何 建

2010年全國第五次結(jié)核病流行病學抽樣調(diào)查報告顯示我國肺結(jié)核患者的耐藥情況較嚴重。與2000年調(diào)查結(jié)果相比，異煙肼（isoniazid, INH）的耐藥率增加了11.0個百分點，利福平（rifampin,RFP）的耐藥率減少了7.7個百分點，對結(jié)核分枝桿菌分離菌株的總耐多藥率為6.8%，雖然下降了3.9個百分點，但仍高于全球的平均水平[1]。如此高的耐藥率突顯耐多藥防控的必要性、緊迫性。耐藥結(jié)核病的控制包括患者發(fā)現(xiàn)、治療、管理等各過程。其中耐藥結(jié)核病患者的發(fā)現(xiàn)是控制耐藥結(jié)核病的第一環(huán)節(jié)。既往檢測耐多藥的經(jīng)典藥物敏感試驗為比例法或絕對濃度法，但檢測時間過長。WHO現(xiàn)推薦采用快速耐藥結(jié)核病診斷技術(shù)以利于該類患者的早期發(fā)現(xiàn)。宜昌市第三人民醫(yī)院自2014年5月起采用DNA微陣列芯片法進行結(jié)核病的INH、RFP耐藥快速檢測，并與傳統(tǒng)藥物敏感試驗作比較，以了解該方法對耐藥結(jié)核菌檢測的應用價值。

1 材料與方法

1.1 標本來源 收集本院2014年5月1日—2015年5月31日結(jié)核分枝桿菌痰涂片陽性或痰結(jié)核培養(yǎng)陽性標本。其中痰涂片陽性標本125份，痰培養(yǎng)陽性標本40份。

1.2 痰菌檢查 采用萋爾-尼爾遜（ziehl-neelsen,Z-N）抗酸染色法進行痰涂片檢查。

1.3 痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)及藥物敏感試驗 結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)采用改良羅氏培養(yǎng)基，采用對硝基苯甲酸生長實驗進行初步菌種鑒定，對鑒定為結(jié)核分枝桿菌的菌株采用絕對濃度法進行分枝桿菌藥物敏感試驗。試驗方法依據(jù)中國防癆協(xié)會2006版《結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》[2]進行。

1.4 DNA微陣列芯片法檢測 DNA微陣列芯片法采用北京博奧生物有限公司藥物敏感檢測試劑盒進行檢測，操作嚴格按照說明書進行。

1.4.1 核酸提取 向核酸提取管中加入80 μl核酸提取液，加入用無菌接種環(huán)挑取的培養(yǎng)陽性的1個菌落或涂片陽性的痰液，使用Extractor 36核酸快速提取儀震蕩5 min，90 ℃水浴5 min，5000 rpm離心1 min，所提取核酸于-20 ℃暫存。

1.4.2 PCR擴增 每個樣品設3個復孔進行擴增反應。分別取PCR擴增試劑1、2、3 各18 μl均加入 200 μl離心管中（3管），將核酸提取管中的上清液（包含待檢樣品DNA）2 μl依次加入到3個管中，并置于PCR擴增儀中，按說明書中的熱循環(huán)程序進行PCR擴增。其中PCR擴增試劑1、2、3擴增的分別是分枝桿菌屬探針序列（擴增產(chǎn)物1），rpoB基因突變位點序列（擴增產(chǎn)物2），katG和inhA基因突變位點序列（擴增產(chǎn)物3）。PCR引物序列由中國博奧生物有限公司提供[3]。

1.4.3 芯片雜交 將雜交緩沖液加熱至50 ℃使其完全融化，混勻后各取9 μl分別裝于2管中，將PCR產(chǎn)物1、PCR產(chǎn)物2各取3 μl加入上述裝有雜交緩沖液的管中配制雜交混合物R；將PCR產(chǎn)物1、PCR產(chǎn)物3各取3 μl配制雜交混合物H；將雜交反應混合物加熱至95 ℃變性5 min，冰浴3 min。吸取13.5 μl雜交混合物加入加樣孔，微陣列1或3加入雜交混合物R，微陣列2加入雜交混合物H，蓋上雜交盒并密封放入50 ℃恒溫水浴鍋中，時間為120 min。

