陳 偉， 胡 萌， 倫才智， 徐 豪， 楊 娟

臨沂出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東 臨沂 276034

條紋根瘤象SitonalineatusL.，又稱豌豆葉象甲，屬鞘翅目Coleoptera象甲科Curculionidae根瘤象屬Sitona。該蟲主要分布于歐洲和北美洲(Olfertetal.,2012； Vankoskyetal.,2009)，在我國(guó)新疆的阿勒泰和伊犁(劉芳政等，2000)及甘肅的隴東黃土高原(王佛生等，2011)和景泰(周軍和賀春貴，2005)有分布記錄。寄主主要為豆科植物，包括紫花苜蓿、白花苜蓿、野豌豆、田豌豆、寬豌豆、驢豆、蠶豆、扁豆、羽扇豆等(Petruha，1965)，其中對(duì)苜蓿的危害十分顯著。該蟲成蟲可咬食苜蓿幼苗的葉子和生長(zhǎng)點(diǎn)，使植株受到破壞甚至死亡；幼蟲可蛀食根和根瘤，減少氮在根和土壤中的含量，降低土壤肥力(Cárcamoetal.,2015; Corre-Hellou & Crozat,2005)，同時(shí)，根和根瘤被害容易使病原微生物入侵，進(jìn)一步引起根部腐爛。該蟲一年發(fā)生1代，常以成蟲形態(tài)在多年生豆科植物下或土表枯枝落葉下越冬(王登元和于江南，2010)。

2016年9月，臨沂出入境檢驗(yàn)檢疫局對(duì)來(lái)自德國(guó)的帶皮楊木原木進(jìn)行檢疫時(shí)，截獲象甲科昆蟲。借助顯微鏡觀察其形態(tài)特征，并使用分子生物學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行鑒定，以明確該蟲種類，為其防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源及形態(tài)學(xué)鑒定

象甲樣品從德國(guó)進(jìn)境帶皮楊木原木中截獲，經(jīng)臨沂出入境檢驗(yàn)檢疫局植物檢疫實(shí)驗(yàn)室人員進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定并由中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院昆蟲鑒定專家進(jìn)行復(fù)核后，使用蔡司Discovery V20體式顯微鏡對(duì)其拍照，并放入-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 DNA提取

取樣品一側(cè)后腿，用ddH2O沖洗干凈后放入1.5 mL離心管中，取200 μL chelex100上清液(用前搖勻)加至離心管中，56 ℃水浴4 h后，取出震蕩1 min，置于100 ℃水浴8 min，取出震蕩1 min，13000 r·min-1離心3 min(歐陽(yáng)剛等，2009)，并置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR擴(kuò)增和電泳

PCR擴(kuò)增mtDNA COⅠ部分序列，擴(kuò)增引物為通用引物L(fēng)CO1490(5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′)和HCO2198(5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′)(Folmeretal.，1994)，由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。反應(yīng)體系：擎科金牌Mix 22 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA模板2 μL。擴(kuò)增反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃ 2 min，變性94 ℃ 1 min，退火53 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 1 min，運(yùn)行35個(gè)循環(huán)后，72 ℃再延伸10 min；4 ℃保溫。取6 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)，記錄結(jié)果。PCR產(chǎn)物測(cè)序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.4 序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

對(duì)于測(cè)序結(jié)果，首先根據(jù)測(cè)序峰值進(jìn)行人工校對(duì)，切除兩端不可信區(qū)域，5′端和3′端各切除40和60 bp后，將測(cè)序結(jié)果提交至NCBI進(jìn)行比對(duì)。選取菜豆象Acanthoscelidesobtectus(NC035677)為外群，用MEGA5.05軟件將測(cè)序結(jié)果及GenBank中獲得的序列進(jìn)行分析，并輔以人工校對(duì)，計(jì)算序列間遺傳距離；采用Kimura 2-paramter距離矩陣，以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)，系統(tǒng)樹(shù)各分支的置信度(Bootstrap)均進(jìn)行1000次的重復(fù)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

顯微觀察可以看出，截獲昆蟲成蟲體長(zhǎng)3.2～5.3 mm，寬1.0～1.5 mm，黑色或棕色。身體覆蓋灰色鱗片和短剛毛，前胸背板前緣兩側(cè)無(wú)長(zhǎng)纖毛(圖1A)；喙較粗壯，方形，短于前胸背板，端部向兩側(cè)擴(kuò)展；眼大，微凸，側(cè)生；額寬于喙，額與喙不分離，較平坦，有細(xì)而深的中溝；上顎沒(méi)有顎疤；觸角紅色，膝狀，觸角窩側(cè)背緣緣基尖隆，觸角溝強(qiáng)烈彎向腹面，當(dāng)觸角收回靠近頭部時(shí)，觸角的柄節(jié)常指向眼下方；前胸最寬處位于身體中部；鞘翅上有交替排列的長(zhǎng)剛毛連接成的條狀紋路，頭和前胸背部也有分布且與鞘翅相連接；前足基節(jié)相連或接近，有窄槽位于前胸背板腹面；股節(jié)黑色，脛節(jié)和跗節(jié)紅色；爪離生，爪具附爪，第三跗節(jié)呈明顯二葉狀(圖1B)。

根據(jù)文獻(xiàn)記載(Bright，1994； Bright & Bouchard，2008)，截獲昆蟲的形態(tài)特征與條紋根瘤象相似。

圖1 2016年9月在進(jìn)口楊木中截獲的條紋根瘤象形態(tài)圖Fig.1 A close-up photograph of the morphological characteristics of S. lineatus intercepted at imported poplar logs on September 2016A：背面觀；B：腹面觀。A: Dorsal view； B:Ventral view.

