譚湘杰，于福來(lái)，龐玉新，黃梅，陳振夏，楊全，李偉

（1.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；

2.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，海南 儋州 571737；3.海南九芝堂藥業(yè)有限公司，海南 ?？?570311）

裸花紫珠藥材為馬鞭草科植物裸花紫珠Callicarpa nudiflora Hook.et Arn.的干燥葉和帶葉的嫩枝，收載于《中華人民共和國(guó)藥典》1977年版，為海南省道地藥材。主產(chǎn)于我國(guó)海南，廣東、廣西也有分布。國(guó)外主要分布于印度、越南和馬來(lái)西亞。裸花紫珠具有止血散瘀、消炎抗菌之功效［1］。以抗炎、止血為功效制成的裸花紫珠片、裸花紫珠栓等中成藥廣泛應(yīng)用于臨床［2］。

裸花紫珠野生變家種不過(guò)十年，隨著近幾年藥材收購(gòu)量增加，海南各地也開(kāi)展了裸花紫珠種植探索，但不同產(chǎn)地、不同批次裸花紫珠藥材化學(xué)成分不穩(wěn)定。前期系列研究表明［3-8］，不同來(lái)源的裸花紫珠藥材成分含量差異較大，但關(guān)于不同產(chǎn)地和氣候區(qū)下裸花紫珠藥材品質(zhì)的比較分析報(bào)道較少。課題組前期對(duì)海南不同來(lái)源29份裸花紫珠的木犀草苷和毛蕊花糖苷含量變化進(jìn)行探索［6］，受材料來(lái)源數(shù)量限制，無(wú)法找出產(chǎn)地和氣候區(qū)下的變化規(guī)律。為此，本研究繼續(xù)收集了海南省9市（縣）75份裸花紫珠藥材，對(duì)涉及藥材品質(zhì)的7種不同成分含量進(jìn)行測(cè)定，分析不同產(chǎn)地氣候條件下裸花紫珠藥材化學(xué)成分差異及變化規(guī)律，以期為裸花紫珠優(yōu)質(zhì)藥材生產(chǎn)區(qū)劃提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器與試藥

儀器為安捷倫1260系統(tǒng)（G1311C四元泵，G1316A柱溫箱，G1329B全自動(dòng)進(jìn)樣器；G1315D二極管陣列檢測(cè)器）；Agilent Chem Station工作站；色譜柱為 Aglient TC-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；Sartarius CPA225D電子分析天平；KQ-500DB型超聲儀。

對(duì)照品：咖啡酸（批號(hào)：Y17D6C7672）、連翹酯苷 B（批 號(hào)：20140120）、木 犀 草 苷 （批 號(hào)：Y23S7H21785）、毛蕊花糖苷（批號(hào)：PMO321SA14）、異毛蕊花糖苷（批號(hào)：HA0820KA29）、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷（批號(hào)：P20N6F6297）（以下簡(jiǎn)稱(chēng)芹菜素糖苷）、木犀草素（批號(hào)：YO1D6S6815）均采購(gòu)于上海源葉生物制藥公司，純度均在98%以上。水為Merck Millipore純水機(jī)制備的超純水（MingcheD24UV），乙腈為色譜純（安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰荆?，其余試劑均為分析純?/p>

1.2 藥材樣品

裸花紫珠藥材樣品于2016年5—8月采自海南省9市（縣），共計(jì)75份。經(jīng)中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所龐玉新研究員鑒定為裸花紫珠Callicarpa nudiflora Hook.et Arn。參考車(chē)秀芬等的海南省氣候區(qū)劃結(jié)果［9］，將不同來(lái)源樣品歸為兩個(gè)氣候區(qū)，所有樣品信息見(jiàn)表1。

表1 海南裸花紫珠樣品信息表

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent-TC C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.4%磷酸（B），梯度洗脫（0～30 min，8%～16%A；30～45 min，16%～21%A；45～55 min，21% ～24%A；55～65 min，24%～35%；65～70 min，35% ～100%）；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：330 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液制備 分別精密稱(chēng)取適量咖啡酸、木犀草素對(duì)照品，置于不同的10 mL容量瓶中，加入70%甲醇水溶解定容。分別精密稱(chēng)取適量連翹酯苷B、木犀草苷、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、芹菜素糖苷對(duì)照品，置于同一10 mL容量瓶中，加入適量70%甲醇水溶解后再加入上述咖啡酸和木犀草素對(duì)照品溶液各1 mL定容。即配制成含咖啡酸0.001 64 mg·mL-1、連翹酯苷 B 0.225 mg·mL-1、木犀草苷0.062 mg·mL-1、毛蕊花糖苷2.01 mg·mL-1、異毛蕊花糖苷 0.251 mg·mL-1、芹菜素糖苷0.155 mg·mL-1、木犀草素 0.001 95 mg·mL-1的對(duì)照品母液。對(duì)照品譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 裸花紫珠樣品及混合對(duì)照品HPLC圖

