丁利君，肖思杰，邱樹文，劉 丹*，宣恩玉

（1.廣東工業(yè)大學(xué) 輕工化工學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.河源廣工大協(xié)同創(chuàng)新研究院，廣東 河源 517000；3.河源醋力飲料有限公司，廣東 河源 517000；4.河源市百美果蔬深加工研究院，廣東 河源 517000）

我國是香蕉生產(chǎn)大國，香蕉在我國是僅次于蘋果、柑桔、梨的第四大宗水果，主要分布在廣東、廣西、臺灣、福建、海南、云南等省區(qū)的部分地區(qū)。香蕉以其豐富的營養(yǎng)、芳香的氣味、低廉的價(jià)格倍受消費(fèi)者喜愛，是一種很好的健康食品。

香蕉采收后極易腐爛，不易保存，因而進(jìn)行深加工成為一種重要的保存方式。香蕉產(chǎn)品的加工工藝也豐富多樣，可以干制、烘烤，做成飲料、罐頭等[1]。香蕉果醋是近年來新開發(fā)的一種醋飲料，當(dāng)前的研究多為釀造工藝開發(fā)[2-7]，以及與獼猴桃[8]、菠蘿[9]、山楂[10]等水果復(fù)合的釀造工藝開發(fā)。果醋具有多種營養(yǎng)保健功能，能促進(jìn)新陳代謝、調(diào)節(jié)酸堿平衡、提高機(jī)體免疫力、促進(jìn)血液循環(huán)、降壓和美容護(hù)膚、延緩衰老等[11-12]。醋酸等有機(jī)酸有助于人體三羧酸循環(huán)的正常進(jìn)行，從而使有氧代謝順暢，有利于清除沉積的乳酸，起到消除疲勞的作用[13]。經(jīng)分析，利用香蕉發(fā)酵生產(chǎn)的香蕉醋飲料，可以將香蕉中的各種維生素、礦物質(zhì)較完整地保留下來，還含有10種以上的有機(jī)酸和人體所需的多種氨基酸。

本實(shí)驗(yàn)對香蕉果醋釀造生產(chǎn)過程中幾個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的還原糖、總多酚、總酸、pH、色度、透光率、色差、羥基自由基清除率、還原能力進(jìn)行測定，通過相關(guān)性分析，進(jìn)一步分析抗氧化性能的變化規(guī)律及特點(diǎn)，以期為香蕉果醋產(chǎn)品的研究開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)樣品均來源于河源醋力飲料有限公司。

果酒專用酵母：安琪酵母股份有限公司；釀醋醋酸菌：上海迪發(fā)釀造生物制品有限公司；果膠酶：和氏璧生物技術(shù)有限公司；福林酚：上海麥克林生化科技有限公司；3,5-二硝基水楊酸：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；雙氧水：廣州化學(xué)試劑廠；氫氧化鈉、碳酸鈉、水楊酸、硫酸亞鐵、鐵氰化鉀、三氯乙酸、氯化鐵（均為分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1800PC紫外分光光度儀：上海美譜達(dá)儀器有限公司；pHS-3C型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)：上海智光儀器儀表有限公司；申光WSF分光測色儀：上海儀電物理光學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 香蕉果醋的制作工藝及操作要點(diǎn)

選擇成熟的香蕉去皮打漿，加入0.4%果膠酶，55℃保溫酶解5 h，加入0.02%活化后的酵母進(jìn)行酒精發(fā)酵，發(fā)酵溫度控制在20～30℃，發(fā)酵時(shí)間為6 d；發(fā)酵后進(jìn)行渣液分離，得到酒精發(fā)酵液，發(fā)酵液加入0.5%的醋酸菌進(jìn)行醋酸發(fā)酵，30～35℃條件下發(fā)酵25 d得到醋酸發(fā)酵液；醋酸發(fā)酵液于常溫貯存陳釀六個(gè)月得陳釀液。

1.3.2 理化指標(biāo)的測定

還原糖測定：采用3,5-二硝基水楊酸法[14]；總酸的測定：采用氫氧化鈉滴定法[15]；pH值的測定：采用pH計(jì)測定；多酚的測定：采用福林酚法[16]。

1.3.3 色度、透光率的測定方法

色度為果醋溶液分別在波長420 nm、520 nm、620 nm處的吸光度值之和[17]；透光率為果醋溶液在波長670 nm處的吸光度值乘以100%[13]。

1.3.4 色差的測定方法

采用申光WSF分光測色儀測定色差。在透射模式（transmission）下，光源D65，觀察角10°。

1.3.5 羥基自由基清除力測定方法

采用水楊酸法[18]測定羥基自由基清除力。取稀釋一定倍數(shù)的樣品2 mL，加入20 mmol/L水楊酸0.3 mL，1.5 mmol/L硫酸亞鐵1mL，6mmol/L過氧化氫0.7mL，混勻后37℃靜置60 min，在波長562 nm處測定吸光度值。

