鐘俊良，魏彩姣，孫雪言，趙喜紅

（武漢工程大學化工與制藥學院，湖北武漢430073）

食品防腐劑在食品的生產(chǎn)過程中發(fā)揮著不可取代的作用，是重要的食品添加劑，對食品的保存和風味的保持發(fā)揮著關(guān)鍵作用，是目前食品以及相關(guān)行業(yè)研究的重點[1]。防腐劑主要有天然生物防腐劑和人工合成防腐劑兩大類，天然生物型防腐劑是通過抑制微生物在食品中的生長繁殖和抑制食品中氧化、酶促等反應(yīng)來發(fā)揮作用的[2]，而日常生活中用的化學防腐劑大多都是人工合成的，如苯甲酸鈉和山梨酸鉀等。由于化學類防腐劑具有潛在毒性，在一定程度上損害人體健康，所以天然生物防腐劑因安全無毒和抗菌性好等特點而逐漸成為當前的研究熱點。

乳酸鏈球菌素（Nisin）作為一種新型的細菌素天然生物防腐劑，具有安全、無毒的特性而廣泛應(yīng)用于肉制品、乳制品、腌漬食品等。Nisin對大部分的G+菌有比較強的抑制效果，比如耐熱腐敗菌、產(chǎn)芽孢桿菌、生孢梭菌等細菌，但對大部分G-菌及真菌無抑制效果[3]。納他霉素是微生物源天然生物防腐劑中的經(jīng)多種霉菌發(fā)酵產(chǎn)生的環(huán)內(nèi)酯類抗生素[4]。納他霉素相比較于其他的抑菌素，對哺乳動物細胞毒性極低，已被批準可作為食品防腐劑和抗真菌劑應(yīng)用于肉類、乳制品等食品的加工貯藏[5]。植酸是從植物的種子里提取出來的純天然無毒物質(zhì)，對絕大多數(shù)金屬離子有極強的螯合能力，能夠抑制大部分G+及其芽孢的生長與繁殖[6]。

本實驗依據(jù)GB 2760-2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》中規(guī)定的食品添加劑最大使用量（0.1%），通過控制變量研究上述天然生物防腐劑在不同濃度下分別對單核增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）和大腸桿菌O157：H7（Escherichia coli O157：H7）的抑制效果，同時使用苯甲酸鈉作為對照組比較化學防腐劑與生物防腐劑的抑菌效果，以期為食源性致病菌的安全控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Nisin、胰蛋白胨、酵母膏提取物：青島海博生物技術(shù)有限公司；納他霉素：河北大唐生物工程有限公司；植酸：廣州全奧化工產(chǎn)品有限公司；苯甲酸鈉：青島豐泰化工有限公司；酒精、醫(yī)用酒精：廣州全奧化工產(chǎn)品有限公司；氯化鈉：國藥集團化學試劑有限公司；瓊脂：北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；無菌水：武漢工程大學實驗室。

1.2 儀器與設(shè)備

CHA-SA數(shù)顯恒溫振蕩器：常州市國旺儀器制造有限公司；DSX-280KB30手提式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-2FB超凈工作臺：上海尚道儀器制造有限公司；ME104E/02電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；SPX-150BSH-Ⅱ生化培養(yǎng)箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；OHG-9073BS-Ⅲ電熱恒溫鼓風干燥箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；HH-S2智能數(shù)顯恒溫水浴鍋：鞏義市予華儀器有限責任公司。

1.3 試驗菌種

本試驗中所用標準菌株均來源于美國模式培養(yǎng)物保藏所（ATCC），包括單核細胞增生李斯特菌（ATCC 19114）、蠟樣芽孢桿菌（ATCC 13061）、大腸桿菌 O157：H7（ATCC 43895）。

1.4 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨10 g，酵母膏5 g，氯化鈉10 g，瓊脂15 g；牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨 10 g，酵母膏 5 g，氯化鈉 10 g。

1.5 方法

1.5.1 細菌活化及菌懸液的制備

菌株單核增生李斯特菌、蠟樣芽孢桿菌和大腸桿菌O157：H7保藏在-20℃、50%的甘油中，用移液槍取0.1 mL保藏菌液接入裝有9.9 mL液體培養(yǎng)基的試管中，置于37℃的搖床上130 r/min震蕩培養(yǎng)12 h（約108CFU/mL），于4℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 單一防腐劑對3種食源性致病菌抑制作用研究

