肖艷紅，周曉慧，徐 倩，王 冉，趙春穎

（承德醫(yī)學(xué)院，河北承德 067000）

真菌多糖具有多種生理活性，如抗腫瘤、抗氧化、提高免疫力等[1-3]。從真菌中提取并篩選有活性的多糖一直是國(guó)內(nèi)外眾多領(lǐng)域研究和開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)。牛肝菌[4]俗稱(chēng)“大腳菇”，是一種稀有、名貴的野生食用真菌。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，牛肝菌多糖的提取方法較多。王浩華等[5]發(fā)現(xiàn)，微波法比水提醇沉法和超聲波法的提取率高，但工業(yè)生產(chǎn)上考慮綠色環(huán)保，不宜采用長(zhǎng)時(shí)間、高強(qiáng)度的微波；李志洲[6]采用了泡沫分離法，但工藝中需要使用表面活性劑、消泡液等，增加了原料的消耗，且需要控制空氣流速，操作難度較大；杜敏華等[7]采用傳統(tǒng)的水提醇沉法，但并未全面考察各種因素對(duì)提取工藝的影響，多糖提取率較低。水提醇沉法為提取真菌多糖最經(jīng)典的方法，具有工藝簡(jiǎn)單、成本低、易于推廣等特點(diǎn)。為此，本研究使用了水提醇沉法，并采用正交試驗(yàn)法優(yōu)化了牛肝菌多糖的提取工藝，以期為進(jìn)一步地開(kāi)發(fā)利用牛肝菌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與儀器

牛肝菌，購(gòu)于承德潤(rùn)隆食品有限公司（批號(hào)20120906003）。所用試劑均為分析純。電熱恒溫水浴鍋（WSZ-133-65，上海東星建材實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（RE-52AA，上海亞榮生化儀器廠(chǎng)）；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵（石家莊陽(yáng)星儀器貿(mào)易有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 牛肝菌多糖的提取流程[8]稱(chēng)量牛肝菌粉末15.0g，加300ml石油醚于70℃水浴鍋中脫脂1.5h后抽濾。脫脂后的牛肝菌以不同的料水比于100℃水浴鍋中加熱不同時(shí)間，4000r/min離心10min。取沉淀重復(fù)加水、加熱、離心三個(gè)步驟，進(jìn)行不同的次數(shù)。多次所得的上清液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮，濃縮比為5：1，向濃縮液中加入無(wú)水乙醇至不同的乙醇濃度。低溫靜置過(guò)夜后4000r/min離心10min，將上層酒精萃取液再次用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮、醇沉，4000r/min離心10min。收集兩次所得沉淀，即得牛肝菌多糖。牛肝菌多糖-40℃低溫冷凍48h干燥，稱(chēng)量?jī)龈筛?，并?jì)算多糖提取率。多糖提取率=（凍干膏質(zhì)量/牛肝菌粉末質(zhì)量）×100%。

2.2 牛肝菌多糖提取的單因素實(shí)驗(yàn) 選用料水比、提取時(shí)間、提取次數(shù)和醇沉濃度4個(gè)因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，考察各因素變量對(duì)牛肝菌多糖提取率的影響，選出適宜的條件范圍。

2.2.1 料水比：多糖提取率隨料水比的增加逐漸增加，考慮濃縮過(guò)程的成本，初步確定料水比為1：20～1：30(g/ml)。見(jiàn)圖1：

圖1 料水比對(duì)多糖提取率的影響

2.2.2 提取時(shí)間：多糖提取率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，但提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)增加能源消耗，故初步確定提取時(shí)間為1.0～2.0h。見(jiàn)圖2：

圖2 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

2.2.3 提取次數(shù)：隨著提取次數(shù)的增加，多糖提取率逐漸上升。提取4次時(shí)最高峰值最高，因此確定提取2～4次進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。見(jiàn)圖3：

圖3 提取次數(shù)對(duì)多糖提取率的影響

2.2.4 醇沉濃度：多糖提取率隨乙醇濃度的增大而增加，但乙醇濃度為85%時(shí)提取率下降，因此確定乙醇濃度為70%～80%。見(jiàn)圖4：

圖4 乙醇濃度對(duì)多糖提取率的影響

2.3 牛肝菌多糖提取的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以多糖提取率和多糖含量為考察指標(biāo)，對(duì)料水比、提取時(shí)間、提取次數(shù)和醇沉濃度4個(gè)因素進(jìn)行L9(34）正交優(yōu)化。因素水平見(jiàn)表1：

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

2.4 牛肝菌多糖含量的測(cè)定 稱(chēng)量?jī)龈筛嗖⒓铀芙?，結(jié)合葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算凍干膏中牛肝菌多糖含量。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作采用苯酚-硫酸法[9]。多糖含量=（多糖質(zhì)量/凍干膏質(zhì)量）×100%。

正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。影響多糖提取效果的因素順序?yàn)樘崛r(shí)間＞乙醇濃度＞料水比＞提取次數(shù)，其中提取時(shí)間對(duì)多糖提取效果的影響最顯著。確定最佳提取工藝為：A1B1C2D3，即料水比為1：20(g/ml)，提取2次，每次1.5h，乙醇濃度為80%。

表2 牛肝菌多糖提取正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析表

2.5 最佳提取工藝驗(yàn)證 稱(chēng)取牛肝菌粉末15.0g，共3份，分別按照最佳提取工藝進(jìn)行平行驗(yàn)證試驗(yàn)。牛肝菌中多糖平均提取率為29.56%，干膏中多糖的平均含量為53.83%，菌體中多糖的平均含量為15.91%。表明本文中的最佳提取工藝合理，穩(wěn)定可行，能有效提取牛肝菌中的多糖。結(jié)果見(jiàn)表4：

表4 優(yōu)選工藝的驗(yàn)證試驗(yàn)

3 討論

本研究在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，提取時(shí)間和次數(shù)達(dá)到最大時(shí)多糖已提取完全，繼續(xù)提取只會(huì)增加干膏中多糖以外其它成分的含量，因此隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)和提取次數(shù)的增加，干膏中多糖含量與多糖提取率并不成正比。本研究通過(guò)正交試驗(yàn)，以多糖提取率和干膏中多糖含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選出了牛肝菌多糖的最佳提取工藝，即料水比1：20(g/ml)、提取2次、每次1.5h、醇沉?xí)r乙醇濃度為80%。此時(shí)牛肝菌多糖提取率為29.56%，干膏中多糖含量高達(dá)53.83%，菌體中多糖含量為15.91%。

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