韓東英，李詩(shī)剛，宋桂龍，濮陽(yáng)雪華，李殷睿智(.北京林業(yè)大學(xué)草坪研究所，北京 00083； .深圳市鐵漢生態(tài)環(huán)境股份有限公司，廣州 深圳 58040)

砷(As)是一種非植物生長(zhǎng)發(fā)育必需的類金屬元素[1]，其水溶性陰離子能通過(guò)液體吸收進(jìn)入植物體破壞細(xì)胞[2]。砷元素的氫化物、氧化物等多數(shù)都會(huì)對(duì)人類、家畜、禽類產(chǎn)生很強(qiáng)毒性,可能導(dǎo)致畸形、突變和腫瘤等不良的惡性后果[3]，目前土壤中的砷污染已成為備受關(guān)注的嚴(yán)重問(wèn)題[4]。土壤中砷含量決定了它對(duì)植物產(chǎn)生的毒害，通常土壤中較低濃度的砷含量對(duì)植物生長(zhǎng)有刺激作用，高濃度則對(duì)植物生長(zhǎng)有抑制作用。高濃度砷對(duì)植物的毒害表現(xiàn)為:光合作用受到抑制，影響細(xì)胞生長(zhǎng)，傷害根系和抑制根系活性[5]，Rossman[6]認(rèn)為這可能是由于高濃度砷妨礙了光合磷酸化和ATP的合成。當(dāng)砷進(jìn)入植物體后，植物會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧簇(ROS)，如O2-·、H2O2及HO·、·OH等[7]，為維護(hù)植物正常的生理代謝，抗氧化系統(tǒng)、酶系統(tǒng)會(huì)發(fā)生適應(yīng)性變化消除過(guò)多的ROS，如產(chǎn)生超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPX)、谷胱甘肽還原酶(GR)等抗氧化酶[8]，以便維持自由基代謝的動(dòng)態(tài)平衡，從而降低細(xì)胞的損害程度，也提高了植物的耐受性[9]。

重金屬污染土壤修復(fù)治理已是生態(tài)環(huán)境建設(shè)的重要方面，植物修復(fù)技術(shù)成本低且環(huán)保日益受到關(guān)注[10]，部分草本植物抗性強(qiáng)、生物量大，且具有巨大生態(tài)價(jià)值[11]，是發(fā)展植物綜合治理的潛在利用對(duì)象。老芒麥(Elymussibiricus)為禾本科披堿草屬多年生牧草，具有抗寒、抗旱、耐鹽堿、適應(yīng)性強(qiáng)且易栽培的優(yōu)良特性，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于栽培草地的建設(shè)和天然草地的植被恢復(fù)中[12]。香根草(Vetiveriazizanioides)具有易栽培、易管理、根系發(fā)達(dá)、適應(yīng)性強(qiáng)且生物量大的特點(diǎn)，多應(yīng)用于水土保持、恢復(fù)生態(tài)系統(tǒng)等方面[13-14]。目前，對(duì)老芒麥的研究主要集中在鹽堿脅迫、干旱脅迫等方面[15-16]；對(duì)香根草的研究集中在鉛、鋅等重金屬元素上[17-19]，關(guān)于類金屬元素砷污染土壤對(duì)老芒麥、香根草影響的研究較少。因此，本研究通過(guò)分析兩種砷脅迫下老芒麥和香根草耐性、砷吸收和積累特征以及抗氧化酶活性變化，初步評(píng)價(jià)老芒麥、香根草用于礦區(qū)砷污染土壤修復(fù)的應(yīng)用潛力及其體內(nèi)植物的抗氧化響應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)土壤取自北京林業(yè)大學(xué)草坪研究所昌平試驗(yàn)站，土壤類型黃壤土，土壤pH 7.47，質(zhì)地中壤，速效鉀含量105.306 mg·kg-1，有效磷含量30.712 mg·kg-1，全氮含量為0.806 g·kg-1，有機(jī)質(zhì)含量16.748 g·kg-1，總砷含量0.337 mg·kg-1。老芒麥、香根草種子來(lái)自北京正道種業(yè)有限公司；試驗(yàn)中的砷為亞砷酸鈉(NaAsO2)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采取完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)置1個(gè)對(duì)照(不添加砷處理)和2個(gè)砷濃度梯度[10、100 mg·kg-1(裝填混合土重，純砷計(jì))]。每個(gè)處理設(shè)4個(gè)重復(fù)，兩種植物共計(jì)24盆。

