孫紅煒， 李 凡， 高 瑞， 徐曉輝， 楊淑珂， 路興波

山東省農業(yè)科學院植物保護研究所/山東省植物病毒學重點實驗室，山東 濟南 250100

玉米是我國種植面積最大的糧食作物，2016年中國玉米種植面積3676萬hm2，在我國糧食及飼料工業(yè)中占有舉足輕重的作用。亞洲玉米螟Ostriniafurnacalis(Guenée)、黏蟲Mythimnaseparata(Walker)和棉鈴蟲Helicoverpaarmigera(Hübner)是影響玉米產量的三大主要鱗翅目害蟲，在個別年份，由于害蟲的危害，甚至會造成玉米絕收。如2012年在吉林省、2016年在陜西渭南，均發(fā)生嚴重的玉米黏蟲為害(聶繼東和汪洪偉，2017; 王紅軍和郭書亞，2017; 王振營和魯新，2010)。我國玉米害蟲防治主要依賴化學防治，化學防治雖然效果較好，但存在防治滯后、無法挽回實際損失的缺點。另外，化學防治不當容易造成環(huán)境、食品污染，同時浪費大量人力、物力。

1996年轉基因玉米在美國首次商品化，轉基因作物在全球蓬勃發(fā)展，其中轉Bt基因玉米是目前商品化生產發(fā)展最快的轉基因抗蟲作物之一(James，2016)。轉Bt基因玉米通過持續(xù)表達外源Bt蛋白，在整個生育期都可以對靶標生物產生抑制或抗性效果，可以大大減少人力、物力的投入，且安全高效。國外應用轉基因抗蟲玉米已超過20年，對靶標害蟲表現了良好的抗性(Burknessetal.，2001; Lynchetal.，1999； Williamsetal.，1998)。我國轉基因玉米研發(fā)雖然起步較晚，但發(fā)展迅速，在Bt基因篩選、改造和合成方面取得很多專利成果，且有為數眾多的轉Bt基因玉米進行到中間試驗或環(huán)境釋放試驗階段(王延峰，2010， 岳同卿等，2010)。轉基因玉米雙抗12-5是浙江大學研發(fā)的含有抗蟲基因cry1Ab/cry2Aj與耐除草劑基因G10evo-epsps的轉基因玉米新品系，cry1Ab/cry2Aj對亞洲玉米螟有較高的殺蟲活性，草甘膦靶標酶基因G10evo-epsps對草甘膦具有很高的耐受性。

轉基因作物在推廣之前，必須經過環(huán)境安全性評價，如抗蟲性、除草劑耐受性、生存競爭能力、對農田生物多樣性的影響等(姜偉麗等，2013; 馬小艷等，2013)。本試驗利用ELISA法測定了轉基因玉米雙抗12-5轉育后獲得的玉米材料雙抗505-12-5中Bt蛋白在不同生育期不同組織中的Bt蛋白表達量，并對其室內及田間抗蟲性進行了研究，為轉基因玉米的基礎研究、推廣應用以及害蟲防治方面提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試玉米

轉基因玉米雙抗505-12-5和非轉基因對照玉米中科玉505，由浙江大學提供；常規(guī)品種登海3號，購自當地種子市場；田間抗蟲性鑒定感蟲品種綜31由中國農業(yè)科學院作物科學研究所提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計 每種玉米材料設3次重復，小區(qū)面積300 m2(50 m×6 m)，行距60 cm，株距25 cm，小區(qū)間設2 m間隔，以防害蟲在不同小區(qū)之間擴散。Bt蛋白含量測定、鱗翅目害蟲室外及室內抗蟲性鑒定均在相應的小區(qū)接蟲或取樣。

1.2.2 Bt蛋白表達量檢測樣品采集及前期處理 在轉基因玉米雙抗505-12-5的6～8葉期、大喇叭口期、吐絲期、乳熟期取根、莖、心葉，吐絲期取花絲，乳熟期取幼嫩籽粒。每小區(qū)5點取樣，每點選取2株生長一致的玉米植株，每個小區(qū)采集10株玉米，按不同部位分類采集樣品，同一小區(qū)同一部位樣品剪碎混合，-80 ℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 Bt蛋白的測定 采用Cry1Ab/Ac酶聯免疫定量檢測試劑盒(上海佑隆公司,貨號：AA0341)測定樣品Bt蛋白含量，按照說明書操作并繪制標準曲線，樣品吸光度值由酶標儀(bio-rad iMark microplate reader)讀取，記錄D450 nm吸光度。

