張 帆,鄭敏燕,郭 穎,魏永生

(咸陽師范學(xué)院 化學(xué)與化工學(xué)院,陜西 咸陽 712000)

橘子皮是蕓香科植物橘(Citrus Reticulate Blanco)及其栽培變種的成熟果皮,俗稱桔子皮。中藥陳皮又名貴老,有很高的藥用價(jià)值[1],其氣香,味苦辛,性溫,歸脾、肺經(jīng),能理氣健脾,燥濕化痰[2]。陳皮甙是橘子皮中的主要成分之一[3],與陳皮甙共存于橘子皮中的黃酮類化合物有新陳皮甙、柑桔黃甙、橙皮黃素、酸橙黃素等。橘子皮中還有中性內(nèi)酯類苦味質(zhì)檸檬素及揮發(fā)油等成分。陳皮甙對腸管有興奮作用,能降低毛細(xì)血管通透性,有健胃、止瀉、祛痰、驅(qū)風(fēng)、鎮(zhèn)嘔等藥理活性[4],也是羥基自由基(·OH)和超氧自由基等對人體有害的自由基的清除劑[5],可以延緩衰老。陳皮可應(yīng)用于食品、藥品、保健品、精細(xì)化工品等行業(yè)[6]。

目前,關(guān)于從橘子皮中提取陳皮甙的方法的研究較多,主要有堿液提取法、熱水提取法、醇提法、索氏提取法、微波輔助提取法、超聲波強(qiáng)化提取法、超臨界CO2萃取法等[7-8]。最經(jīng)濟(jì)實(shí)用的提取方法一般是超聲波輔助乙醇提法,設(shè)備易得,溶劑可回收再用,提取條件溫和,提取率較高。本研究以干橘子皮為原料提取陳皮甙,用超聲波輔助乙醇提法確定陳皮甙的最佳提取工藝條件,并測試陳皮甙的抗氧化活性,為橘子皮資源的開發(fā)利用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑和材料

儀器:UV-6300PC型紫外可見分光光度計(jì),上海美譜達(dá)儀器有限公司;FA214電子天平,梅特勒-托利多儀器有限公司;RE-2000E旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,上?？粕齼x器有限公司;SB-4200DTD超聲波清洗機(jī),寧波新芝生物科技股份有限公司;HH-系列恒溫水浴鍋,河北省黃駿市渤海電器廠;DHG-9070A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱,上海祁欣科學(xué)儀器有限公司;SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵,鄭州長城科工貿(mào)有限公司;抽濾瓶、布氏漏斗、索式提取器及玻璃儀器,天津市化玻儀器有限公司。

試劑:陳皮甙對照品，購置于中國藥品生物制品檢驗(yàn)所;95%乙醇、甲醇、乙醚、硝酸鋁、濃鹽酸、鎂粉、鄰二氮菲、過氧化氫、硫酸亞鐵、三氯化鋁、磷酸等,均為分析純,西安化學(xué)試劑廠。0.75 mmol鄰二氮菲溶液、0.75 mmol硫酸亞鐵溶液、pH=7.4的磷酸緩沖溶液,臨時(shí)配制。

材料:橘子皮，于2015年11月上旬收集于陜西南部的秦巴山區(qū),經(jīng)過鑒定,確認(rèn)是成熟橘子的外皮。將橘子皮置于烘箱中,保持50 ℃烘干,粉碎后過200目篩,密封備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 橘子皮中陳皮甙提取率的確定

