林晴 姚吉龍

原發(fā)性卵巢功能不全 (primary ovarian insufficiency，POI) 是指發(fā)育正常女性在40歲前因各種原因引起的卵巢功能提前衰退的疾病，表現(xiàn)為繼發(fā)性閉經(jīng)、低雌激素[雌二醇(estradiol,E2< 73.2 pmol/L) ]與高促性腺激素[卵泡刺激素(follicle stimulating hormon，F(xiàn)SH)>40 U/L]、高黃體生成素[(1uteinizing hormon，LH)>30 U/L) ][1]。POI病理基礎(chǔ)為卵巢組織內(nèi)卵泡幾乎消耗殆盡，可表現(xiàn)為原發(fā)性或繼發(fā)性閉經(jīng)[2]。繼發(fā)性閉經(jīng)患者中POI發(fā)生率為4%～18%[3]。POI病因復(fù)雜，大部分病例找不到明確病因，稱(chēng)特發(fā)性POI?；颊呷旧w檢查正常，自身免疫抗體檢查正常等，約占POI患者74%～90%.因病因不明給治療帶來(lái)困難。POI可發(fā)生在青春期前、青春期或生育期[4]。POI患者的卵巢組織學(xué)呈圍絕經(jīng)期或者絕經(jīng)后改變。據(jù)統(tǒng)計(jì)，40歲前POI發(fā)病率約1%，30歲前發(fā)病率約0.1%，20 歲前發(fā)病率約0.01%[5]。據(jù)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)分析，POI有發(fā)病率上升、發(fā)病年輕化趨勢(shì)。研究提示多種基因參加了POI調(diào)節(jié)，細(xì)胞色素P450C17 酶(cytochrome P450 17 hydroxylase，CYP17)基因多態(tài)性和多種雌激素(estrogen E)有關(guān)疾病相關(guān)，CYP17是雌激素合成與代謝中的關(guān)鍵酶，它的基因的多態(tài)性可能改變了酶含量與酶活性進(jìn)而影響到雌激素的代謝與生物學(xué)效應(yīng)，導(dǎo)致內(nèi)分泌激素紊亂[6]，正常月經(jīng)周期改變，發(fā)展到閉經(jīng)，嚴(yán)重者發(fā)生POI。本文擬了解CYP17基因與POI之間的關(guān)系，進(jìn)而為研究POI患者個(gè)體化治療和預(yù)后提供依據(jù)。

對(duì)象與方法

1.對(duì)象：選擇2014年2月至2015年9月在深圳婦幼保健院婦科門(mén)診診斷的無(wú)明確病因的POI女性132例為病例組。病例組同時(shí)要滿(mǎn)足以下標(biāo)準(zhǔn)，即(1)年齡小于40周歲，有4個(gè)月經(jīng)周期或以上無(wú)月經(jīng)來(lái)潮；(2)大于等于兩次空腹血清FSH > 40 U/L (需間隔1個(gè)或以上周期)；(3)血清催乳素(prolactin，PRL)正常；(4)需排除染色體異常、免疫、感染、放化療等導(dǎo)致疾病的原因。對(duì)照組是同 一個(gè)時(shí)期由于其他病因就診的、年紀(jì)相當(dāng)、月經(jīng)規(guī)則、性激素檢查無(wú)異常、彩超顯示卵巢大小形態(tài)正常的132例患者。兩組患者年齡、初潮年齡、BMI的比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩組FSH、E2、LH差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

表1 兩組患者的一般資料比較

注：*P<0.05

2.實(shí)驗(yàn)方法：病例組要求1個(gè)月內(nèi)未使用激素類(lèi)藥物，早晨空腹抽取肘靜脈血，對(duì)照組則于月經(jīng)周期的第3天早晨空腹抽取肘靜脈血。予枸櫞酸鈉抗凝管取5ml靜脈血，置于-70℃超低溫冰箱。提取保存的外周靜脈血0.5 ml，種在RPMI1640的培養(yǎng)基里，經(jīng)過(guò)一系列處理，用相關(guān)分析軟件[DNA序列讀取軟件：Chromas(version2.41); 凝膠成像、掃描分析軟件和其他軟件:Grab-IT 2.UVP Gelworks ID advanced version 2.5等]行核型的分析研究。另外取外周靜脈血1ml進(jìn)行免疫全套檢測(cè)、甲狀腺功能檢查等。在本院中心實(shí)驗(yàn)室里用間接免疫熒光的方法檢測(cè)抗Sm抗體、抗卵巢抗體(AOAb)、抗Jo-1抗體、抗核抗體(ANA)、抗SCL-70抗體、抗ssA抗體等。實(shí)驗(yàn)用飽和酚/氯仿法，獲得目的基因DNA片段。使用紫外分光光度計(jì)來(lái)進(jìn)行分別測(cè)量OD260及OD280，算出DNA濃度及OD260/OD280的比值。選取基因組的DNA濃度范圍是10～200 ug/ml，OD260/OD280的范圍是1.6～1.9。在NCBI網(wǎng)站的數(shù)據(jù)庫(kù)查找到CYP17基因的SNPs的有關(guān)的序列，選擇CYP17基因外顯包子，應(yīng)用引物設(shè)計(jì)的軟件設(shè)計(jì)正反向引物，進(jìn)行擴(kuò)增CYP17基因外顯子，含外顯子的編碼區(qū)及有關(guān)側(cè)翼序列。見(jiàn)表2。

