解春芝，曾海英，宋 杰，秦禮康*

（1.貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；3.貴州大學(xué) 明德學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025）

腐乳源于中國(guó)，至今已有一千多年的生產(chǎn)歷史，與豆豉、醬油、豆醬并稱為我國(guó)四大傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味品[1]，因其質(zhì)構(gòu)與奶酪相似，故又被歐美譽(yù)為“中國(guó)干酪”[2]。腐乳營(yíng)養(yǎng)豐富、味道鮮美、風(fēng)味獨(dú)特、品種多樣，倍受消費(fèi)者青睞，年產(chǎn)量逾300 000 t[3]。根據(jù)前酵菌種類型可分為毛霉型腐乳、細(xì)菌型腐乳、自然發(fā)酵型腐乳以及酶促型腐乳；根據(jù)色澤風(fēng)味分類，可分為紅腐乳、白腐乳、青腐乳、醬腐乳和各種花色腐乳；根據(jù)規(guī)格形狀又可分為太方腐乳、行方腐乳、醉方腐乳、中方腐乳、棋方腐乳[2，4]。

脂肪作為腐乳中重要組成部分，約占腐乳干質(zhì)量的20%～30%[5]。在發(fā)酵過程中，大量微生物分泌的酶系將脂肪分解成脂肪酸和甘油，是腐乳獨(dú)特風(fēng)味和細(xì)膩滑嫩質(zhì)構(gòu)形成物質(zhì)之一。作為腐乳風(fēng)味形成的重要前體物質(zhì)，脂肪酸氧化產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)主要是醛類、酮類、醇類、羧酸類、呋喃類等[6]。此外，大量研究表明，攝入適當(dāng)比例的飽和、單不飽和、多不飽和脂肪酸，可預(yù)防心腦血管疾病、癌癥、關(guān)節(jié)炎，降低炎癥和結(jié)腸炎的發(fā)病率[7-8]。

目前，針對(duì)腐乳脂肪酸的報(bào)道較少，僅局限于1～3種市售腐乳或自制腐乳[9-10]，限制了人們對(duì)不同腐乳脂肪酸營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的整體認(rèn)知。本課題根據(jù)前酵菌的不同，采集了不同類型的8種腐乳，通過氣-質(zhì)聯(lián)用儀（gas chromatographymass spectrometer，GC-MS）測(cè)定腐乳游離脂肪酸的種類和含量，采用主成分分析法（principalcomponentanalysis，PCA）分析其脂肪酸組成差異，綜合評(píng)價(jià)其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，以期為腐乳生產(chǎn)工藝改善及消費(fèi)者選購(gòu)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

采集的8種腐乳樣品，分屬于細(xì)菌型、毛霉型以及自然發(fā)酵型腐乳三大類型，源于全國(guó)各地，樣品信息見表1。其中，作為中國(guó)腐乳主要類型的毛霉型腐乳樣品包括了紅方（RS）、白方（WS）、青方（GS）、醬方（JS）和花色腐乳（糟方腐乳，ZS；白菜腐乳，CS）。細(xì)菌型腐乳和自然發(fā)酵型腐乳分別以克東腐乳（KS）和貴州土腐乳（SS）為代表。

硫酸、甲醇、正己烷、無水硫酸鈉、氫氧化鉀、乙醇、酚酞、石油醚（均為分析純）：北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司。

表1 不同腐乳樣品信息Table 1 Details of different sufu varieties

1.2 儀器與設(shè)備

HP6890/5975C GC-MS聯(lián)用儀：美國(guó)安捷倫科技公司；FD-1A-50冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；SER148全自動(dòng)脂肪提取儀：意大利威爾普公司；GZX-9140MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