在北京林業(yè)大學(xué)草坪研究所昌平試驗(yàn)地自建溫室大棚內(nèi)進(jìn)行盆栽試驗(yàn)，選用錐形塑料花盆(高25 cm、底徑10 cm、口徑25 cm)，每盆取過(guò)篩(10 mm)風(fēng)干土2.8 kg，雞糞0.2 kg，混合均勻裝填。砷的外施采用將NaAsO2配成溶液施入，每盆澆50 mL，隨后澆自來(lái)水(無(wú)砷元素檢出)至田間持水量的60%左右，靜置兩周。

老芒麥和香根草使用草炭∶蛭石=1∶1的基質(zhì)育苗盤(pán)育苗，出苗10 d后選取長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗洗去根際培養(yǎng)基質(zhì)移栽至培養(yǎng)花盆，每盆10株，定株后培養(yǎng)60 d，培養(yǎng)時(shí)間為2016年9月1日-11月1日，期間定期定量澆水，保持水分為田間持水量的60%左右。

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.3.1細(xì)胞膜透性 稱取植物根、莖、葉樣品各0.1 g，剪成1 cm小段，置于試管中，加25 mL蒸餾水，室溫下?lián)u床上震蕩24 h，電導(dǎo)儀測(cè)電導(dǎo)率EL1。試管再次封口，牙簽扎孔通氣，沸水浴30 min后測(cè)量電導(dǎo)率EL2。同樣方法測(cè)對(duì)照，即不加葉片的蒸餾水的電導(dǎo)率EL0。

細(xì)胞膜透性=(EL1—EL0)/(EL2—EL0)。

1.3.2抗氧化酶 稱取植物根、莖、葉樣品各0.15 g，剪碎于研缽中，加適量液氮，研磨成粉末狀；加2 mL酶提取液(100 mL PBS7.0+1 g PVP+0.007 44 g EDTANa)研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移到2 mL的離心管中。4 ℃條件下15 000 r·min-1離心20 min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的2 mL離心管中，4 ℃保存，備用。

POD活性采用愈創(chuàng)木酚法，在470 nm處測(cè)定吸光度的變化值，酶活性單位為U·(mg·min)-1;CAT活性采用過(guò)氧化氫法，使用分光光度計(jì)測(cè)定240 nm處吸光度的變化值，酶活性單位為U·(mg·min)-1；APX采用H2O2法，在290 nm處測(cè)定吸光度1 min內(nèi)的變化值，酶活性單位為U·(mg·min)-1;SOD活性采用氮藍(lán)四唑(NBT)光還原法，在560 nm處測(cè)定反應(yīng)液吸光度值，酶活性單位為U·mg-1。

1.3.3株高及生物量 每盆隨機(jī)選取4株植株，將植株清洗干凈后，采用直尺直接測(cè)量株高；生物量測(cè)定采用105 ℃殺青30 min，80 ℃烘干至恒重，使用千分之一天平測(cè)定植物根、莖、葉的干重。

耐受系數(shù)=(砷處理值/對(duì)照值)×100% 。

1.3.4砷含量 將植物樣品分為莖、葉、根三部分，80 ℃烘干至恒重后，使用研磨儀進(jìn)行粉碎，過(guò)0.30 mm篩后使用千分之一天平準(zhǔn)確稱取0.500 g，采取HNO3-HClO4(4∶1)混合酸濕法消化,采用原子熒光光譜法[20]進(jìn)行砷含量測(cè)定。

砷含量=植株某部位生物量×植株相應(yīng)部位砷濃度。

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析

原始數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2013軟件整理，使用SPSS for Windows 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用Excel 2013、OriginPro 9.0制作相關(guān)圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 砷脅迫下老芒麥和香根草根莖葉生長(zhǎng)特征

在10 mg·kg-1處理下，老芒麥和香根草的株高與對(duì)照相比并沒(méi)有顯著降低；在100 mg·kg-1處理下，兩種植物的株高均顯著下降(P<0.05)，其中老芒麥的差異率57%遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于香根草的差異率11%。3種砷濃度條件下，香根草的株高均高于老芒麥(圖1)。

圖1 砷脅迫下老芒麥和香根草株高Fig. 1 Plant height of E. sibiricus and V. zizanioides

不同小寫(xiě)字母表示同種植物不同砷處理?xiàng)l件下差異顯著(P<0.05)。下圖同。

Different lowercase letters for the same plant indicate significant differences under different arsenic treatments at the 0.05 level; similarly for the following figures.