1.4.4 芯片洗滌及干燥 將雜交盒拆開，將芯片取出放入盛有芯片洗滌液Ⅰ的容器中，并在恒溫搖床上振蕩，速度為80～100 rpm，洗滌3 min。再用芯片洗滌液Ⅱ在恒溫搖床上振蕩，速度為80～100 rpm，洗滌3 min。然后將芯片置于離心機中進行離心，轉(zhuǎn)速為800 rpm，時間為5 min，甩干后掃描。

1.4.5 芯片掃描和結(jié)果判讀 使用微陣列芯片掃描儀（Luxscan 10K-B）和相應軟件進行信號讀取及結(jié)果判讀。

1.5 統(tǒng)計學處理 用CHISS 2004軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。在本研究中，金標準為傳統(tǒng)藥物敏感試驗，以檢測菌株表型耐藥為真陽性，以檢測菌株表型敏感為真陰性。分析DNA微陣列芯片法檢測的靈敏度、特異度及一致性。2種方法檢出率的差異性檢驗用配對四格表χ2檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 DNA微陣列芯片法檢測INH耐藥性 2種方法檢測INH耐藥結(jié)果見表1，配對χ2=0.500，P=0.480，表明2種方法檢出率具有一致性，一致率為98.8%。以傳統(tǒng)藥物敏感試驗絕對濃度法為金標準，DNA微陣列芯片法檢測INH的靈敏度為87.5%，特異度為100%。

表1 2種方法檢測INH耐藥結(jié)果（例）Table 1 Results of INH resistance by 2 methods(cases)

2.2 DNA微陣列芯片法檢測RFP耐藥性 2種方法檢測RFP耐藥結(jié)果見表2，配對χ2=0.000，P=1.000，表明2種方法檢出率具有一致性，一致率為99.4%。以傳統(tǒng)藥物敏感試驗絕對濃度法為金標準，DNA微陣列芯片法檢測RFP的靈敏度為83.3%，特異度為100%。

表2 2種方法檢測RFP耐藥結(jié)果（例）Table 2 Results of RFP resistance by 2 methods(cases)

2.3 DNA微陣列芯片法檢測耐多藥性 2種方法檢測耐多藥結(jié)果見表3，配對χ2=0.000，P=1.000，表明2種方法檢出率具有一致性，一致率為100%。以傳統(tǒng)藥物敏感試驗絕對濃度法為金標準，DNA微陣列芯片法檢測耐多藥的靈敏度為100%，特異度為100%。

表3 2種方法檢測耐多藥耐藥結(jié)果（例）Table 3 Results of multi drug resistance by 2 methods(cases)

3 討 論

傳統(tǒng)的藥物敏感性方法是以固體培養(yǎng)為基礎(chǔ)的絕對濃度法或比例法，但需較長時間。一般從患者就診到獲得藥物敏感結(jié)果需要2～3個月[4]。采用液體培養(yǎng)法，如MGIT960系統(tǒng)，可將藥物敏感試驗時間縮短至2～4周，但仍不能滿足臨床需要[5]。因此，快速、簡便的耐藥檢測方法一直是結(jié)核病研究的重要內(nèi)容之一，也是及時治療以保證結(jié)核病治療效果的重要前提。

目前熱門的快速檢測方法主要是分子生物學檢測方法?，F(xiàn)只有該種方法能在2 d得到耐藥檢測結(jié)果。WHO也推薦采用分子生物學技術(shù)中的線性探針和Xpert MDR/RIF技術(shù)用于耐藥結(jié)核病的檢測[6]。DNA微陣列芯片技術(shù)與線性探針相似，都是通過檢測2種抗結(jié)核一線藥物INH和RFP的3個耐藥基因katG、inhA和rpoB啟動子的野生型及不同突變型來判斷是否耐藥[7]。主要技術(shù)特點是根據(jù)這3個耐藥基因的特異性保守核酸序列，設計PCR擴增引物及相應的寡核苷酸探針，固定在芯片表面上，經(jīng)與針對性的擴增被檢測樣本的 DNA片段雜交，并通過芯片掃描儀掃描雜交后的芯片上特定位置的熒光信號，從而檢測出樣品的耐藥基因信息。該檢測方法可在6 h內(nèi)得到結(jié)果[8]。