將Nisin、納他霉素、植酸和苯甲酸鈉按照GB 2760-2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》規(guī)定的最大添加量稀釋成不同的質(zhì)量濃度，添加到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，分別接入1 mL上述保存的菌種，各防腐劑最終濃度如表1所示。將已接種試管置于37℃的培養(yǎng)箱中隔夜培養(yǎng)12 h后，用稀釋涂布平板計數(shù)法進行計數(shù)。

表1 防腐劑的最終濃度Table 1 The final concentration of preservatives

1.6 分析方法

使用平板計數(shù)法測定得出菌落數(shù)后，用致病菌的抑菌率來評價各個防腐劑對致病菌的抑菌效果。抑菌率計算公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 單一防腐劑對3種食源性致病菌的抑制效果

2.1.1 不同濃度的Nisin對致病菌的抑制效果

在國標濃度范圍0.1%內(nèi)，Nisin對3種食源性致病菌有不同程度的抑制作用，結(jié)果見圖1。

圖1 不同濃度的Nisin對單增李斯特菌、蠟樣芽孢桿菌和大腸桿菌O157：H7的抑菌率Fig.1 Depression effect of the different density of Nisin on Listeria monocytogenes，Bacillus cereus and E.coli O157：H7

由圖1可知，Nisin對單增李斯特菌和蠟樣芽孢桿菌的抑制效果最明顯，當Nisin質(zhì)量濃度為0.01%時，單增李斯特菌和蠟樣芽孢桿菌的抑菌率分別為99.92%和98.78%，而大腸桿菌O157：H7的抑菌率只有46.07%。當Nisin濃度達到0.02%時，單增李斯特菌和蠟樣芽孢桿菌的抑制率已達100%，但大腸桿菌O157：H7的抑菌率只有52.81%。當濃度達到國標0.1%時，大腸桿菌O157：H7抑制率只有61.12%。據(jù)有關(guān)文獻報道，當Nisin的濃度高于10 μg/mL（0.000 1%）時對單增李斯特菌有一定的殺菌作用，當其濃度高于150 μg/mL（0.015%）時，幾乎所有的單增李斯特菌都被殺死[7]，與本試驗結(jié)果相符合。雖然Nisin對大腸桿菌O157：H7的抑制效果不理想，但隨著Nisin濃度的增加，其對大腸桿菌O157：H7的抑制效果緩慢提高。

本文的水系統(tǒng)指的是城市人工水系統(tǒng)，包括與城市水資源開發(fā)利用有關(guān)的水源取水、供水、輸水、用水、排水、污水處理與回用等環(huán)節(jié)。除了各個環(huán)節(jié)基礎(chǔ)設(shè)施的建造需要消耗大量的物資和能源之外，水系統(tǒng)在運行過程中也需要大量的能源投入，例如城市供水管網(wǎng)的輸配水能耗，污水處理廠進行污水處理的能耗等。在城市水系統(tǒng)巨大能源消耗的背后是可觀的碳排放。在我國，已有研究和經(jīng)驗表明給排水行業(yè)是城市的用電大戶，目前我國大多數(shù)供水企業(yè)的平均耗電量占總制水成本的20%~30%，城市水系統(tǒng)運行中的碳排放不容忽視。

2.1.2 不同濃度的納他霉素對致病菌的抑制效果

不同濃度的納他霉素對致病菌的抑制效果見圖2。

圖2 不同濃度的納他霉素對單增李斯特菌、蠟樣芽孢桿菌和大腸桿菌O157：H7的抑菌率Fig.2 Depression effect of the different density of Natamycin on Listeria monocytogenes，Bacillus cereus，and E.coli O157：H7

從圖2可得，當濃度為0.01%～0.05%時，納他霉素對3種致病菌的抑菌率在20%內(nèi)上下起伏，可能是平板計數(shù)法存在一定的測量誤差所致，可以認為在該濃度范圍內(nèi)納他霉素無法抑制3種致病菌。當濃度到達0.1%時，3種致病菌的抑菌率明顯提高，分析原因可能是由于較高濃度的納他霉素會在一定程度上改變了膜內(nèi)外滲透壓，從而抑制住了部分細菌的生長。