表2 CYP17基因引物的詳細(xì)信息及相應(yīng)的退火溫度

注：NA表示不適用

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：用SHEsis軟件來(lái)進(jìn)行單個(gè)多態(tài)位點(diǎn)基因型頻率及等位基因頻率統(tǒng)計(jì)，對(duì)于基因型、等位基因型的頻率，分別行病例組、對(duì)照組的卡方檢驗(yàn)，應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。對(duì)于以前有報(bào)道的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)，用卡方檢驗(yàn)分析。研究CYP17基因在不同的人群里的分布狀況。所有P值均基于雙側(cè)檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，若為多重檢驗(yàn)行Bonferroni校正。

結(jié)果

用綜合性序列分析軟件包(DNAStar軟件包)、序列對(duì)比軟件(Seqman軟件)對(duì)病例組和對(duì)照組的CYP17基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接與對(duì)比分析。所得結(jié)果與美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)的SNPs數(shù)據(jù)庫(kù)已記錄的SNPs比較。提示在病例組和對(duì)照組里面都檢測(cè)到了CYP17基因突變位點(diǎn)。一共發(fā)現(xiàn)6個(gè)SNPs，均是二等位基因型。其中轉(zhuǎn)換為6個(gè)(2個(gè)為A/G，3個(gè)為T(mén)/C，1個(gè)為G/A)。病例組和對(duì)照組外周血CYP17基因的測(cè)序中發(fā)現(xiàn)的6個(gè)SNPs里面，其中有兩個(gè)是新發(fā)現(xiàn)，即內(nèi)含子G-14A及外顯子c.61 G>A，其余4個(gè)則是NCBI的SNPs數(shù)據(jù)庫(kù)中已有記錄的。見(jiàn)表3。

所有6個(gè)SNPs中，基因頻率測(cè)定結(jié)果顯示CYP17基因的SNPs中4個(gè)是常見(jiàn)的SNPs，次要等位基因頻率(minor allele frequency，MAF)都大于5%，2個(gè)是罕見(jiàn)的SNPs。對(duì)病例組和對(duì)照組中CYP17基因的6個(gè)SNPs進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)rs1004467、c.666+35T>C的等位基因頻率和基因型頻率在兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，rs743572(T-34C)、rs6162(c.138C>T)、rs6163(c.200G>T) 的等位基因頻率和基因型頻率在兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表4、表5。

表3 病例組與對(duì)照組檢測(cè)到的CYP17基因序列的變異

注：NA表示不適用

表4 CYP17基因突變位點(diǎn)的基因型和等位基因型頻率統(tǒng)計(jì)分析

注：兩組等位基因型和基因型頻率分別比較，*P<0.05

表5 POI患者CYP17基因型二分類(lèi)條件Logistic 回歸分析

討論

POI是指在40歲之前便出現(xiàn)了閉經(jīng)、促性腺激素的升高、雌激素的缺乏。迄今仍無(wú)統(tǒng)一的國(guó)際公認(rèn)的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]。卵巢反應(yīng)不良(POR)是指在輔助生殖技術(shù)實(shí)行的過(guò)程中，卵巢對(duì)促性腺激素的刺激反應(yīng)不良狀態(tài)。多數(shù)的表現(xiàn)是卵巢所刺激周期發(fā)育卵泡減少，獲得卵子數(shù)目減少、臨床上的妊娠率降低。POI、POR提示婦女生殖能力降低乃至喪失。所以,及早發(fā)現(xiàn)這一類(lèi)的女性，給予適當(dāng)?shù)募に靥娲委熓乾F(xiàn)在輔助生殖的一個(gè)重要領(lǐng)域。2011年由人類(lèi)生殖與胚胎協(xié)會(huì)第一次提道POR博洛尼亞國(guó)際的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]?？墒沁@個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的必要條件、截?cái)嘀岛桶凑者@個(gè)標(biāo)準(zhǔn)納入的人群一致性均存在缺點(diǎn)，所以仍需進(jìn)一步的大樣本的臨床隨機(jī)對(duì)照研究予以驗(yàn)證[9]。