同種腐乳5瓶樣品中各取出100 g腐乳塊（共500 g），于蒸餾水中5 min洗去表層輔料，放漏斗上瀝干水分，去除表皮（0.5 cm）后混料進(jìn)行冷凍干燥，再研磨過60目篩，稱取適量冷凍干燥過的腐乳樣品，采用全自動(dòng)索氏抽提儀提取脂肪，并于紅外烘箱干燥至質(zhì)量恒定，-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 總游離脂肪酸測(cè)定

總游離脂肪酸測(cè)定參考標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1797—2009《油菜籽中游離脂肪酸的測(cè)定》，樣品預(yù)處理略有改動(dòng)，見1.3.1。

1.3.3 游離脂肪酸測(cè)定[11]

樣品的甲酯化：稱取腐乳抽提的油脂樣品約30 mg，放入密封瓶中，加1%硫酸甲醇溶液2 mL，在70℃恒溫箱中加熱1 h甲酯化后，加入2 mL正己烷萃取，超聲振蕩，靜置，取上清液，用純水洗滌至中性，加入無水硫酸鈉1 g（吸水），濃縮至1 mL備用。

色譜條件：色譜柱為ZB-5MSI 5%苯基-95%二甲基聚硅氧烷彈性石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），柱溫60℃，保持2 min，以10℃/min升溫至160℃，再以5℃/min升溫至300℃，運(yùn)行40 min；汽化室溫度為250℃；載氣為高純氦氣（99.999%）；柱前壓7.62 psi；載氣流速1.0 mL/min；分流比20∶1，溶劑延遲時(shí)間為5.0 min，進(jìn)樣量1 μL。

離子源為電子電離（electron ionization，EI）源；離子源溫度230℃；四極桿溫度150℃；電子能量70 eV；發(fā)射電流34.6 μA；倍增器電壓1 718 V；接口溫度280℃；質(zhì)量掃描范圍29～500 amu。

將總離子流圖中的各峰進(jìn)行質(zhì)譜計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索，并核對(duì)Nist2005和Wiley275標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖，確定脂肪酸，用峰面積歸一化法計(jì)算各脂肪酸的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。并計(jì)算出不同腐乳中飽和脂肪酸（saturated fatty acid，SFA），單不飽和脂肪酸（monounsaturated fatty acid，MUFA），多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA），不飽和指數(shù)（unsaturation index，UI），動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)（atherogenic index，AI）以及血栓指數(shù)（thrombogenic index，TI）。各指標(biāo)的計(jì)算公式如下：

SFA=C14:0+C15:0+C16:0+C17:0+…+C25:0；

MUFA=C16:1 n-7+C18:1 n-9+C20:1 n-9；

PUFA=C18:2 n-6；

UI=1×單烯酸含量（%）+2×二烯酸含量（%）+3×三烯酸含量（%）+…n×n烯酸含量（%）；

AI=[C12:0+（4×C14:0）+C16:0]/（MUFAs+n-3 PUFAs+n-6 PUFAs）；

TI=（C14:0+C16:0+C18:0）/[（0.5×MUFAs）+（0.5×n-6 PUFAs）+（3 × n-3 PUFAs）+（n-3 PUFAs/n-6 PUFAs）]。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和主成分分析。在方差分析結(jié)果顯著時(shí)，采用Duncan法進(jìn)行多重比較。經(jīng)PCA提取出主成分后，計(jì)算主成分特征值和累積貢獻(xiàn)率，并以每個(gè)主成分所對(duì)應(yīng)的特征值的方差貢獻(xiàn)率作為權(quán)數(shù)，構(gòu)建綜合評(píng)價(jià)模型。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同腐乳中總游離脂肪酸含量

不同腐乳樣品中總游離脂肪酸的含量見圖1。

圖1 不同腐乳中總游離脂肪酸的含量Fig.1 Total free fatty acid contents of different sufu varieties