2.1.3 不同濃度的植酸對致病菌的抑制效果

不同濃度的植酸對致病菌的抑制效果見圖3。

圖3 不同濃度的植酸對單增李斯特菌、蠟樣芽孢桿菌和大腸桿菌O157：H7的抑菌率Fig.3 Depression effect of the different density of Phytic acid on Listeria monocytogenes，Bacillus cereus，and E.coli O157：H7

隨著植酸濃度的變化，3種致病菌的數(shù)量級雖然沒有改變，但致病菌的抑菌率隨著濃度的升高而表現(xiàn)逐漸提高的趨勢。當植酸的濃度為0.01%時，蠟樣芽孢桿菌的抑菌率為9.43%，但單增李斯特菌和大腸桿菌O157：H7的抑菌率為0%。當濃度提高到0.02%時，植酸對3種致病菌表現(xiàn)出微弱的抑制效果。當濃度達到0.03%以后，植酸對3種致病菌的抑制效果逐漸提高，其中對單增李斯特菌的抑制效果最好，而對大腸桿菌O157：H7的抑制率最低，分析原因可能是因為大腸桿菌具有極強的耐酸性[8]，相對于其他兩種致病菌更適合生存在植酸的低pH值環(huán)境中，另外有文獻報道了植酸對大腸桿菌O157：H7的最小抑制濃度為0.4%[9]，說明了高濃度的植酸才能有效抑制大腸桿菌O157：H7的生長。其次，植酸極強的螯合能力能夠抑制大部分G+菌及其芽孢的生長與繁殖。但從實驗結(jié)果來看，植酸的抑菌效果不佳，可考慮與Nisin進行復(fù)配從而提高抑菌效果。有研究表明，1 mg/mL的Nisin與1.5 mg/mL的植酸進行復(fù)配可以有效抑制菌液濃度在106CFU/mL的食源性致病菌[10]。

2.1.4 不同濃度的苯甲酸鈉對致病菌的抑制效果

不同濃度的苯甲酸鈉對致病菌的抑制效果見圖4。

由圖4可知，隨著苯甲酸鈉的濃度增加，3種致病菌的抑菌率也逐步增加，但整體抑菌效果不佳。本試驗探究了當苯甲酸鈉濃度達國家標準0.1%時，單增李斯特菌、大腸桿菌O157：H7和蠟樣芽孢桿菌的抑菌率只有66.15%、54.41%和45.19%。據(jù)相關(guān)文獻報道，當苯甲酸鈉濃度為0.3%時才能顯著地抑制住大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長[11]，而楊榮杰[12]也通過實驗得出苯甲酸鈉對蠟樣芽孢桿菌的最小抑制濃度為1%，這說明了苯甲酸鈉的濃度需要超過國家標準濃度才能夠抑制住食源性致病菌的生長。

圖4 不同濃度的苯甲酸鈉對單增李斯特菌、蠟樣芽孢桿菌和大腸桿菌O157：H7的抑菌率Fig.4 Depression effect of the different density of Sodium benzoate on Listeria monocytogenes，Bacillus cereus，and E.coli O157：H7

2.2 等質(zhì)量濃度的不同防腐劑對3種食源性致病菌的抑制效果

為了比較天然生物防腐劑與化學類防腐劑對3種食源性致病菌的抑菌效果，現(xiàn)將等質(zhì)量濃度的四種防腐劑對致病菌的抑制率匯總在圖5中。

從圖5A可知，當質(zhì)量濃度為0.01%時，Nisin對單增李斯特菌和蠟樣芽孢桿菌的抑制率接近百分之百，但是對大腸桿菌O157：H7的抑制率只有46.07%，由此可見較低濃度的Nisin依然有效抑制G+菌生長，而且在此濃度下Nisin對3種菌的抑菌效果要比其他3種防腐劑理想。相反地，在0.01%濃度下的植酸對3種致病菌的抑制效果極不理想，而且對單增李斯特菌和大腸桿菌O157：H7有促生長作用，分析原因可能是因為植酸是能夠改善細菌細胞膜對氧氣的通透性、增加物質(zhì)之間的傳遞性，從而導(dǎo)致了細菌的快速生長和繁殖[13]。

