劉文武 馬賓 錢鈞 毛建華 侯發(fā)琴

(馬鞍山市中心醫(yī)院心內(nèi)科，安徽 馬鞍山243000)

缺血性心血管疾病是嚴(yán)重危害人類健康的常見病，而縮短組織缺血時(shí)間,盡早恢復(fù)血流,是防治缺血損傷最有效的措施，血管內(nèi)溶栓治療、經(jīng)皮穿刺冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)成形術(shù)、冠脈搭橋術(shù)等再灌注療法通過恢復(fù)缺血組織的供血有效地挽救缺血組織，是治療心肌缺血和梗死的最主要措施。但是再灌注療法受缺血組織血管再通時(shí)間的限制并存在再灌注損傷等問題。因此，隨著新的再灌注技術(shù)的長足進(jìn)展，防治再灌注損傷成了冠心病治療亟待解決的關(guān)鍵問題之一。自1986年Murry首次提出缺血預(yù)處理(ischemic preconditioning，IPC)概念以來，30年的試驗(yàn)研究證實(shí)，IPC是目前認(rèn)為最強(qiáng)及最有效的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制,能有效地減少心肌缺血再灌注損傷，應(yīng)用藥物預(yù)處理防治心肌缺血再灌注損傷已成為研究熱點(diǎn)[1]。1991年，Inoue 等通過膜片鉗技術(shù)發(fā)現(xiàn)線粒體ATP敏感性鉀通道(mitochondrial ATP-sensitive potassium channel，mitoKATPC), 隨其特異性開放劑與抑制劑的發(fā)現(xiàn)及研究的不斷深入,其在心血管領(lǐng)域的心肌保護(hù)，尤其在預(yù)適應(yīng)心肌保護(hù)中的作用日益突出[2]。本研究通過靜脈注射特異性mitoKATP通道開放劑吡那地爾，觀察其對(duì)兔心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用,探討mitoKATP通道在缺血再灌注損傷中的作用及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料及分組 清潔級(jí)健康家兔50只，體重(3±0.5)kg，由蚌埠醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供, 許可證：SCXK皖：2016-0047。隨機(jī)分為假手術(shù)組(SO組)：采用左冠狀動(dòng)脈下穿線不結(jié)扎，持續(xù)160min；缺血再灌注組(I/R組)：采用左冠狀動(dòng)脈下穿線，拉緊絲線引起心肌缺血，放松絲線給予再灌注的方法建立心肌缺血再灌注損傷動(dòng)物模型，缺血40min，再灌注120min；硝酸甘油組(NG組)：缺血前1h靜滴硝酸甘油100ug/kg，再行缺血再灌注；吡那地爾組(PN組)：缺血前30min靜滴吡那地爾250μg/kg，再行缺血再灌注；硝酸甘油聯(lián)合吡那地爾組(NG+PN組)：缺血前1h靜滴硝酸甘油100μg/kg，30 min時(shí)靜滴吡那地爾250μg/kg，再行缺血再灌注，每組10只。吡那地爾購自sigma公司，血清SOD/MDA/NO試劑盒購自南京建成生物研究所。

