劉丹，張煜，彭莉晴，周靜，鄒慶偉

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 1.超聲科，2.胃腸外科，四川 瀘州 646000）

胃癌發(fā)生率和死亡率占目前全部癌癥例數(shù)第二位[1]。胃癌進(jìn)展與機(jī)體免疫水平密切關(guān)系，然而針對晚期胃癌的靶向免疫治療至今仍未取得實質(zhì)進(jìn)展，如何增強(qiáng)胃癌組織內(nèi)T淋巴細(xì)胞活性將成為胃癌免疫治療關(guān)鍵[2-3]。Itch蛋白是一種E3泛素鏈接酶，在調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞活化和免疫耐受方面起著關(guān)鍵作用，其通過調(diào)控T細(xì)胞受體表達(dá)和轉(zhuǎn)化生長因子-β信號通路以誘導(dǎo)機(jī)體免疫耐受[4-5]。敲除Itch基因可增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞免疫活性和促進(jìn)Th2細(xì)胞因子（IL-4/IL-5）分泌，同時Itch基因敲除小鼠血清IgE和IgG1水平升高，出現(xiàn)嚴(yán)重的自體免疫性皮炎病變[6-8]。因此，Itch基因可作為抗腫瘤免疫治療新型靶點用于臨床。RNA干擾（RNA interfere，RNAi）技術(shù)是基因研究中一種常用有效工具，但如何將外源基因無創(chuàng)且高效地導(dǎo)入靶細(xì)胞內(nèi)是目前亟待改善的關(guān)鍵技術(shù)。超聲介導(dǎo)微泡破裂技術(shù)（ultrasound-targeted microbubble destruction，UTMD）是一種新型基因定位釋放技術(shù)，可為基因靶向治療提供一種簡便、高效、無創(chuàng)的轉(zhuǎn)染途徑[9]。目前國內(nèi)外關(guān)于Itch抗腫瘤免疫治療應(yīng)用的報道少見，且未見UTMD介導(dǎo)靶向沉默Itch基因用于胃癌免疫治療的相關(guān)研究。本研究擬利用UTMD技術(shù)沉默T淋巴細(xì)胞Itch基因表達(dá)，檢測T淋巴細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ分泌水平變化，分析轉(zhuǎn)染T細(xì)胞對胃癌MFC細(xì)胞的免疫殺傷情況，探索以Itch基因為靶點免疫治療胃癌的可行性。

1 材料與方法

1.1 試劑及設(shè)備

615小鼠購于中國科學(xué)院（北京）動物實驗中心（許可證號：SHZK（滬）2016-0002），無特定病原體級（SPF級），體重約20～25 g。利用德國美天尼公司免疫磁珠純化脾臟T淋巴細(xì)胞，T淋巴細(xì)胞純度達(dá)96.9%，培養(yǎng)基構(gòu)成：90%1640培養(yǎng)基，10%胎牛血清，5 μg/ml ConA和1%雙抗。小鼠胃癌MFC細(xì)胞起源于615小鼠，購自中國科學(xué)院（北京）細(xì)胞庫，培養(yǎng)基配置：10%胎牛血清+90% 1640培養(yǎng)基+鏈霉素（100 μg/ml）+青霉素（100 IU/ml）。細(xì)胞培養(yǎng)基及耗材購自美國Gibco公司，T淋巴細(xì)胞免疫磁珠購自德國美天尼公司，CD3、CD69兔抗小鼠多克隆抗體購自美國BD公司，Itch兔抗小鼠多克隆抗體購自美國Abcom公司，超聲低變頻治療儀器購自Chattanooga公司，SonoVue超聲微泡造影劑購自美國Bracco公司，Itch-shRNA序列合成和質(zhì)粒構(gòu)建由上海吉凱基因公司完成，其中質(zhì)粒攜帶綠色熒光蛋白（green fluorescence protein，GFP）標(biāo)記基因。

1.2 ShRNA/微泡復(fù)合物制備

采用文獻(xiàn)報道Itch-shRNA高效沉默序列[10]，正向：5'-AACCATGACCAATCCGAATAC-3'，反向：5'-AA TGTTAGCCCCAATCGTT-3'，擴(kuò)增片段長度為256 bp。shRNA質(zhì)粒合成與構(gòu)建由上海吉凱基因公司合成，按照說明書操作，將正、反2條核苷酸鏈退火得到雙鏈DNA，T4連接酶定向克隆退火后的shRNA雙鏈模板，包裝至線性化的質(zhì)粒載體中。隨后，將10 μl ItchshRNA表達(dá)質(zhì)粒與100 μl微泡混合，加入100 μl DMEM培養(yǎng)基中室溫孵化10 min，0.22 μm濾器過濾除菌，備用。