準(zhǔn)確稱取陳皮甙對照品0.3750 mg,用乙醇定容,分別配置成0.001、0.002、0.003、0.004、0.005 mg/mL的陳皮甙對照品溶液,取4支10 mL的具塞試管，均加入陳皮甙對照品溶液4 mL,再分別加入1 mL 10%的硝酸鋁溶液,置于80 ℃的水浴鍋中反應(yīng)15 min,并定容至10 mL,在最大波長420 nm處用乙醇溶液作為參比,測定其吸光度,平行次數(shù)3次,取平均值。可得標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線方程為:y=23.200x+0.0166,R2=0.9999,其中，x指標(biāo)準(zhǔn)品的濃度(mg/mL),y為吸光度。稱取1.000 g橘子皮粉末,放入小型索氏提取器的濾紙桶里,用乙醚回流提取至無色，以除去脂溶性物質(zhì),回收乙醚[9]。將橘子皮粉末取出,晾干后放入塑料提取管,以乙醇溶液為提取溶劑,用超聲波輔助提取技術(shù)在不同的固液比、乙醇濃度、提取時(shí)間和提取溫度等條件下提取橘子皮中的陳皮甙,抽濾,將橘子皮粉末用同樣方法再提取一次,將濾液一起轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中,洗滌,用乙醇溶液定容。取待測樣品4 mL放入10 mL具塞試管,加入1 mL 10%的硝酸鋁溶液,置于80 ℃的水浴鍋中反應(yīng)15 min,并定容至10 mL,測定樣品時(shí),以硝酸鋁試劑作為空白，在420 nm處測定其吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸線方程確定陳皮甙的提取率。

1.2.2 陳皮甙提取工藝條件的優(yōu)化

采取超聲波輔助提取法,在超聲波功率為400 W、工作頻率為40 KHz條件下考察固液比、乙醇濃度、提取時(shí)間和提取溫度等因素對陳皮甙提取率的影響。實(shí)驗(yàn)中,固液比為1∶5、1∶9、1∶13、1∶17、1∶21(g/mL);乙醇濃度為50%、60%、70%、80%、90%;提取溫度為50、60、70、80、90 ℃；提取時(shí)間為5、15、25、35、45 min。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)四因素三水平L9(34)正交試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化,以確定超聲波輔助下陳皮甙提取的最佳工藝條件。

1.2.3 陳皮甙的定性檢測

在最佳工藝條件下提取陳皮甙,用10 mL甲醇將陳皮甙配成質(zhì)量百分比濃度為2%的陳皮甙甲醇溶液。通過陳皮甙與金屬離子的顏色反應(yīng)、還原性反應(yīng)定性檢測從橘子皮中提取的陳皮甙。與金屬離子反應(yīng):取陳皮甙少許置于試管中,加甲醇2 mL,在水浴中加熱溶解;加1%三氯化鋁試劑2～3滴,顏色呈鮮黃色。還原性反應(yīng):取陳皮甙少許置于試管中,加乙醇2 mL,在水浴中加熱溶解,然后向其中加入鎂粉約50 mg,振搖后,滴加濃鹽酸3～4滴,產(chǎn)生劇烈反應(yīng),溶液逐漸由淺黃色變?yōu)榧t色。

1.2.4 陳皮甙對羥基自由基清除率的測定

用鄰二氮菲-Fe2+氧化法測定Fe2+/H2O2體系中的·OH清除率。配制50 mL濃度為0.30 mg/mL的陳皮甙水溶液,取6支25.0 mL已編號的容量瓶,在每支瓶中加入1.0 mL 0.75 mmol/L鄰二氮菲溶液及0.2 mol/L(pH=7.4)的PBS緩沖溶液1.5 mL,混合均勻后再加入1.0 mL新配置的0.75 mmol/L硫酸亞鐵溶液,然后向1～6號容量瓶中分別加入2、4、6、8、10、12 mL的陳皮甙水溶液,搖勻后,再向每支容量瓶中加入新配制的0.01%過氧化氫各1 mL。另取2支25.0 mL的容量瓶并分別標(biāo)記為損傷管、未損傷管,在損傷管中加入0.01%的過氧化氫1 mL,未損傷管中不加過氧化氫。然后,用蒸餾水將8支容量瓶定容至刻度線,充分搖勻,在37 ℃的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h后取出,冷卻至室溫,在波長為510 nm下測量樣品的吸光度A,平行測三次,取平均值。對·OH清除率計(jì)算公式為:I(%)=(A2-A0)/(A1-A0)×100%。其中,A2為陳皮甙水溶液的吸光度，A1為未損傷溶液的吸光度，A0為損傷溶液的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 固液比對陳皮甙提取率的影響

