策略從每例患者的標(biāo)本中獲得了足夠的B淋巴細(xì)胞IGHV基因序列以供分析。結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)移植術(shù)后182 d時確實(shí)有極少量特定亞群的B淋巴細(xì)胞仍存在于患者外周血中。而此時點(diǎn)的B淋巴細(xì)胞基因圖譜與其他時間點(diǎn)的圖譜具有很大差異，B淋巴細(xì)胞池中僅存在少量具有優(yōu)勢分布的B淋巴細(xì)胞克隆。結(jié)合B淋巴細(xì)胞表型鑒定的結(jié)果綜合分析則進(jìn)一步證實(shí)：此時點(diǎn)發(fā)現(xiàn)的外周血B淋巴細(xì)胞很可能是經(jīng)利妥昔單抗誘導(dǎo)治療后殘存的記憶性B淋巴細(xì)胞。

2.3患者外周血B淋巴細(xì)胞IGHV基因序列的多樣性作為IGHV基因序列多樣性的直觀指標(biāo)，本文作者計(jì)算了多時點(diǎn)基因序列的多樣性指數(shù)——SDI。結(jié)果顯示:所有患者在術(shù)后182 d時點(diǎn)IGHV基因序列的SDI明顯低于術(shù)前(P=0.004)，此指數(shù)在術(shù)后1年左右逐漸恢復(fù)。見圖6。

2.4外周血B淋巴細(xì)胞IGHV基因序列體細(xì)胞突變除了Pt.B，其他患者基因序列的體細(xì)胞突變率在術(shù)后182 d時點(diǎn)明顯升高(P=0.032)，對應(yīng)了在此時間點(diǎn)上記憶性B淋巴細(xì)胞是外周血B淋巴細(xì)胞的優(yōu)勢亞群。Pt.B是唯一在術(shù)后182 d時點(diǎn)檢出過渡性B淋巴細(xì)胞的患者，由于過渡性B淋巴細(xì)胞是幼稚細(xì)胞，因此該患者此時點(diǎn)的B淋巴細(xì)胞基因序列體細(xì)胞突變率呈下降趨勢。見圖7。

A:Pt.A；B：Pt.B；C：Pt.D；D：Pt.E.

A:Pt.A；B：Pt.B；C：Pt.D；D：Pt.E.

Somatic mutations (SHM) within IGHV sequences were identified using IgAT software. SHM rates were calculated for all time points. The total number of sequences analyzed for each sample was indicated below the time point markers.

圖7不同時間點(diǎn)患者外周血IGHV基因序列體細(xì)胞突變率分析

Fig.7Analysis of somatic mutation rates of sequences of IGHV in peripheral blood of patients at different time points

3　討　論

本研究檢測了腎-骨髓聯(lián)合移植并達(dá)到誘導(dǎo)免疫耐受患者B淋巴細(xì)胞的重構(gòu)。這個臨床方案為本文作者提供了準(zhǔn)確的研究時間窗，以便研究在免疫耐受誘導(dǎo)中B淋巴細(xì)胞的分布特性以及鑒別哪種特定B淋巴細(xì)胞亞群可能對潛在的免疫耐受機(jī)制發(fā)揮作用。

