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唐古特白刺葉化學(xué)成分及其抗炎活性研究

2018-03-21 06:13:40敖亮李靜劉宇宏
中國(guó)現(xiàn)代中藥 2018年2期
關(guān)鍵詞:唐古特白刺抗炎

敖亮,李靜,劉宇宏

(延安大學(xué)附屬醫(yī)院風(fēng)濕科,陜西 延安 716000)

唐古特白刺 Nitraria tangutorum Bobr.是蒺藜科(Zygophyllceae)白刺屬(Nitraria L.)的一種落葉灌木,主要分布于亞洲、歐洲、非洲及澳洲[1],作為防風(fēng)固沙的優(yōu)勢(shì)灌木,在生態(tài)環(huán)境保護(hù)中具有重要的作用。在我國(guó),白刺屬植物主要分布于青海、新疆、甘肅、寧夏、內(nèi)蒙古等地,資源十分豐富,尤其在青海省柴達(dá)木盆地分布最廣[2]。民間用于治療脾胃虛弱、消化不良、神經(jīng)衰弱、感冒等癥。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),白刺葉具有調(diào)節(jié)血糖、血脂、血壓、改善免疫、抗疲勞等保健功能[3-4]。目前對(duì)唐古特白刺葉的化學(xué)成分研究發(fā)現(xiàn),黃酮和生物堿類(lèi)化合物是唐古特白刺葉的主要化學(xué)成分[5]。本實(shí)驗(yàn)從唐古特白刺葉中分離得到10個(gè)化合物,分別鑒定為3,3′,4′-三-O-甲基鞣花酸(1)、苜蓿素-7-O-β-D-葡萄糖苷(2)、鄰苯二甲酸二丁酯(3)、鼠李秦素(4)、異楊梅二醇(5)、三春水柏枝素 A(6)、(3S,5R,6S,7E)-3,5,6-三羥基-7-香波龍大柱烯-9-酮(7)、1,2,3,4-四氫-1,3,4-三氧代-β-咔啉(8)、3-羥基-β-咔啉(9)、β-咔啉-1-羧酸(10)。化合物 1~10均為從該屬植物中首次分離得到。對(duì)化合物5~10進(jìn)行了抗炎活性評(píng)估,發(fā)現(xiàn)咔啉生物堿對(duì)脂多糖(LPS)刺激的巨噬細(xì)胞炎癥因子生成均呈現(xiàn)較強(qiáng)的抑制作用,化合物8、9和10活性最高。對(duì)活性成分的IC50進(jìn)行了計(jì)算,為進(jìn)一步研究其抗炎作用機(jī)制以及進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用唐古特白刺提供依據(jù)。

1 儀器和材料

600MHz核磁共振波譜儀(TMS為內(nèi)標(biāo),Varian公司);Agilent 1260高效液相色譜儀(Agilent公司);半制備液相色譜儀(江蘇漢邦科技有限公司);C18HCE半制備色譜柱(250 mm×20 mm,北京華普新創(chuàng)科技有限公司);柱色譜硅膠(100~200目),薄層硅膠板(青島海洋化工廠);色譜級(jí)甲醇,其他試劑均為分析級(jí)(山東禹王化工廠)。

唐古特白刺葉于2015年7月采摘于柴達(dá)木盆地,由中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所盧學(xué)峰研究員鑒定為唐古特白刺N(yùn)itraria tangutorum Bobr.的葉。