1.2 動(dòng)物模型的建立 家兔經(jīng)耳緣靜脈緩慢推注20%烏拉5ml/kg，背部及四肢固定于兔板上，分離氣管,切開后插管，連接小動(dòng)物微型呼吸機(jī)行機(jī)械通氣，頻率設(shè)置為50次/min，潮氣量為10ml/kg，給予呼吸末正壓通氣，吸氣與呼氣之比為1：2，壓力0．75～1．5kPa。四肢及胸部連接電極，監(jiān)測(cè)胸導(dǎo)聯(lián)及肢體導(dǎo)聯(lián)心電圖。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程通過MedLab生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)監(jiān)測(cè)、記錄。按文獻(xiàn)方法：于胸骨左側(cè)0．5cm處用組織剪從第3～5肋骨縱行剪開2.5cm切口，鈍性分開肌層，4號(hào)線縫扎第四肋骨兩端后將其剪斷，打開胸腔并用小動(dòng)物開胸器將其撐開暴露心臟，剪開心包，以左冠狀動(dòng)脈主干為標(biāo)志，于左心耳根部下2mm處進(jìn)針，以0號(hào)無損傷絲線穿過心肌淺層在肺動(dòng)脈圓錐旁出針，將絲線兩端穿過自制的1根長2cm、直徑3mm的聚乙烯小管，輕輕拉緊絲線兩端，用小止血鉗夾持細(xì)管，以結(jié)扎后心電圖ST段呈弓背樣抬高明顯，結(jié)扎線遠(yuǎn)端心肌呈現(xiàn)紫紺為結(jié)扎成功標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)扎40min后取出硅膠管，胸導(dǎo)聯(lián)ST段下降超過1/2為再灌注成功的標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法 ①血清SOD/MDA/NO/CK指標(biāo)及測(cè)定：分別于心肌再灌注0、30、60、120min經(jīng)兔股靜脈取血2ml，待室溫靜置2h后3500r/min離心10min，分離血清，嚴(yán)格按照試劑盒說明要求測(cè)定[用硫代巴比妥酸法檢測(cè)丙二醛(MDA)、羥胺法檢測(cè)超氧化物歧化酶(SOD)，硝酸還原酶法檢測(cè)一氧化氮(NO)、肌酸激酶(CK)]。②經(jīng)右頸總動(dòng)脈切開置22號(hào)導(dǎo)管至左心室，連接40kPa壓力換能器監(jiān)測(cè)血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)(LVSP、LVEDP)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程通過MedLab生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)監(jiān)測(cè)、記錄。③心肌缺血壞死范圍測(cè)定：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后于原結(jié)扎點(diǎn)冠脈重新結(jié)扎，剪斷第三肋骨鈍性分離周圍組織暴露主動(dòng)脈，并用直鉗夾閉主動(dòng)脈，從左心室注入1%伊文思藍(lán)2ml，心臟變成藍(lán)色后迅速取出心臟，剔除心房、結(jié)締組織，放入PBS溶液(0.02 mmol/L，pH=7.4)中漂洗數(shù)次，洗去血液，干凈紗布吸去水分，置于-20℃冰箱30min，取出待其稍解凍后，沿垂直心臟縱軸方向從心尖到結(jié)扎線下方將其切成1.5～2.0mm厚的薄片，共約7或8片置于1%氯化四唑(TTC)磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)，在37OC下染色15min，未缺血區(qū)域?yàn)樗{(lán)色，危險(xiǎn)區(qū)及梗死區(qū)為磚紅色、灰白色或土黃色，呈不規(guī)則、島嶼狀分布。切片用10%甲醛溶液固定后照相(Nikon3100), 使用計(jì)算機(jī)輔助軟件(Image-Pro Plus, Media Cybernetics)處理缺血危險(xiǎn)區(qū)占左心室的比例。