由圖1可知，白菜腐乳CS總游離脂肪酸含量最高，達(dá)18.85 g/100 g，其次為紅腐乳RS（16.82 g/100 g）和青腐乳GS（15.68g/100g）。細(xì)菌型KS（8.09 g/100 g）總游離脂肪酸含量最低，僅為CS的43%。由此可知，不同種類腐乳游離脂肪酸的含量差異顯著，即使同種腐乳，發(fā)酵時(shí)間不同，脂肪酸含量也存在差別。究其原因，一方面，制作腐乳的原料大豆和輔料中脂肪及游離脂肪酸含量原本存在差異[12]，如細(xì)菌型腐乳KS主要以東北春大豆為原料，自然發(fā)酵型腐乳SS主要以云貴高原夏大豆為原料，而毛霉型腐乳由于分布廣泛，其原料都來源也較為多樣，包括黃淮海平原和長(zhǎng)江流域夏大豆等；另一方面，不同腐乳微生物區(qū)系不同，脂肪酶活力具有差異，進(jìn)而導(dǎo)致脂肪的降解程度也不盡相同。有報(bào)道表明，在前酵培菌階段，細(xì)菌型腐乳以藤黃微球菌（Micrococcus luteus）為主，蛋白酶活力較高[13]，而毛霉型腐乳以五通橋毛霉、雅致放射狀毛霉、腐乳毛霉、總狀毛霉為主，總狀毛霉分泌脂肪酶活力最強(qiáng)，可達(dá)到119.2U/g，且酶活力大小依次為總狀毛霉＞雅致放射狀毛霉＞五通橋毛霉＞腐乳毛霉[14]。此外，14碳以上的高級(jí)飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸在常溫下狀態(tài)不同，其含量的高低和種類的多少密切影響著脂肪的結(jié)構(gòu)，性質(zhì)及脂肪晶形等，進(jìn)而影響腐乳的微觀結(jié)構(gòu)[15]。因此，發(fā)酵過程中游離脂肪酸的釋放，有益于腐乳細(xì)膩質(zhì)構(gòu)的形成。

2.2 不同腐乳游離脂肪酸含量

表2 不同腐乳游離脂肪酸含量和營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)指標(biāo)Table 2 Free fatty acid profiles and nutrition evaluation indexes of different sufu varieties

不同腐乳游離脂肪酸含量見表2，共檢測(cè)出15種游離脂肪酸，其種類相似而含量差異顯著（P＜0.05）。根據(jù)飽和度分類，所測(cè)游離脂肪酸可分為飽和脂肪酸（SFA）、單不飽和脂肪酸（MUFA）和多不飽和脂肪酸（PUFA）。其中SFA包括：肉豆蔻酸（C14:0）、十五烷酸（C15:0）、棕櫚酸（C16:0）、十七烷酸（C17:0）、硬脂酸（C18:0）、二十烷酸（C20:0）、二十一烷酸（C21:0）、山崳酸（C22:0）、二十三烷酸（C23:0）、木蠟酸（C24:0）和二十五烷酸（C25:0）。肉豆蔻酸是人體內(nèi)主要的SFA，與血清中膽固醇含量呈正相關(guān)，可能是導(dǎo)致膽固醇升高的最主要因子[16]，但也可減少前列腺增生發(fā)生幾率[17]。而棕櫚酸作為腐乳最主要的SFA，其比重為10.99%～13.72%。但飲食中過多的攝入棕櫚酸，可抑制脂肪氧化和能量消耗，進(jìn)而可能增大肥胖和胰島素抵抗風(fēng)險(xiǎn)[18]。MUFA包括棕櫚油酸（C16:1n-7）、油酸（C18:1n-9）和11-二十碳烯酸（C20:1n-9），其中含量最豐富的為油酸（22.29%～28.16%）。研究表明，油酸不僅可軟化血管，在人和動(dòng)物的新陳代謝過程中起著重要作用，還可減緩食品中油脂結(jié)晶化[19]。亞油酸（C18:2）是腐乳中唯一的PUFA，同時(shí)也是腐乳中最為豐富的脂肪酸，百分含量高達(dá)43.36%～50.74%。研究發(fā)現(xiàn)，亞油酸可降低氧化損傷，通過與膽固醇結(jié)合，還可維持血液膽固醇正常的運(yùn)轉(zhuǎn)和代謝。膳食中亞油酸的缺乏，可增大飽和脂肪酸與膽固醇結(jié)合的幾率，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化，進(jìn)而引發(fā)心腦血管相關(guān)疾病[20]。KIM J S等[11]對(duì)中國(guó)不同腐乳進(jìn)行研究，同樣發(fā)現(xiàn)亞油酸（830 mg/100 g鮮樣）含量最為豐富，油酸和棕櫚酸次之。此外，油酸和亞油酸不僅是必需要脂肪酸，也可與醇類物質(zhì)發(fā)生酯化反應(yīng)生成酯類物質(zhì)，對(duì)腐乳中酸味、果香等獨(dú)特風(fēng)味物質(zhì)生成具有重要貢獻(xiàn)[21-22]。