2 方法

2.1 提取與分離

唐古特白刺葉5 kg,陰干后粉碎并且過(guò)篩,用95%的乙醇水加熱回流提取3次,每次2 h,料液比1∶8,合并提取液,過(guò)濾,濃縮,得浸膏200.0 g。浸膏用水(1 L)混懸,然后分別用等體積(1.0 L)的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行液液萃取3次,將乙酸乙酯部位的萃取液濃縮,得到浸膏47.0 g(E),取E 40.0 g,用硅膠拌樣進(jìn)行硅膠柱色譜分離,以三氯甲烷-甲醇-水(9∶1∶0.1→7∶3∶0.1)為洗脫系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫,得到7個(gè)組分Fr.1~7。Fr.3(5.6 g)以三氯甲烷-甲醇-水(9∶1∶0.1)等度洗脫,得到 5個(gè)組分Fr.3A~3E。其中Fr.3B(126.0mg)經(jīng)過(guò)半制備色譜進(jìn)行分離,用乙腈-水(12%~23%,梯度洗脫50 min)進(jìn)行梯度洗脫得到5個(gè)組分,經(jīng)半制備液相反復(fù)純化得到化合物 1(2.1 mg),4(1.3 mg)、8(2.3mg)、9(1.9mg)、10(2.6 mg)。Fr.3C(95.4 mg)經(jīng)過(guò)半制備色譜進(jìn)行分離,用乙腈-水(5%~19%,梯度洗脫55 min)進(jìn)行梯度洗脫得到5個(gè)組分,經(jīng)半制備液相反復(fù)純化得到化合物2(1.7 mg)、3(2.2 mg)、5(2.1 mg)、6(1.8 mg)、7(2.9 mg)。

2.2 抗炎活性研究

2.2.1 供試品配制 取化合物5~10分別用DMSO配制成20 mg·mL-1儲(chǔ)存液,加藥時(shí)用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基分別稀釋成1、3、5、10、15、25μg·mL-1(所選化合物濃度均未對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用)的待測(cè)試樣品溶液。

2.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) RAW264.7細(xì)胞用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),置于5%CO2、37℃、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行傳代,2~3 d傳代1次。取3代后的細(xì)胞用于接下來(lái)的炎癥因子抑制實(shí)驗(yàn)研究。

2.2.3 炎癥因子檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞用0.25%胰酶消化約1 min后,吸去胰酶,用含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中和胰酶作用,輕輕吹打成單細(xì)胞懸液,離心棄上清液,用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)后,調(diào)整細(xì)胞懸液至1×105個(gè)·mL-1,按每孔100μL的培養(yǎng)體積接種至96孔培養(yǎng)板,置于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)12 h,然后饑餓處理12 h后,吸去每孔上清液,每孔再加入100μL無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基配制的相應(yīng)分組培養(yǎng)液,隨機(jī)分為對(duì)照組、LPS(1μg·mL-1)組、LPS(1μg·mL-1)+化合物 5~10(1、3、5、10、15、25μg·mL-1)組,加入相應(yīng)藥物后,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,置于5%CO2、37℃、飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h后,取上清液用于腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)炎癥因子的表達(dá)情況檢測(cè),并最終計(jì)算化合物的IC50值。

3 結(jié)果

3.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1:淡黃色粉末。ESI-MS m/z:345.120 2[M+H]+。1H-NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ:7.56(1H,s),7.66(1H,s),4.03(3H,s),4.05(3H,s),4.07(3H,s);13C-NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ:111.23(C-1),140.97(C-2),140.22(C-3),152.64(C-4),111.68(C-5),112.55(C-6),158.35(C-7),111.97(C-1′),141.49(C-2′),140.85(C-3′),153.83(C-4′),107.49(C-5′),113.39(C-6′),158.54(C-7′),56.75(4′-OMe),61.33(3′-OMe),61.04(3-OMe)。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[6],故鑒定化合物 1為 3,3′,4′-三-O-甲基鞣花酸。

化合物2:黃色粉末。ESI-MS m/z:493.140 3[M+H]+。1H-NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ:12.98(1H,s,5-OH),9.43(1H,s,4′-OH),6.47(1H,d,J=1.9 Hz,H-6),6.96(1H,d,J=1.9 Hz,H-8);13C-NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ:182.5(C-4),164.6(C-2),163.4(C-7),161.5(C-5),157.3(C-9),148.7(C-3′,5′),140.5(C-4′),120.7(C-1′),105.8(C-10),104.9(C-2′,6′),104.5(C-3),99.9(C-6),95.7(C-8),100.5(C-1″),77.7(C-5″),73.6(C-2″),76.8(C-3″),69.9(C-4″),60.9(C-6″)。結(jié)合文獻(xiàn)[7],確認(rèn)化合物2為苜蓿素-7-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物3:無(wú)色油狀液體。EI-MS m/z:287.201 4[M-H]-。1H-NMR(600 MHz,CDCl3)δ:7.72(1H,m),7.60(1H,m),4.29(2H,m),1.46(2H,m),1.72(2H,m),0.97(3H,m);13C-NMR(150 MHz,CDCl3)δ:169.2(C-7),133.5(C-1,6),129.8(C-2,5),132.2(C-3,4),66.6(C-1′,1″),31.7(C-2′,2″),20.2(C-3′,3″),14.0(C-4′,4″)。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[8],故鑒定化合物3為鄰苯二甲酸二丁酯。