1.3 T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)染

調(diào)節(jié)超聲輻照最優(yōu)參數(shù)為1 W/cm2，3 min，20%占空比[11]，超聲探頭置于水槽正下方，探頭上放置12孔板操作平臺，探頭中心正對靶孔。CD3免疫磁珠純化分離小鼠脾臟CD3+T淋巴細(xì)胞，離心收集P2代T淋巴細(xì)胞，無血清DMEM培養(yǎng)基重懸，以細(xì)胞密度1×105/cm2接種至12孔板中。超聲輻照前，3 ml PBS溶液與Sono Vue微氣泡預(yù)混合，振蕩或倒置使其分布均勻，微泡密度約為（5～0）×108個/ml，微泡直徑約為2～5 μm。30 μl質(zhì)粒溶液與100 μl SonoVue微泡懸液充分混勻后，將質(zhì)粒-微泡混合液置入T淋巴細(xì)胞懸液內(nèi)，予超聲輻照60 s。輻照完成后，從水槽中移出6孔板，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。處理后6 h，更換為10%FBS的1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后離心收集細(xì)胞。本實驗設(shè)置3個分組，其中實驗組：Itch-shRNA質(zhì)粒+SonoVue微泡+超聲輻照，對照組：陰性對照shRNA質(zhì)粒+SonoVue微泡+超聲輻照，空白組：無微泡及超聲輻照處理，另外將GFP質(zhì)粒按照上訴步驟予以超聲輻照微泡處理，轉(zhuǎn)染48 h后，流式細(xì)胞儀檢測UTMD介導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，熒光顯微鏡下觀察各分組GFP表達(dá)情況。

1.4 Western blot檢測Itch蛋白表達(dá)

細(xì)胞轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，1 200 r/min離心5 min，收集細(xì)胞后提取T淋巴細(xì)胞總蛋白，檢測其中靶蛋白Itch表達(dá)水平，80 V直流電壓轉(zhuǎn)PVDF膜3 h，2%BSA封閉1 h，剪膜，加入1∶800稀釋兔抗鼠Itch多克隆抗體4℃過夜孵育（16～18 h），加入1∶500稀釋HRP標(biāo)記IgG抗體室溫孵育1 h，在ECL顯色系統(tǒng)中顯色定影，分析雜交條帶。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測CD69表達(dá)

轉(zhuǎn)染T淋巴細(xì)胞24 h后，PBS清洗2次。每組各取1×105個細(xì)胞，分別加入PBS溶液100 μl，吸管輕柔吹打均勻，加入1μl兔抗小鼠多克隆CD69抗體，F(xiàn)ITC熒光標(biāo)記，混勻后置室溫避光孵育30 min，PBS清洗3次，800 r/min細(xì)胞離心，棄上清液，250 μl PBS溶液重懸，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測。

1.6 T淋巴細(xì)胞免疫殺傷效率測定

轉(zhuǎn)染T淋巴細(xì)胞72 h后，將100 μl實驗組、對照組及空白組T淋巴細(xì)胞分別與100μl胃癌MFC細(xì)胞混合接種于96孔板，效靶比梯度分別為10∶1、20∶1、40∶1，其中胃癌MFC細(xì)胞密度為2×104個/ml，每組設(shè)3個復(fù)孔。設(shè)置單純胃癌MFC細(xì)胞為靶細(xì)胞組，單純T淋巴細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞組。細(xì)胞共培養(yǎng)72 h，CCK-8法測定細(xì)胞殺傷效率。

1.7 腫瘤殺傷率計算方法如下[12]：

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊性用LSD-t法檢驗，方差不齊性用Dunnett's T3法檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 T淋巴細(xì)胞原代培養(yǎng)

利用免疫磁珠分離C57小鼠脾臟CD3+T淋巴細(xì)胞，T淋巴細(xì)胞呈橢圓形外觀，懸浮生長，直徑在20 μm左右，流式細(xì)胞儀檢測T淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志CD3抗原分子表達(dá)，證實分離T細(xì)胞純度為95.9%。見圖1。