1.3 轉基因玉米室內抗蟲性鑒定

亞洲玉米螟、黏蟲、棉鈴蟲均由本研究室人工繁殖，處理組為轉基因玉米雙抗505-12-5，對照組為非轉基因玉米中科玉505。玉米螟在6～8葉期、花絲期、籽粒期采集相應幼嫩部位飼喂；黏蟲在4～6葉期，棉鈴蟲在花絲期采集相應幼嫩部位飼喂。飼喂容器均采用6孔細胞培養(yǎng)板，每孔10頭初孵幼蟲，每板為一個重復，4次重復。所有處理每24 h更換相同來源的新組織，并記錄活蟲數，按以下公式計算校正死亡率。

校正死亡率/%=(處理組死亡率-對照組死亡率)/(100-對照組死亡率)×100

1.4 田間抗蟲性鑒定

1.4.1 亞洲玉米螟 在玉米心葉期(6～8葉期)和吐絲期人工接種初孵幼蟲，選擇傍晚接蟲。心葉期接種到心葉內，吐絲期接種到花絲上。每小區(qū)人工定株接蟲40株，每株接蟲30～40頭。間隔3 d后進行第2次接蟲，最后一次接蟲14 d后調查。

心葉期調查：調查接蟲株中上部葉片被玉米螟危害程度，包括受害葉片上的蟲孔大小、數量及分布等，計算平均食葉級別，根據平均食葉級別判定玉米心葉期對玉米螟的抗性水平。危害程度分級標準及抗性評價標準參照中華人民共和國農業(yè)部(2006)。

吐絲期調查：根據雌穗被害情況、蛀孔數量、隧道長度及存活幼蟲齡期、數量等，計算各小區(qū)雌穗被害級別平均值，判定玉米穗期對玉米螟的抗性水平。雌穗被害級別分級標準及抗性評價標準參照中華人民共和國農業(yè)部(2007)。

1.4.2 黏蟲 4～6葉期接蟲，接蟲方法及接蟲次數同玉米螟。最后一次接蟲后14 d調查玉米葉片被害程度及黏蟲幼蟲存活數，記錄心葉被害級別并計算被害級別平均值，判定玉米心葉期對黏蟲的抗性水平。被害程度分級標準及抗性評價標準參照中華人民共和國農業(yè)部(2007)。

1.4.3 棉鈴蟲 吐絲期接蟲，接蟲方法及接蟲次數同玉米螟。最后一次接蟲后14 d調查雌穗被害率、幼蟲存活數、雌穗被害長度，確定雌穗被害級別并計算平均值，判定玉米對棉鈴蟲的抗性水平。雌穗被害級別分級標準及抗性評價標準參照中華人民共和國農業(yè)部(2007)。

2 結果與分析

2.1 轉基因玉米雙抗505-12-5中Bt蛋白的時空表達

2.1.1 轉基因玉米雙抗505-12-5根、莖及葉片中Bt蛋白的時空表達 由圖1看出，根、莖、葉3種器官中，6～8葉期至吐絲期，Bt蛋白含量逐漸降低，乳熟期略有回升。6～8葉期，Bt蛋白含量最高，其中根部最高(517.3 ng·g-1)，其次為心葉(453.8 ng·g-1)，莖中表達量最低；大喇叭口期，根、莖、心葉中Bt蛋白含量均較6～8葉期降低，心葉中Bt蛋白含量最高(353.3 ng·g-1)，根中Bt蛋白降幅最大，為281.3 ng·g-1，總體表現為心葉>根>莖；吐絲期，根、莖、心葉中Bt蛋白含量繼續(xù)降低，仍然表現為心葉>根>莖；乳熟期，心葉Bt蛋白含量和吐絲期相比略有下降，為185.4 ng·g-1，根、莖中Bt蛋白上升，三者Bt蛋白含量相當，在160～190 ng·g-1之間，差異不顯著。6～8葉期是亞洲玉米螟的第一次發(fā)生高峰，第一代幼蟲均集中在心葉內取食，因此，6～8葉期Bt蛋白表達量高低是決定轉基因玉米后期能否推廣的關鍵。從研究結果看，6～8葉期心葉Bt蛋白表達量高達453.8 ng·g-1，對于防止亞洲玉米螟幼蟲侵害具有重要作用。

圖1 轉基因玉米雙抗505-12-5不同生育期根、莖、葉片中Bt蛋白含量Fig.1 Bt protein content of double-resistant 505-12-5 transgenic maize in root, stem and leaf at different growth stages