與對(duì)照相比，老芒麥葉片和根系生物量表現(xiàn)出10 mg·kg-1條件下顯著(P<0.05)促進(jìn)，100 mg·kg-1條件下顯著抑制的現(xiàn)象，莖部的生物量在10和100 mg·kg-1條件下均表現(xiàn)出顯著抑制的現(xiàn)象(表1)。香根草葉片生物量和莖生物量在10和100 mg·kg-1條件下均表現(xiàn)出下降，根系生物量在10 mg·kg-1條件下并沒(méi)有表現(xiàn)出顯著性下降且10與100 mg·kg-1條件下差異不明顯。100 mg·kg-1條件下，老芒麥葉片、莖、根系耐受系數(shù)分別為13.9%、10.2%、23.8%，香根草葉片、莖、根系耐受系數(shù)分別為73.1%、96.8%、91.7%，香根草葉、莖、根的耐受系數(shù)均高于老芒麥。

2.2 砷脅迫下老芒麥與香根草根、莖、葉砷含量變化及砷積累特征

與10 mg·kg-1相比，100 mg·kg-1條件下老芒麥葉片的砷含量沒(méi)有顯著變化(圖2)(P<0.05)；莖砷含量呈顯著升高(P<0.05)，增幅為17.2%；根砷含量也顯著增加，增幅達(dá)到315.7%。與10 mg·kg-1相比，100 mg·kg-1條件下香根草葉、莖、根的砷含量均呈現(xiàn)顯著增加(P<0.05)，增幅分別為183.4%、362.3%和1 437.63%。此外，老芒麥和香根草均表現(xiàn)出根砷含量大于葉、莖砷含量。

與10 mg·kg-1相比，100 mg·kg-1條件下，老芒麥葉、莖、根的砷積累量顯著降低(P<0.05)，香根草葉、莖、根的砷積累量顯著升高(圖3)。10 mg·kg-1條件下老芒麥地上部具有更好地移除重金屬砷的能力，其葉、莖的砷積累量分別達(dá)到151.85和37.90 μg·株-1；100 mg·kg-1條件下香根草地上部具有更好地移除重金屬砷的能力，其葉、莖的砷積累量分別達(dá)到57.83和60.90 μg·株-1。100 mg·kg-1條件下，香根草根部的砷積累量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于莖葉部位，達(dá)到了798.12 μg·株-1。

表1 砷脅迫下老芒麥和香根草不同部位生物量及耐受系數(shù)Table 1 The biomass and tolerance index of different parts of E. sibiricus and V. zizanioides under different concentrations of arsenic stress

同列不同小寫(xiě)字母表示不同砷處理間差異顯著(P<0.05)。表2同。

Different lowercase letters within the same column indicate significant differences between different arsenic treatments at the 0.05 level; similarly for the Table 2.

圖2 老芒麥和香根草不同部位砷含量Fig. 2 The arsenic content in different parts of E. sibiricus and V. zizanioides

圖3 老芒麥和香根草不同部位砷積累量Fig. 3 The arsenic accumulation in different parts of E. sibiricus and V. zizanioides

2.3 砷脅迫下老芒麥與香根草根莖葉細(xì)胞膜透性的變化

除10 mg·kg-1處理的莖外，老芒麥根、莖、葉三部位的細(xì)胞膜透性均表現(xiàn)出100 mg·kg-1處理> 10 mg·kg-1處理>對(duì)照，且相互之間呈顯著差異(P<0.05)(表2)。香根草根、葉的細(xì)胞膜透性也表現(xiàn)出100 mg·kg-1處理>10 mg·kg-1處理>對(duì)照，但莖部的差異不顯著(P>0.05)。與對(duì)照相比，10 mg·kg-1條件下香根草葉、莖、根差異率分別為38.7%、21.3%、25.5%，小于同等條件下老芒麥，也小于同等處理?xiàng)l件下老芒麥葉、莖、根的差異率447.0%、42.4%、91.4%。

2.4 砷脅迫下老芒麥與香根草根莖葉抗氧化酶系統(tǒng)響應(yīng)特征

老芒麥葉片的APX、CAT和SOD活性均表現(xiàn)出100 mg·kg-1處理>10 mg·kg-1處理>對(duì)照，且相互之間呈顯著差異(P<0.05)，但POD活性則呈現(xiàn)出對(duì)照>10 mg·kg-1處理>100 mg·kg-1處理(圖4)。香根草葉片的抗氧化酶活性與老芒麥的變化基本一致，不同點(diǎn)是其APX和SOD活性10和100 mg·kg-1處理間并沒(méi)有表現(xiàn)出顯著差異(P>0.05)。

表2 砷脅迫對(duì)老芒麥和香根草細(xì)胞膜透性的影響Table 2 Effect of arsenic stress on the cell membrane permeability of E. sibiricus and V. zizanioides