2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染率測定結(jié)果

GFP是一種綠色熒光蛋白，激發(fā)后表達(dá)綠色熒光，并散在分布于胞質(zhì)內(nèi)，熒光顯微鏡下可觀察轉(zhuǎn)染成功的T淋巴細(xì)胞顯示綠色熒光，超聲微泡轉(zhuǎn)染ItchsiRNA質(zhì)粒48 h后，本研究利用流式細(xì)胞儀檢測T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)染率達(dá)到70.8%。見圖2。

2.3 超聲微泡介導(dǎo)Itch-shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對Itch蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測UTMD介導(dǎo)Itch-shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染T淋巴細(xì)胞后各組Itch蛋白表達(dá)，空白組、對照組和實驗組Itch蛋白相對表達(dá)量分別是（0.41±0.09）、（0.39±0.10）和（0.15±0.078），各組Itch蛋白相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=7.699，P=0.022）。各組總體方差相等，滿足方差齊性，兩兩對比采用LSD法。與對照組比較，實驗組Itch蛋白表達(dá)量降低（t=-0.327，P=0.021）；空白組與對照組Itch蛋白表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.0273，P=0.810），表明超聲微泡介導(dǎo)Itch-siRNA質(zhì)粒能高效且特異性抑制T淋巴細(xì)胞Itch蛋白表達(dá)。見圖4。

圖1 T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定

圖2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染率測定

圖3 各組Itch蛋白表達(dá)

2.4 超聲微泡介導(dǎo)Itch基因沉默后細(xì)胞表型CD69表達(dá)變化

轉(zhuǎn)染24 h后流式細(xì)胞儀檢測T細(xì)胞早期活化標(biāo)志CD69表達(dá)，顯示實驗組CD69表達(dá)上調(diào)，達(dá)到（27.61±3.65）%，對照組和空白組分別為（7.82±1.79）%、（9.33±1.54）%（見圖3），各分組早期活化標(biāo)志CD69表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=57.79，P=0.000）。各組總體方差相等，滿足方差齊性，兩兩比較采用LSD法。與對照組比較，實驗組早期活化標(biāo)志CD69表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=9.701，P=0.000）；對照組與空白組早期活化標(biāo)志CD69表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=-0.737，P=0.489）。由此得知，沉默Itch基因表達(dá)后T淋巴細(xì)胞表面活化標(biāo)志CD69表達(dá)提高。

2.5 Itch基因沉默可增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞腫瘤免疫殺傷效率

圖4 轉(zhuǎn)染24 h后CD69表達(dá)

各組總體方差相等，滿足方差齊性，兩兩對比采用LSD-t法。不同效靶比水平（10∶1、20∶1、40∶1）比較，各分組腫瘤殺傷效率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，其中效靶比水平為10∶1時（F=12.988，P=0.007），與對照組比較，實驗組腫瘤殺傷效率增加（t=4.496，P=0.011）；效靶比水平為20∶1時（F=9.003，P=0.016），與對照組比較，實驗組腫瘤殺傷效率增加（t=4.496，P=0.011）；效靶比水平為40∶1時（F=26.881，P=0.001），與對照組比較，實驗組腫瘤殺傷效率增加，（t=4.496，P=0.011）。此外，隨著效靶比升高，T淋巴細(xì)胞對于胃癌MFC細(xì)胞殺傷率逐漸增加，當(dāng)效靶比為40∶1時，實驗組T淋巴細(xì)胞殺傷效率最高，達(dá)到（45.91±5.65）%。

3 討論

免疫細(xì)胞通過關(guān)鍵蛋白調(diào)節(jié)其自身免疫水平而不致過度活化或抑制。Itch蛋白負(fù)性調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞活化因子，如核轉(zhuǎn)錄因子BAP-1、NF-κb及T細(xì)胞表面受體等，誘導(dǎo)機(jī)體免疫無反應(yīng)性，防止機(jī)體免疫過度活化[13]。研究證實，特異性T淋巴細(xì)胞能浸潤至腫瘤組織內(nèi)部，然而浸潤T淋巴細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中處于免疫耐受狀態(tài)，無法對腫瘤細(xì)胞發(fā)動有效免疫攻擊[14-15]。胃癌組織中抗腫瘤免疫應(yīng)答被調(diào)節(jié)性T細(xì)胞抑制，細(xì)胞毒性T細(xì)胞活性受損，如能特異性抑制Itch基因表達(dá)，則可增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)性以免疫殺傷胃癌細(xì)胞。