2.1.2 轉基因玉米雙抗505-12-5中Bt蛋白在繁殖器官中的表達 由圖2可以看出，轉基因玉米雙抗505-12-5繁殖器官中Bt蛋白含量比其他組織中含量低，不同繁殖器官Bt蛋白含量有差異，幼籽Bt蛋白含量最高(181.3 ng·g-1)，其他依次是花絲、花粉、雄穗，分別為100.1、95.0、79.8 ng·g-1。從吐絲期繁殖器官Bt蛋白含量看，籽粒和花絲中Bt蛋白含量較高，有助于抵御亞洲玉米螟幼蟲的侵害，可以有效減少入侵幼穗的亞洲玉米螟數量，從而保護幼穗，減少產量損失。

圖2 轉基因玉米雙抗505-12-5繁殖器官中Bt蛋白含量Fig.2 Bt protein content of double-resistant 505-12-5 transgenic maize in reproductive organs

2.2 轉基因玉米雙抗505-12-5對3種鱗翅目害蟲的田間抗蟲性

雙抗505-12-5對3種鱗翅目害蟲田間抗性見

表1。感蟲品種綜31對3種鱗翅目害蟲抗性均為感蟲水平。對亞洲玉米螟來說，心葉期和雌穗期，雙抗505-12-5的被害級別平均值分別為2.71、1.40，均表現為高抗，中科玉505均表現為感蟲，而當地對照登海3號在心葉期表現為中抗，在雌穗期表現為感蟲；對黏蟲來說，心葉期，雙抗505-12-5的平均食葉級值為1.97，抗性類型為高抗，中科玉505和登海3號分別為感蟲和抗性級別；對棉鈴蟲來說，雌穗期，雙抗505-12-5被害級別平均值為0.97，中科玉505和登海3號的被害級別平均值分別為5.97、5.67，均表現為感蟲。

總體看，轉基因玉米雙抗505-12-5田間對亞洲玉米螟、黏蟲、棉鈴蟲的抗性水平均達到高抗，抗性顯著高于非轉基因對照中科玉505及當地對照登海3號。

表1 轉基因玉米雙抗505-12-5對3種鱗翅目害蟲的田間抗性Table 1 Field resistance of double-resistant 505-12-5 transgenic maize against three Lepidoptera pests

同列不同小寫字母表示差異顯著。S：感蟲， HR：高抗， MR：中抗。

Small letters within a column represent significant differences among treatments atP<0.05. S: Susceptible; HR: High resistant; MR: Moderate resistant.

2.3 轉基因玉米雙抗505-12-5對3種鱗翅目害蟲的室內抗蟲性

6～8葉期，用雙抗505-12-5幼嫩葉片飼喂亞洲玉米螟幼蟲24 h后，校正死亡率為87.37%，48 h后達到100%；花絲期和乳熟期，接蟲后24 h，亞洲玉米螟幼蟲校正死亡率均達到100%。研究表明，轉基因玉米雙抗505-12-5在心葉期、花絲期和乳熟期均對亞洲玉米螟表現出明顯的抗蟲效果。

4～6葉期，雙抗505-12-5對黏蟲的抗性起效較慢，接蟲后24 h，黏蟲校正死亡率僅為10.17%，但接蟲后48 h，校正死亡率達到98.21%，表明雙抗505-12-5室內對黏蟲同樣具有較好的抗性。

花絲期，用雙抗505-12-5花絲飼喂棉鈴蟲幼蟲24 h后，棉鈴蟲幼蟲校正死亡率達到80.18%，48 h后校正死亡率為92.45%，表明雙抗505-12-5室內對棉鈴蟲也表現出較好的抗性。