2 結(jié)果

2.1 硝酸甘油及吡那地爾對(duì)SOD/MDA/NO的影響

2.1.1 SOD 在各時(shí)間段SO、NG、PN組和NG+PN組均高于I/R(P<0.01或P<0.05)，NG+PN組又高于NG、PN組(P<0.01)，見表1。

2.1.2 MDA 在各時(shí)間段SO、NG、PN和NG+PN組均低于I/R組(P<0.01或P<0.05),NG+PN組又低于NG、PN組(P<0.01)，見表2。

表1 各組在各時(shí)間段SOD比較Table 1 The SOD in each group at each time point

注：與I/R組比較，①P<0.01；與SO組比較，②P<0.01；與PN 、NG組比較，③P<0.01

表2 各組在各時(shí)間段MDA比較Table 2 The MDA in each group at each time point

注：與I/R組比較，①P<0.01；與SO組比較，②P<0.01；與PN 、NG組比較，③P<0.01

2.1.3 NO 在各時(shí)間段SO、NG、PN和NG+PN組均高于I/R組(P<0．01或P<0.05)，NG+PN組又高于NG、PN組(P<0.01)，見表3。

表 3 各組在各時(shí)間段NO比較Table 3 The NO in each group at each time point

注：與I/R組比較，①P<0.01；與SO組比較，②P<0.01；與PN 、NG組比較，③P<0.01

2.2 各組心室內(nèi)壓比較

2.2.1 LVSP 在各時(shí)間點(diǎn)I/R、PN、NG、PN+NG組較SO組明顯下降(P<0.01)；在T30、T60時(shí)，I/R組較PN+NG組下降(P<0.05)；在T90時(shí)，I/R組較NG、PN+NG組下降(P<0.05或P<0.01)；在T150時(shí)，I/R組較NG、NG+PN組下降(P<0.01)，亦較PN組下降(P<0.05)，見表4。

表 4 各組在各時(shí)間段LVSP比較Table 4 The LVSP in each group at each time point

注：與I/R組比較，①P<0.05；②P<0.01；與SO組比較，③P<0.01；與PN組比較，④P<0.01；與NG組比較，<0.01

2.2.2 LVEDP 在T30時(shí)各組沒有顯著差異(P>0.05)；在T60、T120、T150時(shí)I/R組均較SO、NG、NG+PN顯著提高(P<0.01)；在T60時(shí)I/R組較PN組下降(P<0.05)，見表5。

2.3 各組心肌酶比較 在各時(shí)間段， I/R組較SO、PN、NG+PN組顯著提高(P<0.01)，其中在T0時(shí)間段，I/R組較NG組提高(P<0.05)；在其余時(shí)間段，NG、PN組較NG+PN組顯著提高(P<0.01)，其中在T0、T60時(shí)間段，NG、PN組較NG+PN組顯著提高(P<0.05)，見表6。

表5 各組在各時(shí)間段LVEDP比較Table 5 The SOD in each group at each time point

注：與I/R組比較，①P<0.05；②P<0.01；與SO組比較，③P<0.05,④P<0.01

表6 各組在各時(shí)間段CK比較Table 6 The CK in each group at each time point

注：與I/R組比較，①P<0.05；與SO組比較，②P<0.05；與PN 、NG組比較，③P<0.05，④P<0.01

2.4 各組心肌梗死面積比較 NG、PN、NG+PN組較I/R組梗死面積明顯縮小(P<0.01)，其中NG+PN組梗死面積又較NG、PN組縮小(P<0.01或P<0.05)，見表7。

3 討論

心肌持續(xù)性缺血導(dǎo)致組織損傷和細(xì)胞壞死，及早恢復(fù)再灌注是減輕缺血損傷的最主要途徑，但再灌注后一系列的形態(tài)、功能、代謝方面的病理生理學(xué)變化，將導(dǎo)致缺血損傷反而進(jìn)一步增加。損傷的最根本機(jī)制是氧自由基的大量產(chǎn)生和細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載以及隨之而來的微血管功能障礙[3]。