圖5 等質(zhì)量濃度的不同防腐劑對3種食源性致病菌的抑制效果Fig.5 Antibacterial activities of different food preservatives at the same concentration against three species of bacteria

隨著防腐劑濃度的升高，不同防腐劑對3種致病菌的抑菌趨勢基本保持一致，抑菌效果最好的是Nisin，其次是苯甲酸鈉、植酸和納他霉素。當濃度達0.1%時，從圖5D可知納他霉素對大腸桿菌O157：H7的抑菌率超過了植酸，但是對其他兩種致病菌的抑菌率依然低于植酸。

3 討論

以上結(jié)果表明，當Nisin濃度為0.01%時，對單增李斯特菌和蠟樣芽孢桿菌的抑菌率接近百分之百，但對大腸桿菌O157：H7的抑菌效果較差，當Nisin達最高濃度為0.1%時，大腸桿菌O157：H7的抑菌率只有61.12%，這結(jié)果也說明了即使Nisin對G-菌的抑制效果不理想，隨著濃度的增加Nisin對G-菌的抑制效果將緩慢提高。潘麗軍[10]等在研究Nisin對G-菌抑制效果的實驗中得出其最小抑菌濃度為5 mg/mL（0.5%），由此可見，只有高濃度的Nisin才能夠有效抑制G-菌的生長。

雖然苯甲酸鈉的抑菌效果僅次于Nisin，但當其濃度達到最高使用量0.1%時，對單增李斯特菌、大腸桿菌O157：H7和蠟樣芽孢桿菌的抑菌率只有66.15%、54.41%和45.19%，并不能很好地抑制細菌生長。在2.1.4也討論了苯甲酸鈉的最低抑制濃度已超過國家規(guī)定的食品添加劑最大使用量，雖然不同食品中抑菌因素是多方面的綜合效果，但是基于純培養(yǎng)體系的實驗結(jié)果，不建議單獨使用苯甲酸鈉作為食品防腐劑應(yīng)用到食品當中。

納他霉素是一種對真菌具有顯著抑制效果的多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，目前大多數(shù)對納他霉素的文獻報道都集中在抗真菌以及酵母菌方面，幾乎沒有關(guān)于納他霉素對細菌抑制作用的報道。因此，本文將納他霉素列為其中一種生物型防腐劑，探究納他霉素對食源性致病菌的抑菌作用。從2.1.2的試驗結(jié)果可得，低濃度的納他霉素對致病菌幾乎沒有抑制作用，但當濃度提高到0.1%時，納他霉素開始表現(xiàn)出抑制作用。有文獻報道，納他霉素通過與細胞膜中甾醇結(jié)合形成一種復(fù)合物，該復(fù)合物能夠改變細胞質(zhì)膜的性質(zhì)，從而破壞其滲透性及通透性，并達到抑菌效果[14]。由于細菌細胞膜內(nèi)無甾醇，分析本實驗中納他霉素對致病菌表現(xiàn)出的抑制效果可能是因為高濃度的納他霉素改變了適合致病菌生長繁殖的環(huán)境條件或者改變了膜內(nèi)外滲透壓，從而抑制住了一部分致病菌的生長，具體的抑制機理有待進一步的研究。

4 結(jié)論與展望

試驗結(jié)果表明，4種防腐劑中Nisin對致病菌的抑菌效果最好，其中對單增李斯特菌和蠟樣芽孢桿菌的最小抑制濃度為0.01%，但無法得到對大腸桿菌O157：H7的最小抑制濃度，達最高濃度0.1%時的抑菌率只有61.12%；在濃度范圍0.01%～0.05%，納他霉素和植酸對致病菌的抑制效果并不理想，其中納他霉素基本對致病菌無抑制作用，當兩者濃度提高到0.1%時，對致病菌的抑制作用有明顯的提升；苯甲酸鈉的抑菌效果僅次于Nisin，但無法在實驗范圍內(nèi)得出對3種致病菌的最小抑菌濃度。綜合上述結(jié)論，納他霉素、植酸和苯甲酸鈉在單獨使用的情況下無法達到抑制細菌生長的目的，因此下一步工作可將其復(fù)配并應(yīng)用于真實食品樣品中進行驗證。

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