化合物4:黃色針晶。ESI-MS m/z:331.310 2[M+H]+。1H-NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ:7.79(1H,d,J=2.0 Hz,H-2′),7.75(1H,dd,J=2.0,8.5 Hz,H-6′),6.97(1H,d,J=8.5 Hz,H-5′),6.77(1H,d,J=2.0 Hz,H-8),6.35(1H,d,J=2.0 Hz,H-6),3.86(3H,s,3′-OCH3),3.87(3H,s,7-OCH3);13C-NMR(150 MHz,DMSO-d6) δ: 175.9, 160.3, 164.9, 156.0, 148.9,147.4, 147.0, 136.1, 121.8, 121.8, 111.6,115.5,104.0,97.4,92.0,56.0,55.8。經(jīng)與文獻(xiàn)對(duì)照[9],化合物4鑒定為鼠李秦素。

化合物5:白色粉末。ESI-MS m/z:443.112 7[M+H]+。1H-NMR(600 MHz,CDCl3):0.55(1H,dd,J=13.4,3.7 Hz,H-18),0.85,0.87,0.89,0.91,0.94,0.94,1.05(3H each,all s,Me×7),1.0(1H,dd,J=13.4,3.7 Hz,H-19β),1.4(1H,t,J=13.4 Hz,H-19a),1.06~1.7(19H,m),1.74(1H,dd,J=15.3,3.4 Hz,H-16),1.9(1H,tm,J=15 Hz,H-2β),2.0(1H,dm,J=13 Hz,H-7β),2.08(1H,dd,J=15.3,8.2,H-16),3.28(1H each,d,J=11.1 Hz,H-2β),3.38(1H,t,J=2.7 Hz,H-3),5.47(1H,dd,J=8.2,3.4 Hz,H-15);13C-NMR(150 MHz,CDCl3):159.3,115.5,65.5, 76.2, 49.2, 48.8, 44.7, 41.2, 40.3,39.2, 38.0, 37.5, 37.3, 35.8, 33.5, 33.5,32.6, 32.2, 30.8, 29.9, 28.6, 28.2, 27.9,26.2,25.0,22.2,21.5,18.7,17.3,15.2。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[10],故鑒定化合物5為異楊梅二醇。

化合物6:白色粉末。ESI-MS m/z:619.143 2[M+H]+。1H-NMR(600 MHz,CD3COCD3)δ:7.14(1H,d,J=2.0 Hz,H-2′),6.84(1H,d,J=8.0 Hz,H-5′),7.01(1H,dd,J=8.0,2.0 Hz,H-6′),7.52(1H,d,J=16.0 Hz,H-7′),6.33(1H,d,J=16.0 Hz,H-8′),5.57(1H,dd,J=8.0,3.0 Hz,H-15),4.69(1H,t,J=2.7 Hz,H-3),1.01(3H,s,CH3),1.00(6H,s,CH3×2),0.96(3H,s,CH3),0.95(3H,s,CH3),0.92(3H,s,CH3),0.88(3H,s,CH3);13C-NMR(150 MHz,CD3COCD3)δ:178.7,166.3,160.8,147.9,145.6,144.6,127.1,121.8,115.8,115.7,116.5,114.6,77.6,50.8,50.8,49.3,41.8,41.2,39.2,38.2,36.8,35.3,33.6,37.4,33.8,33.2,31.9,31.7,30.9,29.0,28.9,27.7,25.9,22.7,22.0,21.5,18.6,17.4,15.0。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[11],故鑒定化合物6為三春水柏枝素A。