實(shí)驗(yàn)條件如下：提取溫度為80 ℃,乙醇濃度為80%,固液比分別為1∶5、1∶9、1∶13、1∶17、1∶21,在超聲波清洗機(jī)中提取35 min。固液比對陳皮甙提取率的影響如圖1所示。在溫度和乙醇濃度一定的條件下,當(dāng)固液比為1∶17時(shí),橘子皮中陳皮甙的提取率最高。溶劑過少或過多都會影響陳皮甙的提取率:溶劑過少,溶解不充分,不利于陳皮甙分子擴(kuò)散;溶劑過多,耗損能量,使超聲波對陳皮甙分子的作用力減小。因此,選定固液比為1∶17。

圖1 固液比對提取率的影響

2.1.2 乙醇濃度對陳皮甙提取率的影響

提取溫度為80 ℃,固液比為1∶17,乙醇濃度分別為50%、60%、70%、80%、90%,在超聲波清洗機(jī)中提取35 min。乙醇濃度對陳皮甙提取率的影響如圖2所示。在溫度、固液比、時(shí)間一定的條件下,乙醇濃度為80%時(shí),橘子皮中陳皮甙的提取率最高,可達(dá)6.11%;當(dāng)乙醇濃度高于80%時(shí),陳皮甙的提取率明顯下降?？梢姡掖紳舛葘μ崛÷视休^大影響。乙醇濃度過高時(shí)會抑制陳皮甙分子溶出,這與陳皮甙分子的糖體不易溶于高濃度乙醇溶液的結(jié)果相一致。因此,確定乙醇濃度為80%。

圖2 乙醇濃度對提取率的影響

2.1.3 溫度對浸提效果的影響

固液比為1∶17、乙醇濃度為80%,溫度分別為50、60、70、80、90 ℃，在超聲波清洗機(jī)中提取35 min。提取溫度對陳皮甙提取率的影響如圖3所示。當(dāng)溫度為80 ℃時(shí),橘子皮中陳皮甙的提取率最高,為6.09%。提取溫度過低不利于陳皮甙的析出；陳皮甙的提取率隨著溫度的升高而升高；當(dāng)溫度超過80 ℃時(shí)，提取率開始下降,提取液在較高溫度時(shí)在超聲波輔助下會使陳皮甙降解。應(yīng)選擇在乙醇溶液微沸的狀態(tài)下從橘子皮中提取陳皮甙,確定提取溫度為80 ℃。

圖3 提取溫度對提取率的影響

2.1.4 提取時(shí)間對浸提效果的影響

固液比為1∶17、乙醇濃度為80%、提取溫度為80 ℃，提取時(shí)間分別為5、15、25、35、45 min,在超聲波清洗機(jī)中提取陳皮甙。提取時(shí)間對陳皮甙提取率的影響如圖4所示。在5～35 min時(shí),陳皮甙的提取率持續(xù)遞增;陳皮甙的提取率在35 min后開始下降;較長時(shí)間的超聲波處理和持續(xù)的加熱會使陳皮甙中的部分糖甙鍵斷裂,使其提取率降低。選定提取時(shí)間為35 min。

圖4 提取時(shí)間對提取率的影響

2.2 正交試驗(yàn)

在固液比、提取液濃度、提取溫度及提取時(shí)間等單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,依據(jù)各因素的選取范圍,設(shè)計(jì)四因素三水平L9(34)正交試驗(yàn)表進(jìn)行研究,以優(yōu)化和確定陳皮甙的最佳提取工藝條件。因素水平見表1,正交試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表1 試驗(yàn)因素水平

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表:

由表2可知,影響陳皮甙提取率的主次因素為:乙醇濃度>固液比>提取溫度>提取時(shí)間。最佳工藝條件為:超聲波功率400 W,工作頻率40 KHz,固液比1∶17,乙醇濃度80%,溫度80 ℃，提取時(shí)間35 min。在該工藝條件下進(jìn)行驗(yàn)證,實(shí)驗(yàn)平行3次,取平均值,得到陳皮甙的提取率為6.60%。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果與正交試驗(yàn)結(jié)果基本一致,說明該提取工藝有可行性,重現(xiàn)性好,陳皮甙的提取率穩(wěn)定,適合中小企業(yè)批量生產(chǎn)。

