陳思懷，高繼業(yè)，唐發(fā)書

(西南大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，重慶 402460)

細(xì)胞生物學(xué)是我國生命學(xué)科的四大基礎(chǔ)課程之一，其實(shí)驗(yàn)課程的開設(shè)有助于學(xué)生對理論知識的深入理解、實(shí)驗(yàn)原理和基本實(shí)驗(yàn)技能的掌握[1]。本科段的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目主要包括驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)、綜合性實(shí)驗(yàn)、創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)；其內(nèi)容主要包括細(xì)胞的原代和傳代培養(yǎng)、細(xì)胞核型分析、細(xì)胞融合、細(xì)胞免疫化學(xué)染色、細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染、細(xì)胞凋亡檢測等，開設(shè)的實(shí)驗(yàn)均涉及細(xì)胞培養(yǎng)或以培養(yǎng)的細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料。而完成細(xì)胞培養(yǎng)需具有凈化操作間(萬級)、細(xì)胞培養(yǎng)箱和倒置顯微鏡3種必備的實(shí)驗(yàn)設(shè)備。然而在我國高等農(nóng)林院校中雖建有標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞培養(yǎng)室和購置有相關(guān)細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備，但相關(guān)儀器放置于細(xì)胞培養(yǎng)室，主要用于教師和研究生的科研實(shí)驗(yàn)，未對本科生開放。究其原因主要是本科學(xué)生人數(shù)眾多，細(xì)胞室無法容納以及人員與物品的頻繁出入勢必造成細(xì)胞室的污染。這也是較多高校開設(shè)細(xì)胞生物學(xué)僅有理論教學(xué)而無實(shí)驗(yàn)課程的根本原因。在擁有生化培養(yǎng)箱、超凈工作臺、水浴鍋、低速離心機(jī)等常規(guī)儀器設(shè)備的普通實(shí)驗(yàn)室能否開展細(xì)胞培養(yǎng)及其相關(guān)實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵要解決以下3個(gè)問題：細(xì)胞培養(yǎng)箱的替代、細(xì)胞顯微觀察工具和實(shí)驗(yàn)全程無污染。筆者針對此3問題分析其解決措施與可行性設(shè)想，以期在普通實(shí)驗(yàn)室完成細(xì)胞培養(yǎng)，為本科生的細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)開設(shè)提供參考。

1 細(xì)胞培養(yǎng)箱的替代

1.2CO2培養(yǎng)箱的替代普通實(shí)驗(yàn)室無CO2培養(yǎng)箱，則通過制作簡易CO2培養(yǎng)裝置予以代替。郭進(jìn)林等[5]研究報(bào)道了應(yīng)用氯仿把3塊有機(jī)玻板黏結(jié)成無底的正方體，倒扣于盛有硫酸銅溶液的水槽中作為細(xì)胞培養(yǎng)瓶存放空間，定量NaHCO3與稀硫酸制備所需濃度(5%)CO2并輸入簡易裝置內(nèi)，成功開展了雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)[5]；皮至明等[6]應(yīng)用生化培養(yǎng)箱作溫度源，干燥器作為局部密閉空間，通過定量NaHCO3與稀鹽酸制備所需濃度(5%)的CO2，對B95-8 細(xì)胞株、Raji細(xì)胞株連續(xù)培養(yǎng)3個(gè)月，細(xì)胞生長良好并保持細(xì)胞原有特性[6]。這2種簡易裝置雖有CO2培養(yǎng)箱的功能，但有待改進(jìn)的地方，如取放細(xì)胞培養(yǎng)瓶/板時(shí)需把裝置移出培養(yǎng)箱；裝置的四壁為熱的不良導(dǎo)體，裝置內(nèi)培養(yǎng)液到達(dá)37 ℃所需時(shí)間較長；培養(yǎng)箱開門后冷空氣的進(jìn)入導(dǎo)致裝置壁上有冷凝水。為此，欲進(jìn)行簡易裝置的如下改良：以薄壁不銹鋼鋼板焊制兩個(gè)邊長相差1～2 cm 的無頂正方體，小正方體固定于大正方體中，間隙填充飽和磷酸氫二鈉溶液，制作高5～7 cm的長方體蓋浸沒于兩正方體的溶液中。并在正方體底側(cè)開孔，連接硅膠管作為定量NaHCO3與稀鹽酸制備CO2的輸入，在蓋上開排放空氣的開關(guān)孔和連接氣壓平衡小管的小孔，氣壓平衡管的末端連接直徑極小的毛細(xì)管或胚胎吸管，既控制CO2擴(kuò)散速度，又可平衡箱內(nèi)氣壓，保證細(xì)胞培養(yǎng)48～72 h換液或觀察時(shí)剩留一定的CO2。該裝置模擬培養(yǎng)箱的水套式加熱，溫度波動(dòng)小，開蓋簡單，取放培養(yǎng)物方便。實(shí)現(xiàn)無CO2培養(yǎng)箱的條件下完成細(xì)胞的開放式培養(yǎng)。