2.2.2 供試品溶液的制備 稱(chēng)取1 g裸花紫珠粉末置于100 mL離心管中，加入70%甲醇水50 mL，超聲提取20 min后（功率100%），吸取上層清液使用0.22μm的微孔濾膜過(guò)濾即得。供試品溶液譜圖見(jiàn)圖1。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系的考察 取2.2.1條件下母液，分別稀釋1、2.5、5、10、50、100倍，制成相應(yīng)濃度梯度對(duì)照品溶液。在安捷倫1260系統(tǒng)下進(jìn)樣分析，并以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到相應(yīng)的回歸方程，見(jiàn)表2。

表2 咖啡酸等7種成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

2.3.2 精密度考察 吸取2.2.1條件下對(duì)照品母液，在液相色譜系統(tǒng)下平行進(jìn)樣6次，結(jié)果咖啡酸、連翹酯苷B、木犀草苷、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、芹菜素糖苷、木犀草素各峰面積RSD值分別為0.52%、 0.73%、 0.64%、 2.7%、 0.57%、0.62%，保留時(shí)間 RSD值分別為 0.116%、0.090%、0.068%、0.071%、0.074%、0.058%、0.023%，表明該儀器精密性良好。

2.3.3 重復(fù)性考察 平行稱(chēng)取裸花紫珠樣品粉末6份，每份1 g，置于6個(gè)100 mL離心管中。在6個(gè)離心管中分別加入70%甲醇水50 mL，超聲提取20 min后，使用0.22μm微孔濾膜進(jìn)行過(guò)濾，作為樣品待測(cè)。在液相系統(tǒng)下進(jìn)樣后，結(jié)果咖啡酸、連翹酯苷B、木犀草苷、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、芹菜素糖苷、木犀草素各峰面積RSD值分別為1.61%、1.46%、1.78%、1.77%、2.45%、2.23%、2.11%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性考察 稱(chēng)取裸花紫珠樣品1 g，置于100 mL離心管中，加入70%甲醇水50 mL，超聲20 min后，經(jīng)0.22μm的微孔濾膜過(guò)濾后，分別放置0、2、4、8、12、24 h后使用液相系統(tǒng)測(cè)量該供試品溶液。結(jié)果咖啡酸、連翹酯苷B、木犀草苷、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、芹菜素糖苷、木犀草素各峰面積 RSD值分別為 2.00%、1.96%、1.43%、2.02%、1.78%、1.56%、2.25%，表明常溫下，供試品溶液在24 h內(nèi)各成分穩(wěn)定。

2.3.5 回收率考察 平行稱(chēng)取已知含量的裸花紫珠粉末6份，每份0.5 g，置于100 mL離心管中，加入50 mL配置標(biāo)準(zhǔn)品溶液（各成分含量與裸花紫珠粉末中成分含量相等）。超聲20 min后，經(jīng)0.22μm的微孔濾膜過(guò)濾后待測(cè)。結(jié)果咖啡酸、連翹酯苷B、木犀草苷、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、芹菜素糖苷、木犀草素各成分平均回收率為95.9%（RSD＝1.72%）、96.0% （RSD＝2.38%）、104.0% （RSD ＝2.85%）、105.6% （RSD＝0.98%）、97.8% （RSD ＝2.10%）、98.8%（RSD＝2.50%）、96.5%（RSD＝3.00%）。

3 結(jié)果與分析

3.1 裸花紫珠藥材7種成分統(tǒng)計(jì)量分析

75份裸花紫珠藥材7種成分含量基本統(tǒng)計(jì)量見(jiàn)表3。所有7種成分平均含量范圍在0.168～19.128 mg·g-1，其中毛蕊花糖苷含量最高，異毛蕊花糖苷、連翹酯苷B、木犀草苷次之，芹菜素糖苷、木犀草素、咖啡酸含量較低；除木犀草素外，其他6種成分變異系數(shù)均在50%以上，其中連翹酯苷B達(dá)到83.91%。這說(shuō)明不同來(lái)源裸花紫珠藥材主要化學(xué)成分存在較大的差異。