化合物7:白色無(wú)定型粉末(甲醇)。ESI-MS m/z:243.225 0[M+H]+。1H-NMR(CD3OD,600 MHz)δ:7.16(1H,d,J=15.6 Hz,H-7),6.19(1H,d,J=15.6 Hz,H-8),3.76(1H,m,H-3),2.33(1H,dd,J=14.4,5.2 Hz,H-4a),2.29(3H,s,H-10),1.67(1H,dd,J=14.4,9.2 Hz,H-4b),1.58(1H,dd,J=12.8 Hz,3.6 Hz,H-2a),1.26(1H,dd,J=12.8,10.8 Hz,H-2b),1.19(3H,s,H-12),1.18(3H,s,H-13),0.97(3H,s,H-11);13C-NMR(CD3OD,150 MHz)δ:200.5(C-9),145.7(C-7),133.9(C-8),70.9(C-6),68.8(C-5),64.5(C-3),47.7(C-2),41.5(C-4),36.3(C-1),29.9(C-12),27.7(C-10),25.5(C-11),20.3(C-13)。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[12],故鑒定化合物7為(3S,5R,6S,7E)-3,5,6-三羥基-7-香波龍大柱烯-9-酮。

化合物8:黃色粉末。ESI-MS m/z:214.321 9[M]+。1H-NMR(600 MHz,DMSO-d6):7.37(1H,ddd,J=7.7,1.3,0.9 Hz,H-6),744(1H,ddd,J=8.1,7.1,1.3 Hz,H-7),7.63(1H,ddd,J=8.1,1.1,0.9 Hz,H-8),8.36(1H,ddd,J=7.7,1.3,0.9,H-5),11.87(1H,brs,H-9),13.35(1H,brs,H-2);13C-NMR(150 MHz,DMSO-d6):113.67(C-8),115.61(C-11),121.35(C-5),123.04(C-12),123.82(C-6),126.27(C-7),135.20(C-20),137.65(C-13),157.85(C-3),159.09(C-l),170.05(C-4)。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[13],故鑒定化合物8為1,2,3,4-四氫-1,3,4-三氧代-β-咔啉。

化合物9:黃色固體。ESI-MS m/z:226.157 4[M+H]+。1H-NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ:11.93(1H,brs,1-H),7.09(1H,d,J=6.8 Hz,5-H),6.99(1H,d,J=6.8 Hz,6-H),8.03(1H,d,J=7.9 Hz,9-H),7.39(1H,td,J=7.9,1.0 Hz,10-H),7.18(1H,td,J=7.9,1.0 Hz,11-H),7.55(1H,d,J=7.9 Hz,12-H),11.39(1H,brs,3-OH)。13C-NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ:155.8,139.2,128.2, 126.3, 124.6, 124.5, 122.2, 121.4,119.6,112.6,99.8。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[14],故鑒定化合物 9為 3-羥基-β-咔啉。

化合物10:黃色粉末。ESI-MS m/z:213.108 9[M+H]+。1H-NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ:11.15(1H,s,H-9),8.45(1H,d,J=5.4,H-3),8.43(1H,d,J=5.4,H-4),8.33(1H,d,J=8.1,H-5),7.85(1H,d,J=8.1,H-8),7.63(1H,d,J=8.1,H-7),7.33(1H,d,J=8.1,H-6);13C-NMR(150 MHz,DMSO-d6,)δ:141.9(C-1),135.6(C-3),118.5(C-4),122.3(C-5),129.5(C-6),120.3(C-7),113.3(C-8),131.9(C-10),119.9(C-11),131.6(C-12),135.6(C-13),165.9(1-COOH)。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[15],故鑒定化合物10為 β-咔啉-1-羧酸。

3.2 抗炎活性

在炎癥因子抑制作用篩選結(jié)果中,化合物5~10對(duì)LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞釋放的促炎因子TNF-α和IL-6均具有不同程度的抑制作用,顯示了較好的體外抑制促炎因子的活性作用,其中化合物5、6、8和9對(duì)不同炎癥因子的抑制作用分別表現(xiàn)出最強(qiáng)的效果,結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 化合物5~10對(duì)LPS刺激RAW 264.7細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α和IL-6的影響

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