2 細(xì)胞的觀察與拍照

3 實(shí)驗(yàn)全程污染的解決

在解決細(xì)胞培養(yǎng)條件后，細(xì)胞能否成功培養(yǎng)關(guān)鍵要消除細(xì)胞的細(xì)菌、病毒、真菌等微生物在實(shí)驗(yàn)用品準(zhǔn)備、取材、細(xì)胞分離、細(xì)胞培養(yǎng)以及細(xì)胞觀察等實(shí)驗(yàn)全程的污染。實(shí)驗(yàn)用品的除菌包括玻璃器材的干熱滅菌、塑料及金屬器材的濕熱滅菌、培養(yǎng)用液的過濾除菌；在取材上根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)類型盡量讓學(xué)生取材健康無菌的動(dòng)物組織器官，尤其避免取材于皮膚、消化道、氣管等需嚴(yán)格處理的器官；細(xì)胞的分離過程中嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，實(shí)驗(yàn)對象移出超凈臺必須封蓋或封口包裝。操作全程要求學(xué)生克服在超凈臺內(nèi)以傾倒方式轉(zhuǎn)移液體、器材掉落臺面繼續(xù)使用、手觸碰移液管以及手經(jīng)常伸出超凈臺等不良習(xí)慣與錯(cuò)誤操作；細(xì)胞培養(yǎng)過程中由于生化培養(yǎng)箱與簡易CO2培養(yǎng)箱裝置的空氣均是污染的，欲消除或降低培養(yǎng)物的污染可采取以下措施：培養(yǎng)基中添加如青霉素、鏈霉素、兩性霉素B等抗生素以抑制細(xì)菌或真菌的生長；細(xì)胞培養(yǎng)瓶則選用帶濾膜(0.1μm)瓶蓋的一次性培養(yǎng)瓶；細(xì)胞培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板以及培養(yǎng)載玻片等培養(yǎng)器材則選用醫(yī)用滅菌紙塑包裝袋包裝，實(shí)現(xiàn)無污染的開放培養(yǎng)[10]。觀察細(xì)胞時(shí)可將體積小、重量輕的自制倒置顯微鏡放置超凈工作臺中(目鏡在擋板外)，對開放性器皿觀察完畢后換新的滅菌紙塑包裝袋重新密封，完成后續(xù)培養(yǎng)。

4 結(jié)語

通過簡易CO2培養(yǎng)裝置、自制倒置顯微鏡的替代，實(shí)驗(yàn)全程污染控制措施的實(shí)施，在普通實(shí)驗(yàn)室完成細(xì)胞培養(yǎng)教學(xué)實(shí)驗(yàn)的方案是可行的，但還需經(jīng)過細(xì)胞培養(yǎng)操作實(shí)踐予以檢驗(yàn)，尤其對成纖維型、上皮型、懸浮細(xì)胞型、細(xì)胞株/系等不同類型細(xì)胞的原代或傳代培養(yǎng)。在簡易培養(yǎng)裝置的CO2擴(kuò)散規(guī)律、細(xì)胞形態(tài)與功能是否改變、培養(yǎng)物微生物污染檢測等方面還需深入研究；替代的自制裝置仍需改進(jìn)改良；教師根據(jù)教學(xué)大綱、人才培養(yǎng)方案對實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，以期使本科生的細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課程能成功開設(shè)。

[1] 王穎，何成明，胡仁建.細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新性教學(xué)改革初探[J].實(shí)驗(yàn)室科學(xué)，2013，16(6)：90-92.

[2] 谷鴻喜，張鳳民，凌虹.細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)[M].北京：北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社，2012：23-24.

[3] 章靜波.組織和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2011：46-50.

[5] 郭進(jìn)林，吳惠聯(lián)，張玉昆.一種簡易實(shí)用的CO2培養(yǎng)裝置[J].細(xì)胞生物學(xué)雜志，1992(3)：144-145.

[6] 皮至明，成積儒.自制簡易CO2溫箱在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用[J].癌癥，1995，14(1)：66-67.

[7] 李新發(fā).用廢舊顯微鏡改裝成倒置顯微鏡[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，1989，10(6)：426-427.

[8] 洪亞平，侯小改.低成本制作光學(xué)顯微鏡(正立、倒置)/解剖鏡的實(shí)時(shí)觀察與記錄系統(tǒng)[J].生物學(xué)通報(bào)，2007，42(4)：51.

[9] VISTICA D T，SCUDIERO D A，SKEHAN P，et al.New carbon dioxide-independent basal growth medium for culture of diverse tumor and nontumor cells of human and nonhuman origin[J].Journal of the national cancer institute，1990，82(12)：1055-1061.

[10] 夏銀鳳，陳建斌，王志杰.透析紙阻菌性研究[C]//中國造紙學(xué)會(huì)第十五屆學(xué)術(shù)年會(huì)論文集.北京：中國造紙學(xué)會(huì)，2012：263-266.