段春影,王金龍,于志超

(齊齊哈爾工程學(xué)院 管理工程系,黑龍江 齊齊哈爾 150030)

氟比洛芬是新一代的非甾體抗炎藥,具有消炎、止痛和退熱功能,臨床上多用于治療肌肉、骨骼和關(guān)節(jié)的疼痛[1-2]。氟比洛芬的物理性質(zhì)主要表現(xiàn)為白色或類白色結(jié)晶性粉末,不溶于水,易溶于有機(jī)溶劑,熔點為114～117 ℃[3]。氟比洛芬通過抑制身體內(nèi)某種酶的活性，從而達(dá)到鎮(zhèn)痛的作用。目前，氟比洛芬緩釋膠囊劑已在日本上市,該藥口服有效、耐受性好,長期使用不會對身體代謝造成傷害。此外,還有栓劑、親水凝膠骨架片、固體分散體等制劑正在研究中。氟比洛芬分子中有一個氟原子,氟原子的獨特性能使其在同類藥物中作用較強(qiáng),治療劑量小,副作用較低[4]。

氟比洛芬酯是非甾體抗炎藥氟比洛芬的酯類前體藥物,對癌癥性疼痛和術(shù)后疼痛的臨床療效明顯。超前鎮(zhèn)痛,指在中樞神經(jīng)系統(tǒng)敏感化之前,通過使用藥物,消除或減輕術(shù)后疼痛[5]。非甾體抗炎藥的作用機(jī)理主要是通過抑制環(huán)氧合酶,使外周和中樞前列腺素的含量降低,從而抑制外周和中樞的活性,進(jìn)而減輕有害刺激引起的疼痛反應(yīng)[6]。有研究報道:在甲狀腺切除手術(shù)中,氟比洛芬酯的超前鎮(zhèn)痛作用能夠顯著減少麻醉藥品的使用量[7]。

本研究通過單因素實驗和正交試驗,確定制備氟比洛芬淀粉酯的最佳工藝條件,為接下來的相關(guān)研究提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米淀粉,黑龍江龍鳳玉米開發(fā)有限公司;氟比洛芬,太倉運通生物化工有限公司;Novozym 435,諾維信公司;異辛烷,山東樺超化工有限公司;無水乙醇,天津市天力化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA220S-CW精密天平，Sartorius公司;BSA224S-CW分析天平，Sartorius公司;EMS-8C恒溫磁力攪拌器，天津歐諾儀器儀表有限公司;DHG-9053A電熱恒溫干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司;2-16k高速冷凍離心機(jī)，Sigma公司;JJ-1精密定式電動攪拌器，江蘇榮華儀器制造有限公司;旋光儀;紫外高效液相色譜儀。

1.3 方法

1.3.1 玉米淀粉的預(yù)處理方法

將質(zhì)量比為2 ∶1的氫氧化鈉和尿素加入100 mL去離子水，配制成濃度為9%的氫氧化鈉/尿素混合溶液,置于冰箱中冷卻至-12 ℃左右;在快速攪拌下緩慢加入5%的干基玉米淀粉,繼續(xù)攪拌至形成透明、均勻的淀粉糊;滴加稀鹽酸至中性,再慢慢滴加無水乙醇使淀粉沉淀析出;用95%乙醇溶液洗滌析出的淀粉數(shù)次直至無氯離子,再用無水乙醇洗滌以脫去水分,50 ℃真空干燥12 h,得到預(yù)處理淀粉。

1.3.2 氟比洛芬淀粉酯的酶催化合成工藝流程

氟比洛芬淀粉酯的酶催化合成工藝流程見圖1。

圖1 氟比洛芬淀粉酯的酶催化合成工藝流程

1.3.3 氟比洛芬淀粉酯合成單因素實驗

1.3.3.1 底物質(zhì)量比對酶促反應(yīng)的影響

氟比洛芬與預(yù)處理淀粉的質(zhì)量比分別為0.5∶1、1∶1、1∶2、1∶3、2∶1,反應(yīng)時間為6 d,反應(yīng)溫度為50 ℃,酶添加量為3%。利用旋光儀和紫外分光光度計對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行測定,得出不同質(zhì)量配比條件下的旋光度和吸光度,然后計算反應(yīng)產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率和EEp。

1.3.3.2 反應(yīng)溫度對酶促反應(yīng)的影響

反應(yīng)溫度的變化范圍為50～70 ℃,間隔溫度為5 ℃,反應(yīng)時間為6 d,氟比洛芬與預(yù)處理淀粉的質(zhì)量比為1∶2,酶添加量為3%。利用旋光儀和紫外分光光度計對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行測定,得出不同反應(yīng)溫度條件下的旋光度和吸光度,然后計算反應(yīng)產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率和EEp。