老芒麥莖、根的APX、CAT、SOD活性變化與葉片趨勢(shì)一致，也表現(xiàn)出100 mg·kg-1處理>10 mg·kg-1處理>對(duì)照(圖5、圖6)，除了老芒麥莖部CAT活性在10和100 mg·kg-1間不顯著外(P>0.05)，其余均呈顯著差異(P<0.05)。香根草莖、根的APX、CAT和SOD活性變化與老芒麥有相同的趨勢(shì)，但香根草莖部APX和CAT活性較穩(wěn)定，根、莖兩部位的SOD活性10和100 mg·kg-1間均并沒(méi)有表現(xiàn)出顯著差異。POD活性有所不同，兩種植物莖、葉的POD活性表現(xiàn)出0 mg·kg-1處理>10 mg·kg-1處理>100 mg·kg-1處理，而香根草根的POD維持在一個(gè)穩(wěn)定狀態(tài)，老芒麥根POD活性表現(xiàn)出100 mg·kg-1處理>10 mg·kg-1處理>對(duì)照。

3 討論與結(jié)論

砷對(duì)植物的影響存在濃度效應(yīng)[21]，劉全吉等[22]通過(guò)對(duì)小麥(Triticumaestivum)的研究表明，0～30 mg·L-1砷會(huì)對(duì)小麥的生長(zhǎng)產(chǎn)生輕微的抑制，當(dāng)砷濃度達(dá)到90 mg·L-1時(shí)，小麥的生長(zhǎng)受到了明顯的影響，趨于死亡。也有研究表明，茶樹(shù)的生長(zhǎng)和光合作用表現(xiàn)出低濃度砷(≤25 mg·kg-1)促進(jìn)、高濃度砷(50 mg·kg-1)明顯抑制的“低促高抑效應(yīng)”[23]。在本研究中，高濃度砷(100 mg·kg-1)對(duì)老芒麥和香根草的株高產(chǎn)生明顯的抑制效果，但在低濃度(10 mg·kg-1)條件下，兩種植物的株高并沒(méi)有明顯的變化。同樣，高濃度砷對(duì)兩種植物各部位的生物量也產(chǎn)生顯著抑制，特別是老芒麥葉片、莖、根系耐受系數(shù)僅為13.9%、10.2%、23.8%，植物趨于死亡。這與前人的研究[21]保持一致，說(shuō)明砷對(duì)植物的生長(zhǎng)產(chǎn)生了破壞，并且伴隨濃度的提升，這種破壞作用明顯增強(qiáng)。Danh等[24]在研究中發(fā)現(xiàn)香根草對(duì)砷具有極高的忍耐程度，可以達(dá)到78 mg·kg-1，而一般作物對(duì)砷的忍耐程度只有10～30 mg·kg-1。本研究發(fā)現(xiàn)，即使在高濃度(100mg·kg-1)條件下，香根草葉片、莖、根系耐受系數(shù)也能夠達(dá)到73.1%、96.8%、91.7%，可以正常生長(zhǎng)，因此香根草表現(xiàn)出對(duì)重金屬砷更好的耐性和抗性。我國(guó)砷礦資源分布廣泛，農(nóng)田、草地也面臨著嚴(yán)峻的重金屬污染的威脅[25-26]，香根草由于其優(yōu)異的耐砷性可更多地的用于廢棄礦山的植被恢復(fù)。

圖4 砷脅迫對(duì)老芒麥和香根草葉片抗氧化酶活性的影響Fig. 4 Effect of arsenic stress on leaf antioxidant enzymes of E. sibiricus and V. zizanioides

圖5 砷脅迫對(duì)老芒麥和香根草莖抗氧化酶活性的影響Fig. 5 Effect of arsenic stress on stem antioxidant enzymes of E. sibiricus and V. zizanioides

圖6 砷脅迫對(duì)老芒麥和香根草根抗氧化酶活性的影響Fig. 6 Effect of arsenic stress on root antioxidant enzymes of E. sibiricus and V. zizanioides