RNA干擾技術(shù)利用小雙鏈RNA誘發(fā)同源mRNA高效特異性降解，沉默目的基因表達(dá)，是目前常用的分子生物學(xué)技術(shù)。小干擾RNA（Small interfering RNA，siRNA）和短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）是RNAi技術(shù)常用的效應(yīng)片段。具體來講，siRNA的沉默效應(yīng)是暫時的，而基因載體與shRNA結(jié)合后，能實現(xiàn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，誘導(dǎo)靶基因mRNA分解，達(dá)到持續(xù)抑制效果[16]。本研究選用文獻(xiàn)報道的成熟shRNA序列持續(xù)抑制Itch基因表達(dá)以便于后續(xù)動物實驗研究。將RNAi用于特異性沉默Itch基因之前，首先應(yīng)解決是基因轉(zhuǎn)染載體的問題，目前通常采用非病毒或病毒載體。病毒載體轉(zhuǎn)染效率較高，但存在一定的生物安全隱患，同時病毒自身免疫原性也是實際運用中需要考慮的難題[17]；脂質(zhì)體和質(zhì)粒等非病毒載體雖無上述缺陷，但其轉(zhuǎn)染效率不高，且具有一定的細(xì)胞毒性，因此有必要尋找一種新的轉(zhuǎn)染途徑[18]。UTMD技術(shù)利用超聲介導(dǎo)微泡靶向釋放所攜帶基因，可為細(xì)胞轉(zhuǎn)染提供新的途徑，該方法產(chǎn)生細(xì)胞空化作用，增加細(xì)胞膜通透性，一過性地形成細(xì)胞膜孔洞，減小細(xì)胞表面不流動層厚度，從而增加轉(zhuǎn)染效率，本實驗中，UTMD技術(shù)轉(zhuǎn)染48 h后，熒光顯微鏡下可觀察到轉(zhuǎn)染成功細(xì)胞內(nèi)發(fā)出綠色熒光，轉(zhuǎn)染成功率達(dá)51.9%。當(dāng)然，超聲介導(dǎo)微泡空化轉(zhuǎn)染基因作為一種物理輔助手段，如果超聲能量強(qiáng)度過大，也可能造成細(xì)胞不可逆損傷，甚至導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和溶解，因此本研究參考既往文獻(xiàn)調(diào)整超聲輻照最優(yōu)參數(shù)為1 W/cm2，3 min，20%占空比[11]，可有效避免潛在的細(xì)胞損傷發(fā)生，有利于確保UTMD介導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)染的安全性。

Itch基因?qū)τ赥淋巴細(xì)胞免疫功能具有負(fù)調(diào)控作用，本研究首先利用UTMD介導(dǎo)shRNA轉(zhuǎn)染T細(xì)胞以有效沉默Itch基因表達(dá)，繼而觀察T淋巴細(xì)胞活化程度。CD69分子位于T淋巴細(xì)胞表面，靜止的T淋巴細(xì)胞不表達(dá)CD69分子，而一旦活化，其CD69分子表達(dá)數(shù)量則上升，因此被認(rèn)為是T淋巴細(xì)胞活化早期標(biāo)志[19]。實驗結(jié)果表明，UTMD轉(zhuǎn)染48 h后，實驗組CD69表達(dá)率升高，這表明UTMD技術(shù)能有效抑制Itch基因表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞活性。如何體外評價轉(zhuǎn)染T淋巴細(xì)胞對胃癌MFC細(xì)胞免疫殺傷效率是本實驗研究重點?；旌霞?xì)胞培養(yǎng)72 h后，在不同效靶比（10∶1、20∶1、40∶1），實驗組T淋巴細(xì)胞較空白組或?qū)φ战M均具有更高的腫瘤殺傷效率。當(dāng)效靶比為40∶1時，殺傷效率達(dá)到（45.91±5.65%），這表明超聲微泡介導(dǎo)沉默Itch基因能增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞對胃癌MFC細(xì)胞的免疫殺傷作用。

上述研究結(jié)果表明，UTMD技術(shù)具有較強(qiáng)基因轉(zhuǎn)染效率，下調(diào)Itch基因表達(dá)能有效增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞免疫活性，增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞對胃癌MFC細(xì)胞的體外免疫殺傷作用。

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