本研究結(jié)果顯示：腎-骨髓聯(lián)合移植后，患者外周血B淋巴細(xì)胞池逐漸恢復(fù)重構(gòu)。在重構(gòu)過程中，外周血B淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)個體之間差異很大，Pt.B的淋巴細(xì)胞重構(gòu)較早，而Pt.A和Pt.D的B淋巴細(xì)胞重構(gòu)相對較晚；Pt.E的B淋巴細(xì)胞重構(gòu)最晚，此患者移植術(shù)后10個月時經(jīng)歷了移植腎排異反應(yīng)并應(yīng)用糖皮質(zhì)激素及抗胸腺細(xì)胞免疫球蛋白治療。細(xì)胞表型研究結(jié)果顯示：盡管器官移植早期外周血B淋巴細(xì)胞的絕對計(jì)數(shù)較低，但呈現(xiàn)出很高比例的表達(dá)CD27+的 B淋巴細(xì)胞。此細(xì)胞亞群很可能是利妥昔單抗處理后，未被清除的記憶性B淋巴細(xì)胞。由于記憶性B淋巴細(xì)胞與未成熟B淋巴細(xì)胞相比更易逃脫利妥昔單抗的清除。而在B淋巴細(xì)胞極度缺乏時，將出現(xiàn)B淋巴細(xì)胞的自適應(yīng)增殖[16]，同時因記憶性B淋巴細(xì)胞的自適應(yīng)增殖效率高于未成熟B淋巴細(xì)胞[17]，因此移植術(shù)后早期表現(xiàn)為以CD20+CD27+為優(yōu)勢亞群的B淋巴細(xì)胞。腎移植術(shù)后相對較晚的時點(diǎn)，待免疫抑制劑撤除后，過渡性B淋巴細(xì)胞的比例及絕對值有較大的波動。第2代測序?qū)λ?例患者術(shù)后6個月IGHV基因的分析發(fā)現(xiàn)B淋巴細(xì)胞的基因圖譜分布變化，恰好證實(shí)這一點(diǎn)。此時點(diǎn)IGHV基因的高頻率體細(xì)胞突變進(jìn)一步證實(shí)這些細(xì)胞是分化的記憶性B淋巴細(xì)胞。盡管存在個體上的差異，但總體來說，移植術(shù)后1年時點(diǎn)，隨著新產(chǎn)生的未成熟過渡性B淋巴細(xì)胞的出現(xiàn)，整體外周血B淋巴細(xì)胞組成基本恢復(fù)術(shù)前狀態(tài)。這種B淋巴細(xì)胞組成的恢復(fù)同時伴隨有IGHV基因SDI的上升以及突變基因頻數(shù)的下降。

Blair等[18]研究發(fā)現(xiàn)：過渡性B淋巴細(xì)胞具有調(diào)節(jié)功能，尤其是通過分泌IL-10而實(shí)現(xiàn)。本研究及其他研究[1,4-5,7]均顯示：在免疫耐受患者中過渡性B淋巴細(xì)胞上升。盡管觀察到此現(xiàn)象，但仍不能能認(rèn)為過渡性B淋巴細(xì)胞是一個關(guān)鍵的免疫耐受因素。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為：外周血中檢測到的過渡性B淋巴細(xì)胞尚未經(jīng)歷抗原刺激，故不太可能在體內(nèi)有確切的功能。然而，B淋巴細(xì)胞的調(diào)節(jié)功能需要持續(xù)的刺激、使之失去未成熟的表型才能實(shí)現(xiàn)。

當(dāng)然，調(diào)節(jié)性B淋巴細(xì)胞在體內(nèi)可以從過渡性B淋巴細(xì)胞分化而來，但調(diào)節(jié)性B淋巴細(xì)胞在分化過程中將失去未成熟的細(xì)胞表面標(biāo)志。因此很難說外周血標(biāo)本中檢測到的過渡性B淋巴細(xì)胞在免疫耐受中起到關(guān)鍵性的作用。相反，患者在免疫耐受誘導(dǎo)過程中，記憶性B淋巴細(xì)胞是主要的細(xì)胞亞群。以往的研究[1,4,7,19]也曾顯示記憶性B淋巴細(xì)胞的增加與誘導(dǎo)免疫耐受有關(guān)，由于這些研究的主要目標(biāo)是觀察過渡性B淋巴細(xì)胞與免疫耐受的關(guān)系，因此這些結(jié)果并未得到足夠的重視。而且有研究[20-21]顯示：記憶性B淋巴細(xì)胞也具有免疫調(diào)節(jié)的作用。結(jié)合以往相關(guān)的研究結(jié)果本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：記憶性B淋巴細(xì)胞很可能在腎-骨髓聯(lián)合移植患者中參與免疫耐受。但在患者外周血中發(fā)現(xiàn)的過渡性B淋巴細(xì)胞在免疫耐受建立的時間點(diǎn)很可能并未發(fā)揮關(guān)鍵性作用[22]。

本研究利用腎-骨髓聯(lián)合移植患者的臨床標(biāo)本及資料，充分發(fā)揮此類患者臨床干預(yù)及免疫耐受建立具有準(zhǔn)確時間窗的優(yōu)勢，從細(xì)胞表型及基因序列分析方面研究腎-骨髓聯(lián)合移植患者外周血B淋巴細(xì)胞重構(gòu)的組成成分以及分布特點(diǎn)，找出不同時點(diǎn)的外周血優(yōu)勢B淋巴細(xì)胞亞群，為進(jìn)一步研究B淋巴細(xì)胞在器官移植免疫耐受建立中發(fā)揮的作用提供了依據(jù)。

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