當(dāng)植物受到重金屬脅迫時(shí)，會(huì)通過(guò)吸收一部分重金屬并將其固定在液泡內(nèi)來(lái)減少重金屬對(duì)葉片細(xì)胞的損害，這是植物抵抗重金屬的一種機(jī)制[27-28]。在本研究中，相對(duì)于低濃度砷，高濃度砷條件下老芒麥莖葉砷含量沒(méi)有顯著升高，根系砷含量顯著升高。高濃度條件下老芒麥生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制可能是根系砷含量的增加而引發(fā)的植物生理代謝紊亂造成的，而莖葉砷含量可能在低濃度條件下就達(dá)到了植物吸收的閾值，因而并沒(méi)有發(fā)生顯著變化。香根草根、莖、葉三部位砷含量在高度濃度條件下均顯著增高且植物能夠正常生長(zhǎng)，這體現(xiàn)了香根草對(duì)砷良好的富集潛力、轉(zhuǎn)運(yùn)能力和耐受性。另外，相對(duì)于低濃度條件，高濃度條件下兩種植物根砷含量均極顯著增加(P<0.01),這可能是由于植物的根部首先接觸到重金屬土壤，然后再轉(zhuǎn)移到植物的莖葉部分，因而根系細(xì)胞會(huì)儲(chǔ)存更多的砷以保護(hù)植物[29]。由于植物的地上部比根系更容易收獲，因而植物地上部重金屬濃度以及地上收獲物的重金屬積累量通常被作為評(píng)價(jià)污染清除程度的主要指標(biāo)[30]。在本研究中，兩種植物莖葉的砷含量隨著濃度的增加而增加，生物量隨濃度的增加而下降。結(jié)果表現(xiàn)出老芒麥地上部的砷積累量隨砷濃度的增加而顯著降低，香根草地上部的砷積累量隨濃度的增加而顯著升高。高濃度(100 mg·kg-1)條件下，老芒麥地上部(莖和葉)的砷積累量為20.625 μg·株-1，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于香根草的118.737 μg·株-1，香根草具有根系發(fā)達(dá)、生物量大的特點(diǎn)[14]，廖芳芳等[31]研究發(fā)現(xiàn)，香根草植物對(duì)煤矸石山砷有富集作用。綜合而言，香根草對(duì)砷有更好的耐性、積累特征并在砷污染地的植物修復(fù)中有一定的潛力。

植物細(xì)胞膜對(duì)維持細(xì)胞的代謝起著重要作用，逆境條件下細(xì)胞膜透性體現(xiàn)了植物對(duì)于逆境的抵抗能力[32-33]。在本研究中，兩種植物各部位的細(xì)胞膜透性均表現(xiàn)出隨砷濃度增加而增加的現(xiàn)象，這是由于膜質(zhì)過(guò)氧化程度加劇，細(xì)胞膜受到了由重金屬引起的過(guò)氧化損傷[34]。在相同處理?xiàng)l件下，香根草根、莖、葉細(xì)胞膜透性的差異率均低于老芒麥，這反映了砷脅迫下香根草根、莖、葉細(xì)胞膜受到的損傷要低于老芒麥，香根草根、莖、葉細(xì)胞膜對(duì)重金屬砷有更好的適應(yīng)性和抵抗性，這也是香根草對(duì)砷有良好抗性的原因之一。植物在受到重金屬脅迫時(shí)，體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧，影響植物正常的生理代謝。SOD的作用是將超氧陰離子歧化成H2O2[35],SOD作為植物體內(nèi)活性氧清除系統(tǒng)的“第一道防線”，在抗氧化系統(tǒng)處核心地位。馬曉琳等[36]對(duì)老芒麥的研究發(fā)現(xiàn)，逆境脅迫引起了老芒麥SOD、CAT活性的增加，并且在一定范圍內(nèi)隨砷濃度的升高而顯著升高，在本研究中，老芒麥和香根草受到砷脅迫時(shí)，體內(nèi)的SOD活性升高，這與前人的研究一致，是植物體抗氧化酶系統(tǒng)受到刺激，產(chǎn)生SOD來(lái)消除砷誘發(fā)的超額活性氧[37]，其中老芒麥SOD活性在高低濃度間呈顯著差異，香根草則無(wú)顯著差異，這可能是高濃度砷(100 mg·kg-1)對(duì)老芒麥產(chǎn)生了更強(qiáng)的氧化脅迫，因而植物的抗氧化系統(tǒng)產(chǎn)生了明顯響應(yīng)，香根草則沒(méi)有這種變化。APX、CAT和POD通過(guò)進(jìn)一步將植物體內(nèi)的H2O2轉(zhuǎn)化為H2O來(lái)達(dá)到緩解過(guò)氧化損傷對(duì)植物體的危害[38]。本研究中，砷脅迫引起了兩種植物各部位APX、CAT活性的增加，但POD活性有所不同，表現(xiàn)為砷脅迫引起兩種植物莖、葉部位PO活性降低，老芒麥根系POD活性增加，香根草根系POD活性不變。POD與APX、CAT活性變化不一致，可能與植物莖葉的過(guò)氧化物轉(zhuǎn)化與過(guò)氧化氫直接消除之間的相互作用有關(guān)[39]，具體的機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

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