由表2可知，在8種腐乳中，SFA含量均較低，占比分布在16.84%～19.39%，含量最高的為SS，含量最低的為ZS。不飽和脂肪酸作為主要脂肪酸，其中MUFA百分含量為22.67%～28.34%，PUFA為43.36%～50.74%。不同腐乳PUFA/SFA比值差異不顯著（P＞0.05），最大的為KS（2.83）。而PUFA/MUFA比值分布在1.53～2.11之間，最大的為KS，最小的為ZS。脂肪酸比值對(duì)人體健康具有重要意義，高PUFAs/SFAs值有利于血清膽固醇和動(dòng)脈粥樣硬化的減少，并可預(yù)防心臟疾病[23]。PUFA/SFA比值作為評(píng)價(jià)油脂質(zhì)量的重要指標(biāo)，推薦最低值為0.45[24]。所有腐乳的PUFA/SFA比值遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于0.45，說明腐乳的各脂肪酸比例合理。

脂肪酸和人體健康密切相關(guān)，不飽和指數(shù)（UI）作為評(píng)價(jià)脂肪酸飽和程度的一個(gè)重要指標(biāo)，與Ⅱ-型糖尿病具有一定的關(guān)聯(lián)度。而動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)（AI）和血栓指數(shù)（TI）越高，越易于患相關(guān)的疾病，對(duì)人體的潛在危害越大[24]。腐乳UI指數(shù)為112.17～127.05，AI（0.16～0.19）和TI（0.42～0.50）指數(shù)均低于0.5，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于藥用海藻相關(guān)指數(shù)（AI：0.94～1.99；TI：0.46～1.60）[24]。腐乳中UI、AI和TI指數(shù)相對(duì)合理，可能源于亞油酸含量較高，對(duì)預(yù)防Ⅱ-型糖尿病和心腦血管疾病具有潛在意義。

2.3 腐乳游離脂肪酸主成分分析

主成分分析法是多元統(tǒng)計(jì)中的一種數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)，利用降維的原理，在保留主要變量信息的前提下，可把多個(gè)指標(biāo)轉(zhuǎn)化為幾個(gè)不相關(guān)的綜合變量[25]。主成分分析在滿足數(shù)據(jù)降維的同時(shí)，能夠客觀地確定各個(gè)指標(biāo)的權(quán)重，避免了主觀隨意性，具有一定的優(yōu)越性[26]。因此，已被廣泛應(yīng)用于食品品質(zhì)分析中[27-28]，主成分的特征值和貢獻(xiàn)率見表3。由表3可知，前3個(gè)主成分的貢獻(xiàn)率分別為68.626%、26.251%、3.834%，累計(jì)貢獻(xiàn)率為98.711%，確定提取3個(gè)主成分最合適，可較好反映所有游離脂肪酸組成的基本信息。

表3 主成分的特征值和貢獻(xiàn)率Table 3 Eigenvalues and contribution rate and of the principal components