3.1 硝酸甘油的心肌保護(hù)作用 NO是一種潛在的擴(kuò)血管劑和抗氧化劑，硝酸甘油作為NO供體，在體內(nèi)產(chǎn)生NO。本研究結(jié)果表明，①NG組的血清NO含量在再灌注即刻均較I/R組顯著提高(P<0.01)，但與吡那地爾組比較，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；同時(shí)顯著提高再灌注各時(shí)間段血清SOD(P<0.01)和降低血清MDA含量(P<0.01)，說明給予外源性NO供體可提高體內(nèi)的NO含量，減少缺血再灌注心肌氧自由基的大量生成， 從而減輕氧自由基引起的血管內(nèi)皮和心肌的損傷，抑制血小板趨化聚集黏附于血管內(nèi)皮，直接作用于NADPH氧化酶表面膜元件而抑制中性粒細(xì)胞(PMN)超氧因子的產(chǎn)生，并阻止其與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附作用[4]。②GN組再灌注期間各時(shí)間段心功能指標(biāo)LVSP明顯高于I/R組(P<0.01)，LVEDP明顯低于I/R組(P<0.01)，說明相比于I/R組，GN組心功能在再灌注期間得到較好地恢復(fù)，可能源于血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的減少，繼而引起鈣依賴性鉀通道的激話和cGMP依賴性PKGI的激活，以及cGMP依賴性電壓門控鈣離子通道的抑制引起血管擴(kuò)張[5]。③硝酸甘油能明顯減少再灌注期間血清心肌酶LDH、CK的釋放量，縮小心肌梗死面積(與對(duì)照組比較，P<0.01)?？赡芘c下列機(jī)制有關(guān)：a.血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放的NO是一種很強(qiáng)的舒血管物質(zhì)，可擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈，改善微循環(huán)[6]。b.NO抑制內(nèi)皮細(xì)胞TGF-β1/Smad信號(hào)通路的反式激活。已知TGF-β1表達(dá)上調(diào)可以促進(jìn)心肌梗死后炎癥反應(yīng)，通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞TGF-β1/Smad信號(hào)通路可以降低由于缺血再灌注損傷所致的心肌炎癥、心肌纖維化，減輕心肌細(xì)胞壞死凋亡以及由此而導(dǎo)致的心肌重塑。C.絲裂原活化蛋白激酶、p38MAPK【7-8】、c-Jun NH2-terminal kinase[9]在缺血再灌注時(shí)活性增強(qiáng)，并引發(fā)炎性細(xì)胞因子表達(dá)轉(zhuǎn)錄活性，NO可能也作用于作為TGF-β1/Smad信號(hào)通路組成部分的絲裂原活化蛋白激酶，抑制炎性細(xì)胞的表達(dá)，進(jìn)而提高心臟功能，限制心肌梗死后的心肌重塑。

Table7Thesizeofmyocardialinfarctofeachgroupwastheproportionoftheleftventricle

組別n危險(xiǎn)區(qū)/左心室I/R組1054 33±7 1SO組100．00±0．00NG組1040 83±7 8①PN組1038 67±8 0①NG+PN組1027 7±8 3①②③

注：與I/R組比較，①P<0.01； 與PN組比較，②P<0.05；與NG組比較，③P<0.05

3.2 吡那地爾的心肌保護(hù)作用 ATP敏感性線粒體鉀通道在預(yù)防缺血再灌注損傷中起著重要的作用[10]。本實(shí)驗(yàn)選擇ATP敏感性線粒體鉀通道開放劑——吡那地爾預(yù)處理兔缺血再灌注，觀察其對(duì)心肌保護(hù)作用及機(jī)制。結(jié)果表明，①吡那地爾顯著增加血清NO(P<0.01)，但沒有硝酸甘油組明顯?？赡苡捎谛募∪毖A(yù)適應(yīng)中,機(jī)體刺激心臟釋放內(nèi)源性心肌保護(hù)物質(zhì)，如腺苷、兒茶酚胺、緩激肽, 激活NO-cGMP蛋白激酶G通路[11],激活一氧化氮合酶產(chǎn)生NO。②吡那地爾明顯降低循環(huán)中的MDA，顯著提高SOD[12]。說明吡那地爾可能使KATP通道活化，逆轉(zhuǎn)鈣超載和穩(wěn)定細(xì)胞膜，保護(hù)線粒體的完整及功能，減少氧自由基的發(fā)生，減輕組織的過氧化物損害，以及抑制中性粒細(xì)胞的聚集，促發(fā)NO的生成，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞及功能，并使心肌組織對(duì)氧和能量物質(zhì)的利用效率提高。③吡那地爾可以降低缺血心肌的CK、LDH的釋放量，縮小心肌梗死面積(P<0.01)。可能與以下機(jī)制有關(guān)：a.使K+通道開放數(shù)量增加，K+外流增加，使細(xì)胞復(fù)極化速率加快，縮短了心肌動(dòng)作電位時(shí)程[13]，且平臺(tái)期縮短更顯著，從而抑制了電壓依賴性鈣通道的Ca2+內(nèi)流，加速了Na+-Ca2+交換而增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+排出，減輕鈣超載對(duì)心肌的損傷作用[14、15]。b.心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度降低，又使其在缺血期收縮活動(dòng)減弱，以及減少心肌攣縮的發(fā)生，耗能減少，有利于保護(hù)心肌。④吡那地爾還具有改善血液循環(huán)作用，明顯提高再灌注期間LVSP,并發(fā)現(xiàn)有輕度抑制心率及心臟舒張功能[16]，可能與K+通道開放, 使冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)K+外流增加, 細(xì)胞膜電位加大, 發(fā)生超極化,細(xì)胞內(nèi)游離的Ca2+濃度下降，并降低血管平滑肌收縮成分對(duì)Ca2+的敏感性，使血管舒張, 冠脈流量增加；還可直接通過影響細(xì)胞內(nèi)磷酸化酶系統(tǒng)而產(chǎn)生舒血管作用，從而有利于代謝產(chǎn)物的清除, 保證心肌組織灌注，促進(jìn)心功能的恢復(fù)及抗心律失常作用[17]。