表3 裸花紫珠藥材中7種成分含量基本統(tǒng)計(jì)量（n＝75）mg·g-1

3.2 不同產(chǎn)地和氣候區(qū)裸花紫珠藥材7種成分含量比較

從表4可以看出，不同產(chǎn)地間裸花紫珠藥材7種成分均存在不同程度的差異。其中五指山和白沙兩地的毛蕊花糖苷含量最高，與海口的樣品具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），7種成分含量總和與毛蕊花糖苷變化規(guī)律相似；除五指山和白沙外，東方樣品也與其他產(chǎn)地具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。在木犀草苷含量方面，瓊中、五指山、東方與定安、海口、臨高具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。在連翹酯苷B含量上，五指山、樂(lè)東與定安、?？诰哂薪y(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。在異毛蕊花糖苷含量上，東方與定安、海口、臨高具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）?？Х人崤c木犀草苷類(lèi)似，五指山、樂(lè)東、東方與定安、?？?、臨高具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。在芹菜素糖苷含量上，瓊中、樂(lè)東與定安、?？?、臨高具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。在木犀草素含量上，瓊中、五指山、樂(lè)東與?？凇⒍ò簿哂薪y(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

表4 海南不同產(chǎn)地裸花紫珠主要化學(xué)成分含量方差分析mg·g-1

從以上分析可看出，整體含量上差異可較明顯分為兩大類(lèi)，以五指山、白沙為代表的海南中南部和以?？?、臨高為代表的海南北部。這種劃區(qū)恰好與車(chē)秀芬等對(duì)海南島氣候區(qū)劃結(jié)果相似，即定安、屯昌、?？诤团R高劃為北部邊緣熱帶濕潤(rùn)區(qū)（ⅠATa），白沙、瓊中、五指山以及樂(lè)東、東方部分地區(qū)劃為中部山地邊緣熱帶濕潤(rùn)區(qū)（ⅠATb）。進(jìn)一步對(duì)兩個(gè)區(qū)域7種成分含量比較，發(fā)現(xiàn)均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

3.3 不同產(chǎn)地和氣候區(qū)裸花紫珠藥材7種成分含量主成分分析

為了更清晰地看出成分含量不同氣候區(qū)間的差異，本研究采用主成分分析，將7種化學(xué)成分提取了兩類(lèi)主成分，共解釋了81.10%的總方差。從圖2A上可看到兩個(gè)氣候區(qū)的樣品基本上聚成兩大類(lèi)，而9個(gè)不同產(chǎn)地間樣品很難區(qū)分開(kāi)（見(jiàn)圖2B），同時(shí)不同產(chǎn)地內(nèi)部也存在一定的變化。這說(shuō)明本研究?jī)H從產(chǎn)地上不能很好解釋裸花紫珠藥材成分內(nèi)在變化規(guī)律。

圖2 不同氣候區(qū)和不同產(chǎn)地裸花紫珠化學(xué)成分主成分圖

4 討論

4.1 裸花紫珠藥材質(zhì)量控制指標(biāo)的選擇

以往關(guān)于裸花紫珠藥材質(zhì)控指標(biāo)通常選擇毛蕊花糖苷和黃酮類(lèi)其中一到多個(gè)成分或指紋圖譜［4-8］作為裸花紫珠藥材質(zhì)量控制依據(jù)，在成分上同屬類(lèi)藥材［10-13］也常以這些成分作為質(zhì)量控制指標(biāo)。雖然對(duì)其藥材質(zhì)量控制具有指導(dǎo)意義，但在指標(biāo)選取上仍缺乏系統(tǒng)性。本研究借鑒劉昌孝等［14］提出的中藥質(zhì)量標(biāo)志物（Q-marker）概念，在系統(tǒng)分析裸花紫珠近200種成分基礎(chǔ)上，篩選被定量過(guò)的、具有抗炎、止血的成分以及種屬特異性的成分作為質(zhì)控指標(biāo)，共篩選了7種主要成分，包括3種黃酮（木犀草苷、木犀草素、芹菜素糖苷）、3種酚苷（連翹酯苷B、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷）、1種酚酸（咖啡酸）。并建立了同時(shí)測(cè)定7種成分的HPLC方法，該方法簡(jiǎn)便可行，重復(fù)性好，可用于裸花紫珠的質(zhì)量控制。