2.2 基于mtCOⅠ的遺傳距離與系統(tǒng)發(fā)育分析

樣品經(jīng)PCR擴(kuò)增、測(cè)序，得到1條大小為698 bp的序列。Blast比對(duì)結(jié)果表明，與目的片段相似度最高的7個(gè)物種分別為條紋根瘤象Sitonalineatus、細(xì)紋根瘤象S.lineellus、S.suturalis、斑翅根瘤象S.macularius、驢豆根瘤象S.callosus、S.languidus、S.lepidus，其中與GenBank中登錄號(hào)KM444588的條紋根瘤象mtCOⅠ序列相似性達(dá)100%(表1)。此外，本實(shí)驗(yàn)樣品與條紋根瘤象的遺傳距離均<1%。從系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖2)也可以看出，本實(shí)驗(yàn)昆蟲樣品與條紋根瘤象(KM444588)的序列明顯聚為一支，置信度高達(dá)99%，且與外群差異明顯。

表1 GenBank中7種高相似度種類與樣品信息表Table 1 Information of 7 high similarity species and samples in GenBank

圖2 基于COⅠ序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree based on COⅠ sequence

結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和分子水平的分析結(jié)果，可將截獲的象甲科昆蟲鑒定為條紋根瘤象。

3 討論

隨著經(jīng)濟(jì)全球化進(jìn)程的加快，我國(guó)進(jìn)境原木及木質(zhì)包裝的數(shù)量激增。近幾年，從原木及木質(zhì)包裝中檢出的有害生物種類越來(lái)越多，象甲科昆蟲就是其中重要的一類。目前，對(duì)進(jìn)境象甲科昆蟲的鑒定主要以形態(tài)特征觀察為主；但由于象甲科昆蟲種類繁多，且國(guó)外種的鑒定資料相對(duì)缺乏，加之口岸檢疫中常截獲到昆蟲早期蟲態(tài)(卵、幼蟲和蛹)或不完整蟲體，其形態(tài)鑒定工作仍存在較大困難。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，利用特征片段基因?qū)ξ锓N進(jìn)行鑒定已獲得快速發(fā)展，尤其以昆蟲mtCOⅠ為分子標(biāo)記的方法得到廣泛應(yīng)用(段曉東等，2011)。使用分子手段進(jìn)行物種鑒定具有快速、高效，不受物種形態(tài)、發(fā)育期等限制的優(yōu)點(diǎn)；但單純使用分子手段進(jìn)行分類鑒定存在樣品久置易降解而導(dǎo)致擴(kuò)增失敗以及分子數(shù)據(jù)庫(kù)不完善等問(wèn)題。研究表明，利用col1基因作條形碼進(jìn)行昆蟲物種鑒定的準(zhǔn)確率通?？蛇_(dá)到90%以上，對(duì)某些種類甚至可達(dá)到100%，但對(duì)于一些近似種的鑒定仍存在一定的風(fēng)險(xiǎn)(Guoetal.,2014)。因此，利用標(biāo)準(zhǔn)條形碼進(jìn)行物種鑒定時(shí)應(yīng)考慮其存在的風(fēng)險(xiǎn)性，可選用2種或2種以上的基因片段結(jié)合驗(yàn)證，或與形態(tài)學(xué)方法相結(jié)合，以提高鑒定的準(zhǔn)確性。本研究采用形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)相結(jié)合的方法將截獲的象甲科昆蟲鑒定為條紋根瘤象，彌補(bǔ)了條紋根瘤象傳統(tǒng)形態(tài)鑒定的不足，為其他象甲科昆蟲的鑒定提供了參考，對(duì)象甲科昆蟲的檢疫鑒定工作具有重要意義，對(duì)口岸檢驗(yàn)檢疫部門進(jìn)行快速準(zhǔn)確的物種鑒定具有很大的幫助。

2014年，天津出入境檢驗(yàn)檢疫局曾從美國(guó)進(jìn)口的天然圣誕樹(shù)上截獲豌豆葉象甲。此次為我國(guó)首次從進(jìn)境帶皮楊木中截獲該有害生物。條紋根瘤象可以隨樹(shù)木或帶皮原木傳入我國(guó)，其傳播途徑需要引起檢驗(yàn)檢疫部門的關(guān)注。

條紋根瘤象雖未被列入我國(guó)檢疫性名錄，但其對(duì)畜牧業(yè)發(fā)展具有很大的潛在危害性。如該蟲在加拿大的草原和牧場(chǎng)發(fā)生了嚴(yán)重危害，且危害呈現(xiàn)持續(xù)擴(kuò)張的態(tài)勢(shì)(Olfertetal.,2012)。對(duì)于條紋根瘤象的防治，一方面需要投入大量的殺蟲劑以減少其成蟲和幼蟲對(duì)苜蓿植株的危害，另一方面需加大氮肥的投入量以補(bǔ)償其幼蟲危害根瘤所造成的土壤肥力的降低。在一些受害嚴(yán)重的苜蓿草場(chǎng)，很多種植者因這2項(xiàng)費(fèi)用的投入成本過(guò)高而不得不放棄原有的苜蓿種植業(yè)。我國(guó)現(xiàn)有的苜蓿草場(chǎng)的分布地氣候條件與歐洲和北美洲類似(劉艷俊等，2017)，條紋根瘤象一旦傳入很容易定殖和擴(kuò)散。因此，對(duì)其加強(qiáng)檢疫對(duì)保護(hù)我國(guó)苜蓿產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有非常重要的意義。

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