3.3 吡那地爾聯(lián)合硝酸甘油的心肌保護(hù)作用 實(shí)驗(yàn)證實(shí)，硝酸甘油、吡那地爾單獨(dú)預(yù)處理缺血再灌注心肌時(shí)均有明顯的心肌保護(hù)作用，減小心肌梗死面積。顯示NO和mitoKATPC是缺血預(yù)適應(yīng)發(fā)生機(jī)制中的兩個(gè)重要環(huán)節(jié)[18]，依據(jù)缺血預(yù)適應(yīng)的作用機(jī)制，設(shè)想了在缺血預(yù)適應(yīng)發(fā)生機(jī)制中不同環(huán)節(jié)上聯(lián)合藥物預(yù)處理對(duì)缺血再灌注心肌的保護(hù)作用是否會(huì)更強(qiáng)[19]。結(jié)果表明，①NG+PN組在再灌注各時(shí)間段均能顯著提高血清SOD，降低血清MDA。說明聯(lián)合藥物預(yù)處理具有更強(qiáng)地減少缺血再灌注心肌過氧化物物質(zhì)的產(chǎn)生，減輕過氧化物對(duì)血管內(nèi)皮及心肌組織的損害。②實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)，硝酸甘油和吡那地爾聯(lián)合應(yīng)用，通過不同的作用環(huán)節(jié)減少心肌組織的CK和LDH釋放量，縮小心肌梗死面積，促進(jìn)再灌注期間心臟LVSP、+dp/dmax功能的恢復(fù)。其機(jī)制推斷與下列因素有關(guān)[20]：a.NO直接作用于KATP內(nèi)部具有NO敏感性的氨基酸結(jié)合位點(diǎn),開放KATP通道蛋白,或通過磷酸化蛋白激酶G升高cGMP水平,激活相關(guān)蛋白激酶,使心肌細(xì)胞的KATP開放增加 。b.同時(shí)吡那地爾作為mitoKATPC開放劑在心肌缺血預(yù)適應(yīng)中啟動(dòng)了機(jī)體內(nèi)源性心肌保護(hù)物質(zhì)，如腺苷、兒茶酚胺、緩激肽, 激活NO-cGMP蛋白激酶G通路,進(jìn)而激活一氧化氮合酶產(chǎn)生NO，增強(qiáng)相互之間的療效。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)設(shè)計(jì)了單一藥物和聯(lián)合藥物預(yù)處理組來作用于缺血預(yù)適應(yīng)的不同環(huán)節(jié)，觀察其對(duì)缺血再灌注心肌的保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥可以發(fā)揮更強(qiáng)的心臟保護(hù)作用。

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