式中：A為加入樣品后的吸光度值，Ai為不加水楊酸的樣品吸光度值，A0為空白（蒸餾水）吸光度值。

1.3.6 還原能力的測定方法

采用鐵氰化鉀法測定還原能力[19]。取稀釋一定倍數(shù)的樣品2.5 mL，加入0.2 mol/L的PBS緩沖液（pH=6.6）2.5 mL，1%的鐵氰化鉀2.5 mL，50℃水浴20 min后加入10%三氯乙酸2.5 mL，經(jīng)3 000 r/min離心10 min，取上清液2.5 mL，加入蒸餾水2.5 mL，1%三氯化鐵0.5 mL，室溫靜置10 min后，以蒸餾水調(diào)零，在波長700 nm處測定吸光度值，同法測不同質(zhì)量濃度的抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，還原能力以當(dāng)量抗壞血酸濃度表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 還原糖含量的變化

糖類是微生物生長的重要能量來源，糖類物質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化可在一定程度上反映發(fā)酵系統(tǒng)中微生物的代謝活動(dòng)變化趨勢。香蕉果醋在釀造過程中四個(gè)不同時(shí)期還原糖的含量變化見圖1。在發(fā)酵前，酶解液的還原糖含量為149.3 mg/mL，經(jīng)酵母菌酒精發(fā)酵后，酒精發(fā)酵液的還原糖含量迅速降至3.97mg/mL，消耗率97.3%，在酒精發(fā)酵階段，由于酵母細(xì)胞大量形成，處于旺盛的發(fā)酵階段，消耗大量的糖類為生長繁殖提供必需的能量，將其轉(zhuǎn)化為酒精，還原糖迅速減少，酒精度增加，而經(jīng)其后的醋酸發(fā)酵及陳釀過程后，還原糖量略有增加。這可能是在這一過程中植物組織內(nèi)的糖成分開始緩慢溶解釋放造成[20-21]。

圖1 釀造過程還原糖含量的變化Fig.1 Change of reducing sugar during fermentation process

2.2 總酸和pH的變化

總酸和pH是影響果醋的口感及風(fēng)味的重要因素，反應(yīng)果醋中有機(jī)酸的含量，釀造過程中果醋總酸含量和pH的變化見圖2。由圖2可知，pH的變化趨勢與總酸含量一致，即總酸含量增大，pH降低，在發(fā)酵前，酶解液總酸含量為3.4 mg/mL，經(jīng)酒精發(fā)酵后的總酸含量較發(fā)酵前略有增加，而在醋酸發(fā)酵后的總酸含量大幅提升，陳釀前后的果醋總酸基本持平，無明顯變化。這是因?yàn)樵诰凭l(fā)酵的代謝過程中，原有的部分有機(jī)酸會轉(zhuǎn)化生成新的有機(jī)酸[22]。研究表明，酒精發(fā)酵中，釀酒酵母在厭氧條件下將糖轉(zhuǎn)化為酒精，在這個(gè)過程中通常伴隨著一定量的乙酸[23]、琥珀酸、丙酮酸[24]、乳酸[25-26]的產(chǎn)生，醋酸菌發(fā)酵則利用乙醇在乙醇脫氫酶及乙醛脫氫酶的催化下氧化成乙酸。

圖2 釀造過程總酸含量和pH的變化Fig.2 Change of total acid and pH during fermentation process

2.3 顏色變化

采用色差儀對香蕉醋的CIELAB三刺激顏色進(jìn)行測定，得到CIELAB顏色參數(shù)L*（亮度）、a*（紅值）和 b*（黃值）。L*值表示亮度，與樣品顏色的深淺呈負(fù)相關(guān)，L*值越高表明樣品越透亮。a*＞0表示與紅色相關(guān)，a*＜0表示與綠色相關(guān)；b*＞0表示與黃色相關(guān)、b*＜0表示與藍(lán)色相關(guān)。釀造過程中不同階段的果醋顏色變化見圖3，色差變化見圖4。色度和透光率是表征飲料外觀質(zhì)量的重要指標(biāo)，不同階段果醋的色度變化和透光率變化分別見圖5、圖6。

圖3 釀造過程不同階段的顏色變化Fig.3 Change of color at different stages of the fermentation process

由圖3、圖4可知，在發(fā)酵前的酶解液亮度值最高，顏色最淺，酒精發(fā)酵后降至最低。紅值和黃值有同樣的變化趨勢，均與亮度值趨勢相反。發(fā)酵體系的溶液的總體色調(diào)偏紅黃。由圖5、圖6可知，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，色度值先逐漸增大，再隨發(fā)酵逐漸下降，經(jīng)陳釀后再次增加，整體趨勢與透光率呈負(fù)相關(guān)，色度值高則透光率低。有可能是因?yàn)樵陉愥勲A段，香蕉果醋發(fā)生了褐變，使得香蕉果醋色度值增加。

圖4 釀造過程不同階段的色差變化Fig.4 Change of chromatic aberration at different stages of the fermentation process