4.2 裸花紫珠藥材成分含量差異及影響因素探討

關(guān)于裸花紫珠化學(xué)成分定性定量分析報(bào)道較多［3-8］，但有關(guān)不同產(chǎn)地、不同氣候區(qū)裸花紫珠主要成分變化規(guī)律的研究不足。課題組前期對(duì)海南產(chǎn)的29份裸花紫珠中毛蕊花糖苷和木犀草苷含量進(jìn)行過(guò)分析，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地間兩種成分變化較大［6］。本研究繼續(xù)擴(kuò)大樣本量，選取海南裸花紫珠主要分布區(qū)，發(fā)現(xiàn)裸花紫珠藥材化學(xué)成分在不同氣候區(qū)具有顯著的差異，說(shuō)明環(huán)境因子對(duì)裸花紫珠藥材化學(xué)成分具有較大的影響。但這種差異具體到產(chǎn)地上就得到弱化。分析原因，一方面部分產(chǎn)地在環(huán)境因子上比較相似，使得總體上產(chǎn)地間這種差異不大。另一方面可能產(chǎn)地內(nèi)部樣品的差異過(guò)大導(dǎo)致產(chǎn)地間的差異不顯著。因在樣品收集過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，部分產(chǎn)地（如定安縣的龍河鎮(zhèn)和翰林鎮(zhèn)）即便是同一市（縣）不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)之間，土壤差異都很大，同時(shí)這些樣品株齡也不盡相同，致使同一鄉(xiāng)鎮(zhèn)某些樣品內(nèi)部化學(xué)成分含量出現(xiàn)較大波動(dòng)。因此，今后應(yīng)繼續(xù)對(duì)不同樣品對(duì)應(yīng)的土壤進(jìn)行分析，尋找影響這些樣品化學(xué)成分差異可能的土壤因子，以期為優(yōu)質(zhì)裸花紫珠藥材生產(chǎn)的區(qū)劃提供依據(jù)。

［1］ 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物資源開(kāi)發(fā)研究所，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，北京醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，等.中藥志：第五冊(cè)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1994：147.

［2］ 劉小芬，李順祥.裸花紫珠研究進(jìn)展［J］.中南藥學(xué)，2015，13（4）：396-402.

［3］ Tu Y H，Sun LN，Guo M L，et al.Themedicinal uses of Callicarpa L.in traditional Chinese medicine：An ethnopharmacological，phytochemical and pharmacological review［J］.J Ethnopharmacol，2013（146）：465-481.

［4］ 邵軍，陳偉康，馬雙成，等.UPLC法同時(shí)測(cè)定裸花紫珠中5種類(lèi)黃酮類(lèi) 成分 ［J］.中草藥，2014，45（10）：1473-1476.

［5］ 董琳，關(guān)薇薇，盛琳，等.HPLC同時(shí)測(cè)定裸花紫珠中4種黃酮［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014，20（3）：52-55.

［6］ 于福來(lái)，吳麗芬，龐玉新，等.海南裸花紫珠中毛蕊花糖苷和木犀草苷含量分析［J］.中國(guó)現(xiàn)代中藥，2016，18（8）：996-1000.

［7］ 鄭東昆，陳偉康，馬雙成，等.裸花紫珠指紋圖譜研究及10種成分的含量測(cè)定［J］.中國(guó)中藥雜志，2015，40（9）：1776-1782.

［8］ 劉幼嫻，谷陟欣，盧鳳來(lái)，等.不同采收期裸花紫珠的HPLC指紋圖譜研究［J］.廣西植物，2014，34（2）：174-178.

［9］ 車(chē)秀芬，張京紅，黃海靜，等.海南島氣候區(qū)劃研究［J］.熱帶作物學(xué)報(bào)，2014，34（6）：60-65.

［10］高微，劉布鳴，陳明生，等.尖尾楓中毛蕊花糖苷的分離鑒定及含量測(cè)定［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014，20（21）：60-62.

［11］任風(fēng)芝，欒新慧，趙毅民，等.紫珠葉黃酮類(lèi)化合物的研究［J］.中國(guó)中藥雜志，2001，26（12）：841-844.

［12］蔡灝，吳翠萍，孫秀漫，等.5種紫珠屬藥材中總酚、總黃酮與其抗氧化活性的相關(guān)性研究［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19（20）：55-60.

［13］寧德生，李典鵬，黃勝，等.七種紫珠屬植物水提物中總黃酮、總酚酸及其抗氧化活性的測(cè)定［J］.廣西植物，2012，32（6）：845-848.

［14］劉昌孝，陳士林，肖小河，等.中藥質(zhì)量標(biāo)志物（Q-Marker）：中藥產(chǎn)品質(zhì)量控制的新概念［J］.中草藥，2016，47（9）：1443-1457.