1.3.3.3 反應(yīng)時間對酶促反應(yīng)的影響

反應(yīng)時間的變化范圍為3～7 d,間隔時間為1 d,反應(yīng)溫度為50 ℃,氟比洛芬與預(yù)處理淀粉的質(zhì)量比為1∶2,酶添加量為3%。利用旋光儀和紫外分光光度計對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行測定,得出不同反應(yīng)時間條件下的旋光度和吸光度,然后計算反應(yīng)產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率和EEp。

1.3.3.4 酶添加量對酶促反應(yīng)的影響

酶添加量分別為3%、5%、7%、9%,間隔用量為2%,反應(yīng)溫度為50 ℃,反應(yīng)時間為6 d,氟比洛芬與預(yù)處理淀粉的質(zhì)量比為1∶2。利用旋光儀和紫外分光光度計對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行測定,得出不同酶添加量條件下的旋光度和吸光度,然后計算反應(yīng)產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率和EEp。

1.3.4 酶促酯化反應(yīng)工藝條件的優(yōu)化

在單因素實驗的基礎(chǔ)上,設(shè)計L9(34)正交試驗(見表1)。初始水活度控制在0.1,以氟比洛芬的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物對映體過量值作為評價指標(biāo)。

1.3.5 旋光值和吸光度的測定

1.3.5.1 旋光值的測定

表1 正交試驗因素水平表

在反應(yīng)好的產(chǎn)物中加入47 mL異辛烷，將其徹底溶開,然后將旋光儀打開預(yù)熱10 min,選擇1 dm長度的旋光管進(jìn)行測量,在測量之前注意用異辛烷進(jìn)行調(diào)零。

1.3.5.2 吸光度的測定

用721分光光度計在294 nm處測量每組產(chǎn)物的吸光度,在測量之前用異辛烷進(jìn)行調(diào)零,然后將反應(yīng)后的樣品倒入比色皿,從而得出實驗數(shù)據(jù)。

1.3.6 計算方法

首先利用旋光儀測出旋光度,根據(jù)公式[α] Dt=αDt/Ld=αDt/Lc進(jìn)行計算,其中,L是旋光管的長度,c是測定液的濃度;然后利用C%=M剩/M原,計算產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率;再利用EEs=[α]Dt/77求出EEs;最后根據(jù)EEp=EEs×(1-C)/C,得出產(chǎn)物的對映體過量值。

1.3.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

稱取1g氟比洛芬原料藥置于10 mL容量瓶中,加入適量的pH 7.4磷酸鹽緩沖液，使其充分溶解,以空白灌流液定容配制成質(zhì)量濃度為1 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)液。分別精密移取不同體積的氟比洛芬標(biāo)準(zhǔn)液至容量瓶中,以空白灌流液定容配制成質(zhì)量濃度分別為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50 mg/L的氟比洛芬系列標(biāo)準(zhǔn)液,根據(jù)氟比洛芬的濃度和吸光度進(jìn)行線性回歸計算。

1.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

重復(fù)測定3次,取測定數(shù)據(jù)的平均值,通過SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,采用Microsoft Excel 2003軟件制圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 氟比洛芬標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

在實驗條件下,以吸光度(Y)為縱坐標(biāo)、氟比洛芬的濃度(X)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。氟比洛芬標(biāo)準(zhǔn)液的濃度范圍在0.05～0.50 mg/L。由圖2可以看出,吸光度與氟比洛芬的濃度呈良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)均大于0.99。氟比洛芬的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程是y=7.04x+0.172,R2=0.997。

圖2 氟比洛芬的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 氟比洛芬淀粉酯合成單因素實驗結(jié)果

2.2.1 底物質(zhì)量比對酶促反應(yīng)的影響

由圖3可知,當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量比為0.5 ∶1時，EEp最高,但是產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率僅為13%;當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量比為1∶2時,產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率和EEp分別為25.6%和40.2%。綜合考慮,在底物質(zhì)量比為1∶2的條件下,氟比洛芬淀粉酯的轉(zhuǎn)化率和EEp為最佳。

圖3 底物質(zhì)量比對酶促反應(yīng)的影響

2.2.2 反應(yīng)溫度對酶促反應(yīng)的影響

在酶添加量、反應(yīng)時間及底物質(zhì)量比不變的條件下,反應(yīng)溫度對氟比洛芬淀粉酯的轉(zhuǎn)化率及EEp的影響見圖4。在反應(yīng)溫度為60 ℃時,氟比洛芬淀粉酯的轉(zhuǎn)化率為28.3%,對映體過量值EEp為35.4%。轉(zhuǎn)化率隨著溫度的升高而不斷增長,但是當(dāng)溫度過高時,酶的活性受到影響,所以增長趨勢逐漸減緩。對映體過量值隨著溫度的升高呈下降趨勢。綜合考慮,當(dāng)反應(yīng)溫度為60 ℃時,產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率和對映體過量值EEp為最佳。