3 討論

轉Bt基因玉米在美國、巴西等部分拉美國家已經得到大面積推廣，轉基因玉米占種植玉米總面積的80%以上，常見的轉Bt基因玉米有MON810、Bt176、Bt11等?？瓜x轉基因玉米外源殺蟲蛋白的表達量高低與玉米的殺蟲效果有直接的關系。本試驗中，心葉期根部Bt蛋白的含量最高，高于心葉等其他器官，但與心葉表達量相差僅為70 ng·g-1，這與其他報道心葉含量最高略有差異(姜志磊等，2008， 史曉利等，2009; 王建武等，2003)。隨著植株生長，到大喇叭口期，各器官表達量尤其根部Bt蛋白的含量顯著下降，心葉中的Bt蛋白表達量最高；吐絲期各器官Bt蛋白表達量持續(xù)降低，發(fā)育后期繁殖器官Bt蛋白表達量低于其他生育期各器官。總體來看，Bt蛋白表達量表現出隨著生育期延長而逐漸降低的趨勢，不同器官在不同生育期Bt蛋白的表達量也不同(王冬妍等，2004; 王建武等，2003)，國外主要抗蟲品種MON810 Bt蛋白時空表達的研究也顯示了類似的結果(Székácsetal.，2010)。Bt蛋白的表達量除了與轉基因調控元件有關外，與玉米品種、生長環(huán)境、播種時間也有關系。同一玉米品種播期不同，Bt蛋白表達量也有差異，如Bt11春玉米心葉比夏玉米心葉表達量低大約700 ng，而Bt-X春玉米心葉比夏玉米心葉表達量低約150 ng(王培等，2012)。另外，研究表明，Bt蛋白的表達量與溫度有關，在一定范圍內，溫度低，蛋白表達量相對較低(路獻勇等，2015)。

轉基因抗蟲玉米推廣前，除了測定蛋白表達量，最關鍵的是明確抗蟲效果。國外推廣品種經田間及離體生測試驗證實，均對靶標害蟲具有顯著的抗性(常雪等，2007; Burknessetal.，2001；Lynchetal.，1999； Williamsetal.，1998)。本試驗中，轉基因玉米雙抗505-12-5的室內抗蟲性鑒定結果表明，心葉期飼喂轉基因玉米雙抗505-12-5后48 h，亞洲玉米螟校正死亡率達100%。常雪等(2013)用轉cry1Ab/cry2Aj基因玉米不同品系心葉飼喂亞洲玉米螟幼蟲48 h的死亡率為60%～6.8%，96 h后大部分幼蟲死亡，死亡時間較雙抗505-12-5推遲；雙抗505-12-5花絲期、乳熟期飼喂亞洲玉米螟幼蟲校正死亡率24 h即達100%，常雪等(2013)發(fā)現亞洲玉米螟幼蟲取食轉cry1Ab/cry2Aj基因玉米各品系雄穗、苞葉、花絲和雌穗48 h后死亡率在90%左右；雙抗505-12-5花絲期飼喂棉鈴蟲后48 h，校正死亡率為92.45%，而常雪等(2016)發(fā)現取食轉3個轉cry1Ab/cry2Aj玉米品系和1個轉cry1Ab/vip3DA品系Bt玉米葉片96 h后棉鈴蟲死亡率為87.50%～90.00%，死亡時間較雙抗505-12-5推遲48 h。雙抗505-12-5心葉期飼喂黏蟲，接蟲后24 h校正死亡率僅為10.17%，但48 h后即達98.21%。轉基因玉米雙抗505-12-5室內對亞洲玉米螟、棉鈴蟲、黏蟲殺蟲效果更為快速，分析其原因可能是玉米材料不同，殺蟲蛋白活性有差別，同時與試蟲來源、飼養(yǎng)環(huán)境、飼養(yǎng)方法等有關。

轉基因玉米雙抗505-12-5田間接種3種試蟲后，基本沒有受害癥狀，在心葉期及花絲期對亞洲玉米螟的抗性、在心葉期對黏蟲、花絲期對棉鈴蟲的抗性均達高抗水平，其平均級值與非轉基因對照玉米、當地品種及感蟲品種相比，差異顯著。這與常雪等(2013)對國產轉cry1Ab/cry2Aj基因玉米的研究一致，其抗蟲效果不遜于國外常見轉基因抗蟲玉米(常雪等，2007; 常雪艷等，2006)。目前，國內報道的轉基因玉米大多也表現出了對靶標害蟲的良好抗性，如玉米螟對玉米Bt799的食葉級別為1級(武奉慈等，2014)，轉cry1Ah基因抗蟲玉米HGK60對于亞洲玉米螟和棉鈴蟲有很強的殺蟲活性，達到高抗級別，但對于黏蟲為抗性級別(宋苗等，2016)；BT-X高抗亞洲玉米螟(王培等，2012)，但大部分品種只研究了對某一種害蟲的抗性或僅研究了田間抗性，需進一步研究其綜合抗性。

綜合分析，轉基因玉米雙抗505-12-5對3種重要鱗翅目害蟲在田間及室內均表現了顯著的抗蟲性，值得進一步研究和推廣應用。

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