2.3 陳皮甙的顯色

從橘子皮中提取的陳皮甙經(jīng)定性檢驗(yàn),其顯色實(shí)驗(yàn)結(jié)果對比如圖5所示。從左至右,第一個試管中是未加濃鹽酸和鎂粉的陳皮甙乙醇溶液,溶液呈淺黃色;第二個試管是第一個試管的對照品,其中是加入濃鹽酸和鎂粉的陳皮甙乙醇溶液,溶液由淺黃色變?yōu)榧t色。第三個試管中是未加三氯化鋁的陳皮甙甲醇溶液,溶液呈淺黃色;第四個試管是第三個試管的對照品,里面是加了三氯化鋁的陳皮甙甲醇溶液,溶液由淺黃色變?yōu)轷r黃色,說明從橘子皮中可以提取陳皮甙。

圖5 陳皮甙的顯色實(shí)驗(yàn)

2.4 陳皮甙對·OH的清除作用

陳皮甙對·OH的清除實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。隨著陳皮甙水溶液濃度的增大,陳皮甙對·OH的清除率呈現(xiàn)增高趨勢,陳皮甙的用量與·OH的清除率之間存在量效關(guān)系,陳皮甙對·OH有很好的清除作用。實(shí)驗(yàn)平行進(jìn)行3次,由圖6中的曲線可以看出陳皮甙對·OH的清除作用明顯且穩(wěn)定。隨著陳皮甙濃度的增大,對·OH的清除率不斷提高,說明陳皮甙具有抗氧化活性。

圖6 陳皮甙對·OH的清除作用

3 結(jié)論

在功率400 W、工作頻率40 KHz的超聲波輔助作用下,考察固液比、乙醇濃度、提取時(shí)間和提取溫度等單因素對陳皮甙提取率的影響。通過四因素三水平正交試驗(yàn)確定從橘子皮中提取陳皮甙的最佳工藝提取條件為:固液比1∶17(g/mL),乙醇濃度80%,提取溫度80 ℃,提取時(shí)間35 min。在該工藝條件下,陳皮甙的提取率可達(dá)6.6%。此工藝可為中小企業(yè)規(guī)?；a(chǎn)提供前期的技術(shù)支撐。從橘子皮中提取陳皮甙進(jìn)行定性檢驗(yàn),結(jié)果說明可從橘子皮中提取陳皮甙。通過Fe2+/H2O2體系測試陳皮甙清除·OH的效果,結(jié)果顯示陳皮甙對·OH有明顯的清除作用,且陳皮甙的用量與·OH的清除率之間存在量效關(guān)系,這為陳皮甙的應(yīng)用提供了參考。本研究僅初步從橘子皮中提取陳皮甙,并對陳皮甙清除·OH的效果進(jìn)行測試,關(guān)于陳皮甙的其他生物活性及其構(gòu)效關(guān)系有待深入研究。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[Z].北京:中國醫(yī)藥科技出版社, 2015:191.

[2]劉潘雋麗,楊翠平,蘇薇薇.枳殼類藥材的研究概況[J].中藥材,2003(10):23-26.

[3]宋玉鵬, 陳海芳,譚舒舒, 等.不同陳皮來源藥材中橙皮苷、川陳皮素、橘皮素和辛弗林的含量比較[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥, 2017, 28(9):2061-2064.

[4]文高艷,周賢梅.陳皮有效成分在呼吸系統(tǒng)中的作用研究[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2011,20(3):385-386.

[5]黃芳, 周宏, 陳華,等.橘皮中橙皮苷提取的優(yōu)化及其對羥自由基清除作用[J].食品與發(fā)酵工業(yè), 2012, 38(5):223-228.

[6]信維平,孫建華,祁宏.陳皮中陳皮甙的提取和應(yīng)用的研究[J].食品研究與開發(fā),2006,27(1):23-25.

[7]成超,韓德花,鮑正榮.陳皮中橙皮甙浸出方式研究[J].成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2005,28(4):53-54.

[8]耿敬章,劉軍海,吳三橋.柑橘皮渣橘皮苷的提取及其抑菌性質(zhì)研究[J].食品工業(yè),2014,35(8):87-91.

[9]劉存芳,史娟,張強(qiáng).橘皮多糖超聲輔助提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究[J].食品與機(jī)械,2016,32(8):147-150.