圖4 反應(yīng)溫度對酶促反應(yīng)的影響

2.2.3 反應(yīng)時間對酶促反應(yīng)的影響

在其他反應(yīng)條件不變的情況下,反應(yīng)時間對氟比洛芬淀粉酯的轉(zhuǎn)化率及EEp的影響見圖5。隨著時間的延長,氟比洛芬淀粉酯轉(zhuǎn)化率從12.3%增長到29.7%,而對映體過量值EEp從35.6%降到26.5%。在反應(yīng)時間為4 d時,轉(zhuǎn)化率和EEp分別為22.3%和33.4%。綜合考慮,當(dāng)反應(yīng)時間為4 d時,產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率和對映體過量值EEp為最佳。

圖5 反應(yīng)時間對酶促反應(yīng)的影響

2.2.4 酶添加量對酶促反應(yīng)的影響

在其他反應(yīng)條件不變的情況下,酶添加量對氟比洛芬淀粉酯的轉(zhuǎn)化率及EEp的影響見圖6。當(dāng)酶添加量為5%時,產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率和EEp分別為15.6%和34.8%。隨著酶添加量的增加,產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率也相應(yīng)提高,但對映體過量值隨著酶添加量的增加呈下降趨勢。綜合考慮,當(dāng)酶添加量為5%時,產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率和對映體過量值EEp為最佳。

圖6 酶添加量對酶促反應(yīng)的影響

2.3 氟比洛芬淀粉酯合成正交試驗結(jié)果

從表2可以看出,氟比洛芬淀粉酯極差R值的變動范圍在0.028～0.204時,酶添加量的影響最大,反應(yīng)溫度的影響最小。通過正交試驗，確定制備氟比洛芬淀粉酯的最佳工藝條件為A2B1C2D2,即酶添加量5%、反應(yīng)時間4 d、底物比1∶2、反應(yīng)溫度60 ℃,在此條件下,產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率為35%，對映體過量值EEp為55.45%。

表2 正交試驗結(jié)果

3 結(jié)論

外消旋體的拆分方法包括物理、化學(xué)、生物、色譜、萃取和分子印跡等拆分法。物理拆分法[8-9]主要是利用一定溫度下某一旋光異構(gòu)體的溶解度比外消旋體小的原理,通過加入單一的旋光異構(gòu)體,使其析出異構(gòu)體的結(jié)晶,最終獲得單一對映體。它是最原始、最經(jīng)濟(jì)的方法,但是該方法的收率低,過程煩瑣,對于工業(yè)化生產(chǎn)并不適用。目前,最常用的是化學(xué)拆分法[10],主要是通過結(jié)晶和重結(jié)晶的方法對某種對映體進(jìn)行提純分離。

一般采用脂酶催化酯交換的方法獲得R-2-苯氧基丙酸衍生物時,可以通過加入甲醇鈉,在加熱的條件下對無效的 S-2-苯氧基丙酸衍生物進(jìn)行不斷的消旋化[11],進(jìn)而使分子達(dá)到最大程度的拆分。廖本仁等[12]以取代水楊醛為消旋催化劑,在扁桃酸手性助劑作用下實現(xiàn)了苯甘氨酰胺的動態(tài)動力學(xué)拆分,其單程收率超過82%,光學(xué)純度達(dá)99%。

隨著固定化酶技術(shù)的不斷發(fā)展,酶拆分技術(shù)在手性拆分中有著良好的前景。生物拆分法現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于手性醇[13]、胺類藥物[14]、氨基酸[15-16]等的手性拆分中。徐剛等[17]對不同來源的酶進(jìn)行篩選,選出兩種選擇性較強(qiáng)的酶用于拆分2-氯-1-(2-噻吩)-乙醇,其對映體過量值高達(dá)98.5%。由于氟比洛芬有R、S兩種構(gòu)型,而435脂肪酶只對R型有專一作用,因此可以將氟比洛芬酯化拆分,從而得到在醫(yī)療方面更有用的R型。在酯化過程中,淀粉主要起到緩釋作用,減輕藥物對腸胃的副作用。

本文通過單因素實驗和正交試驗,確定制備氟比洛芬淀粉酯的最佳工藝條件:酶添加量5%、反應(yīng)時間4 d、底物比1∶2、反應(yīng)溫度60 ℃。在此條件下,產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率為35%，對映體過量值EEp為55.45%。

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