圖5 釀造過程不同階段的色度變化Fig.5 Change of chromaticity at different stages of the fermentation process

圖6 釀造過程不同階段的透光率變化Fig.6 Change of transparence at different stages of thefermentation process

2.4 總多酚含量變化

多酚類化合物是指分子結(jié)構(gòu)中有若干個(gè)酚羥基的植物成分的總稱，包括黃酮類、單寧類、酚酸類以及花色苷類等，具有抗氧化、抗菌、抗病毒、調(diào)節(jié)血糖血脂等多方面的活性，具有一定的呈色作用，對果醋的口感及風(fēng)味有重要影響，釀造過程不同階段的總多酚變化見圖7。

圖7 釀造過程不同階段的總多酚含量變化Fig.7 Change of total polyphenol at different stages of the fermentation process

由圖7可知，在發(fā)酵前，酶解液總多酚含量為175.5μg/mL，經(jīng)酒精發(fā)酵后，總多酚含量較發(fā)酵前大幅增加，達(dá)747.1μg/mL，而經(jīng)醋酸發(fā)酵后，多酚含量迅速降至362.3 μg/mL，這可能是因?yàn)殡S著酵母菌的繁殖生長，糖類被大量消耗轉(zhuǎn)化為乙醇，而多酚及黃酮類化合物在乙醇中的溶解度較水中大，香蕉渣粕中的多酚及黃酮大量溶出，而在后期的發(fā)酵中，醋酸菌在有氧條件下，將乙醇氧化為乙酸，乙醇含量的下降及所處的氧化環(huán)境，造成多酚及黃酮的溶解度降低或者被氧化，導(dǎo)致其在發(fā)酵階段出現(xiàn)先升高后降低的趨勢，陳釀前后的總酚含量略有增加，變化并不明顯。發(fā)酵過程中色度值的變化趨勢與多酚含量一致，色度值可能與多酚含量有關(guān)。

2.5 抗氧化性的變化

蔬果中含有大量的抗氧化物質(zhì)，具有抗氧化活性，在一定程度上有預(yù)防多種疾病的作用。果醋源于蔬果，可能延續(xù)了蔬果的部分抗氧化性。圖8、圖9描述了香蕉果醋在釀造過程中4個(gè)不同時(shí)期的羥基自由基清除力、還原力變化規(guī)律。經(jīng)酒精發(fā)酵后，發(fā)酵液的還原力明顯增強(qiáng)，而羥基自由基清除力則有所下降；醋酸發(fā)酵前后的發(fā)酵液還原力迅速降低，而羥基自由基清除力則無明顯變化；陳釀前后，羥基自由基清除力和還原力均無明顯變化。還原力的變化趨勢與總多酚含量變化一致，呈正相關(guān)，說明還原力與總多酚含量存在一定的關(guān)系，羥基自由基的清除力呈總體下降的趨勢，說明羥基自由基的清除力可能與在復(fù)雜的發(fā)酵過程中產(chǎn)生的除多酚外的其他物質(zhì)有關(guān)。

圖8 釀造過程不同階段的羥基自由基清除力變化Fig.8 Change of hydroxyl radical scavenging activity at different stages of the fermentation process

圖9 釀造過程不同階段的還原能力變化Fig.9 Change of reducibility at different stages of the fermentation process

2.6 發(fā)酵過程各指標(biāo)的相關(guān)性分析

表1 各檢測指標(biāo)的相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis of each test index

各檢測指標(biāo)的相關(guān)性分析結(jié)果見表1。由表1可知，色度值、透光率與CIELAB三刺激顏色之間存在顯著的相關(guān)性，羥基自由基清除能力與還原糖含量存在顯著的相關(guān)性，還原糖分子中含有游離醛基或酮基的單糖和含有游離醛基的二糖都具有還原性，說明發(fā)酵體系溶液的羥基自由基清除力主要由其貢獻(xiàn)?？偠喾雍糠謩e與色度值、CIELAB三刺激顏色值、還原能力存在顯著的相關(guān)性，多酚類化合物包括黃酮類、單寧類、酚酸類以及花色苷類等，具有一定的呈色作用，多酚中含有較多的鄰酚羥基結(jié)構(gòu)，該基團(tuán)很容易被氧化成醌，表現(xiàn)為明顯的抗氧化活性。

3 結(jié)論

采用二次發(fā)酵法生產(chǎn)香蕉果醋，在發(fā)酵過程中，其還原糖含量、透光率先降低后升高，總酸含量增加，羥基自由基清除力逐漸降低，總多酚、色度值、色差值、還原能力先升高后降低。羥基自由基清除能力與還原糖含量存在顯著的相關(guān)性，總多酚含量分別與色度值、色差值、還原能力存在顯著的相關(guān)性。經(jīng)酒精發(fā)酵后的發(fā)酵體系各檢測指標(biāo)變化最大，陳釀期間各檢測指標(biāo)變化最小。

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