表4 主成分的載荷矩陣Table 4 Loading matrix of principal components

主成分的載荷矩陣見表4。由表3和4各特征向量值可知，第1主成分PC1主要反映C18:2的變異信息，故可將PC1命名為多不飽和脂肪酸因子F1。第2主成分PC2主要反映C18:1和C16:1的變異信息，故可將PC2命名為單不飽和脂肪酸因子F2。第3主成分PC3主要反映C16:0、C18:0、C22:0，C17:0、C14:0、C15:0和C24:0等的變異信息，故可將PC3命名為飽和脂肪酸因子F3。

2.4 腐乳脂肪酸組成比例綜合評(píng)價(jià)

由于PCA中前3個(gè)主成分反映了15個(gè)指標(biāo)變量信息的98.711%，說明利用前3個(gè)主成分進(jìn)行不同腐乳的游離脂肪酸的評(píng)價(jià)是可行的，可用F1（多飽和脂肪酸因子）、F2（單不飽和脂肪酸因子）、F3（飽和脂肪酸因子）3個(gè)新的綜合指標(biāo)來替代原來的15個(gè)指標(biāo)對(duì)腐乳脂肪酸進(jìn)行分析，得到前3個(gè)主成分的線性關(guān)系式分別為：

主成分越重要，方差貢獻(xiàn)率越大，以每個(gè)主成分所對(duì)應(yīng)的方差貢獻(xiàn)率為權(quán)重，構(gòu)建綜合評(píng)價(jià)模型F=0.686F1+0.263F2+0.038F3，計(jì)算各樣品綜合得分，然后進(jìn)行排序評(píng)價(jià)各個(gè)樣本的游離脂肪酸組成。得分如表5所示，游離脂肪酸組成比例分值排序?yàn)镴S＞KS＞W(wǎng)S＞SS＞GS＞ZS＞RS＞CS，即醬腐乳＞克東腐乳＞白腐乳＞貴州土腐乳＞青腐乳＞糟方腐乳＞紅腐乳＞白菜腐乳。說明不同游離脂肪酸綜合質(zhì)量存在差異，JS腐乳的游離脂肪酸綜合質(zhì)量最高。

表5 腐乳的成分得分和綜合得分Table 5 Principal component scores and comprehensive scores of 8 sufu varieties

3 結(jié)論

不同腐乳中總游離脂肪酸差異顯著（P＜0.05），花色腐乳CS中總游離脂肪酸含量高達(dá)18.85 g/100 g，約為細(xì)菌型腐乳KS的2倍。GC-MS測(cè)定了8種腐乳中游離脂肪酸譜，共檢出15種游離脂肪酸，其中亞油酸、油酸和棕櫚酸為主要脂肪酸。PUFA/SFA比值最大的為KS（2.83），最小的為SS和RS，均為2.41。所有腐乳的PUFA/SFA比值遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于推薦值0.45，說明腐乳的各脂肪酸比例合理，對(duì)健康具有重要意義?；谥鞒煞址治龇?，提取得到的前三個(gè)主成分的貢獻(xiàn)率分別為68.626%、26.251%、3.834%，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到98.711%，可較好反映所有游離脂肪酸組成的基本信息。根據(jù)建立的綜合評(píng)價(jià)模型可知游離脂肪酸組成比例分值排序?yàn)獒u腐乳＞克東腐乳＞白腐乳＞貴州土腐乳＞青腐乳＞糟方腐乳＞紅腐乳＞白菜腐乳。主成分分析法可有效對(duì)不同腐乳的游離脂肪酸組成比例進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，但如果需要篩選出綜合品質(zhì)好的腐乳品種，除了考慮脂肪酸的含量和比例之外，還需對(duì)其他營(yíng)養(yǎng)素進(jìn)行綜合分析，才能為腐乳生產(chǎn)工藝改善提供更為科學(xué)全面的依據(jù)。

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