POI、卵巢儲(chǔ)備功能不良(DOR)進(jìn)一步發(fā)展，最后是卵巢功能衰竭，DOR如過(guò)提前發(fā)生就是卵巢早衰(POF)。POF在大部分的人群中發(fā)病率是1%～3%[10]。POF提示了婦女失去了生育的能力。因此在POI階段，就需重視挽救生殖能力、解決生育問(wèn)題。卵巢功能衰竭之后，重點(diǎn)轉(zhuǎn)到了維持身體的良好狀態(tài)。卵巢功能減退、卵巢早衰的診斷標(biāo)準(zhǔn)的明確對(duì)盡早發(fā)現(xiàn)這一類(lèi)女性有幫助，可早期的給予相對(duì)應(yīng)的對(duì)策，盡量完成這類(lèi)患者的生育夢(mèng)、確保她們的身心健康。

迄今有關(guān)CYP17基因多態(tài)性和雌激素有關(guān)的疾病研究中結(jié)論不同?？赡芘cCYP17基因型的分布頻率在不同的種族、地區(qū)有差異。且和試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)、使用方法不同可能有關(guān)。CYP17酶在雌激素的合成、代謝階段有不同的作用?，F(xiàn)在研究CYP17基因多態(tài)性與患乳癌風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系廣泛。最近有學(xué)者開(kāi)始研究CYP17基因與子宮內(nèi)膜癌或卵巢癌的關(guān)系。但目前為止仍無(wú)關(guān)于CYP17基因和POI關(guān)系的報(bào)道。

本文使用DNAStar軟件包中的Seqman軟件對(duì)病例組和對(duì)照組的CYP17 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果次序進(jìn)行拼接與比對(duì)分析，得到的結(jié)果和NCBI的SNPs數(shù)據(jù)庫(kù)已記錄的SNPs進(jìn)行比較，結(jié)果顯示在病例組與對(duì)照組中均檢測(cè)到CYP17基因的突變位點(diǎn)，共發(fā)現(xiàn)了6個(gè)SNPs，都為二等位基因型。轉(zhuǎn)換6個(gè)(2個(gè)A/G，3個(gè)T/C，1個(gè)G/A)。病例組與對(duì)照組外周血CYP17基因的測(cè)序發(fā)現(xiàn)的6個(gè)SNPs中2個(gè)為新發(fā)現(xiàn)，為內(nèi)含子G-14A和外顯子c.61 G>A，4個(gè)為NCBI的SNPs數(shù)據(jù)庫(kù)中已有記錄。

對(duì)病例組和對(duì)照組發(fā)現(xiàn)的CYP17基因的6個(gè)SNPs進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)Rs1004467、c.666+35T>C的等位基因頻率和基因型頻率在病例組和對(duì)照組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而rs743572(T-34C)、rs6162(c.138C>T)、rs6163(c.200G>T) 的等位基因頻率和基因型頻率在病例組和對(duì)照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

使用二分類(lèi)Logistic 回歸計(jì)算分析CYP17基因的rs743572(T-34C)、rs6162(c.138C>T)、rs6163(c.200G>T) 的3個(gè)突變位點(diǎn)，為POI的發(fā)病危險(xiǎn)因素，結(jié)果顯示CYP17基因的rs743572(T-34C)、rs6162(c.138C>T)、rs6163(c.200G>T) 的3個(gè)突變位點(diǎn)，在病例組和病例組對(duì)照組之間有差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上所述，CYP17基因突變可能在中國(guó)漢族人群POI病因?qū)W方面起作用。從酶的相關(guān)作用機(jī)分子生物學(xué)角度來(lái)探討CYP17基因的多態(tài)性，影響到雌激素代謝和卵巢功能，從而找到發(fā)生POI的潛在的高危因素。這樣就有可能經(jīng)過(guò)檢測(cè)出婦女人群里的CYP17基因型來(lái)進(jìn)行進(jìn)一步的篩查分類(lèi)、強(qiáng)化隨訪(fǎng)，為及早預(yù)防POI的發(fā)生提供有力的理論上依據(jù)，還可使雌激素在激素替代治療中的安全性得到評(píng)估。

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2 曹澤毅．中華婦產(chǎn)科學(xué)．第2版．北京：人民衛(wèi)生出版社，2004：2565-2568．

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