本研究表明，DNA微陣列芯片法診斷INH耐藥的敏感度為87.5%，診斷RFP耐藥的敏感度為83.3%，診斷耐多藥的敏感度為100%，三者特異度均為100%。DNA微陣列芯片法與傳統(tǒng)藥物敏感試驗診斷INH耐藥、RFP耐藥、耐多藥的一致率為98.8%～100%。顯示了DNA微陣列芯片檢測技術(shù)具有較高的敏感度和特異度，與傳統(tǒng)藥物敏感方法相比，一致性較高。因此，具有較好的可靠性及較高的檢測效能。

本研究的不足之處是敏感的樣本較少，使檢驗效能偏低，影響檢驗結(jié)果的可信度。后續(xù)有待進一步擴大樣本量，進行檢測并比較分析以得出更為準確的結(jié)論。

在本研究中，2例INH單耐藥和1例RFP單耐藥未被DNA微陣列芯片法檢出，原因可能有以下兩方面。首先，商品化DNA微陣列芯片試劑盒受檢測探針的限制，所檢測的耐藥基因及相應位點不能覆蓋目前已知的所有耐藥基因及相應位點。例如：①結(jié)核分枝桿菌對INH的耐藥與katG、inhA、kasA、ndh、ahpC 5種基因突變或缺失有關(guān)，其中80%以上的耐INH分離株與katG和inhA基因發(fā)生突變有關(guān)[9-10]。而目前采用的結(jié)核分枝桿菌耐藥檢測試劑盒主要通過檢測INH耐藥相關(guān)基因katG 315、inhA及位點來判斷是否耐藥。因此，如果是另外3種基因位點突變引起的耐藥，可能該試劑盒無法檢出。②結(jié)核分枝桿菌對 RFP的耐藥主要與RNA聚合酶亞單位rpoB基因的突變有關(guān)，是否與RNA 聚合酶亞單位其他3 個基因rpoA、rpoC 或rpoZ 突變相關(guān)目前尚不清楚。廖小琴等[11]分析發(fā)現(xiàn)57株耐RFP結(jié)核分枝桿菌中有50株為rpoB基因突變，2株為rpoC突變。并且在rpoB 765、1001、1156位及rpoC 51位發(fā)現(xiàn)新的突變位點。而所使用的結(jié)核分枝桿菌耐藥檢測試劑盒探針檢測范圍僅為RFP耐藥相關(guān)基因rpoB的531、526、513、516、511、533位共6個位點。因此，若為探針檢測范圍之外的其他相關(guān)基因（如rpoC或rpoB）的位點突變，則該檢測試劑盒可能無法檢出。

其次，在實際檢測過程中，如果待檢標本痰菌量太少或含有雜質(zhì)，會造成核酸提取、擴增失敗。因此，研發(fā)新的能覆蓋所有已知耐INH、RFP相關(guān)基因及位點檢測的試劑盒可能是進一步提高DNA微陣列芯片法耐藥檢測技術(shù)陽性率的方法之一。

總之，本研究對DNA微陣列芯片法檢測耐藥結(jié)核菌的效果作了初步評價，發(fā)現(xiàn)該檢測方法具有較高的敏感度和特異度，與傳統(tǒng)藥物敏感試驗相比具有較好的一致率。而且該方法可靠性較好且檢測所需時間短，可以作為臨床結(jié)核病耐藥性的快速篩查方法。

[1]全國第五次結(jié)核病流行病學抽樣調(diào)查技術(shù)指導組，全國第五次結(jié)核病流行病學抽樣調(diào)查辦公室. 2010年全國第五次結(jié)核病流行病學抽樣調(diào)查報告［J］. 中國防癆雜志，2012，34(8):485-508.

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